Name: 水溶性と不溶性の Huntingtin 種の解像度の分別 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 学ぶ水溶性と不溶性のHuntingtinタンパク質の分別法。マウス脳や細胞培養から変異Huntingtinを分離し、タンパク質恒常性を定量的に解析します。この手法はハンチントン病や他の神経変性疾患の研究に応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、NIH (RO1 NS090390) によって支えられました。博士ジョアン Steffanfor 技術支援とこの試金の開発の間に議論に感謝も申し上げます。

動物の倫理の声明 - 実験が実施されたケアと健康の国民の協会および制度的動物ケアおよび使用委員会 (承認された動物の研究プロトコルの実験動物の使用のためのガイドに従い、IACUC) カリフォルニア大学アーバイン校、AAALAC 認定機関。すべての努力は、動物の苦痛を最小限に抑えるために行われました。
1. 換散バッファーの準備
<ol><li>「水溶性」の換散バッファーの準備 (10 mM Tris pH 7.4 では、1 %x トリトン 100、150 mM の NaCl、10% グリセロール) と 0.22 μ m のフィルターを通して無菌フィルター。<ol>
<li>作業「可溶性」換散バッファーの N-エチルマレイミド (NEM) を測定し、100% に溶解し 100 mM phenylmethysulfonyl フッ (PMSF) で十分に溶かして江藤。 注: 換散バッファー阻害剤: (i) 20 mM N-エチルマレイミド (NEM);(ii) 0.2 mM PMSF;(iii) 1 mM バナジン ナトリウム (Na3VO4);(iv) 1 μ G/ml leupeptin;(v) 1 μ G/ml アプロチニン;(vi) 20 mM フッ化ナトリウム (NaF)。 注意: は、プロトコル全体 NEM を操作するときに、マスクを着用します。換散バッファーの作業行う必要がありますアクティブな阻害剤を確保するため新鮮です。</li>
		<li>プロテアーゼ阻害剤と水溶性の換散バッファーの次の順序で阻害剤を追加: Leupeptin、アプロチニン、バナジン ナトリウム (Na3VO4) 冷たい換散バッファーのボリュームまでフッ化ナトリウム (NaF)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>「不溶性」の換散バッファーの「水溶性」換散バッファーの 2 mL に 20% SDS の 500 μ l を追加することにより 4% SDS への補足します。室温に置いたまま。 注: SDS を沈殿が 4 ° C で保管するとき部屋の温度で、これをしてください。最終的な換散バッファー組成: 10 mM トリス (pH 7.4)。1% トリトン X-100;150 mM の NaCl;10% グリセロール;4 %sds (不溶性のみ)。</li>
</ol>2. 水溶性/不溶性分別のプロトコル
注: は、回路図の図 1を参照してください。
<ol><li>各サンプルのため管の 2 つのセットのラベル:「水溶性」と「不溶性」。</li>
	<li>組織に (1.1.1 参照) プロテアーゼ阻害剤を添加した冷たい作業可溶性換散バッファーの X μ L を追加します。 注: X = ボリュームによって異なります組織量;表 1を参照してください。</li>
	<li>マウス脳組織 (すなわち、線条体)、dounce ガラス 1 mL douncer と「不溶性」にピペットでゆっくり 30 回はチューブ (氷の上維持) をラベル付けします。 注: 気泡を形成する不完全な均質化をもたらす可能性がありますと、douncing を起動した後の液体の表面を壊さないように気をつけてください。</li>
	<li>細胞 (すなわち、hela 細胞、HEK293T)、寒さ、1x PBS で 1 回細胞をすすいでください。PBS を外し、セル換散バッファーの最小ボリュームに適用し、細胞スクレーパーと。 注: の上記のセル行細胞 6 ウェル プレート当たり 5 x 10 の5セルでメッキ, 付近の confluency に成長して.1 つはよくマウス線条体に使用されるボリュームと同等です。</li>
	<li>転送磨砕液や細胞ライセートにラベル「不溶性」チューブと氷 1 h (開始クロック最終管が処理された後) に溶解します。 注: セル lysates のカップ培養を開始する前に細胞塊を破るために数回を刻んだ。気泡の形成を避けるため。簡単に渦パルス 1 の各サンプル溶解の途中で s。</li>
	<li>20 分間 15,000 × g で 4 ° C でサンプルを遠心します。</li>
	<li>「水溶性」分数として清を回復します。<ol>
<li>ピペットを使用して削除、これは分数を汚染するとペレット/曇りの層を邪魔しないように注意してください。「水溶性」にピペットで移しなさい可溶性画分は、チューブをラベル付けします。氷の上を保ちます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>各洗浄後 5 分 15,000 × g で 4 ° C で 500 μ L の換散バッファー (x2) と遠心分離機でペレットを洗浄します。オフ戻曇り層の一部が場合、それは大丈夫です。</li>
	<li>最終的な洗浄の後組織ペレットだけを残して残りの洗浄バッファーのすべてを削除します。 注意: このポイントから、不溶性サンプルは必要があります常温保管今。</li>
	<li>X μ L 換散バッファー 4 %sds を添加したペレットを再懸濁します (ペレット サイズに応じて音量を調整することができます;テーブル 1を参照)。</li>
	<li>30 の各サンプルを超音波プローブ超音波発生装置で室温で s (125 ワット、20 kHz、パルス、振幅 40%、材料表を参照してください)。</li>
	<li>サンプル (沸騰ローリング) を煮る 30 分;簡単に遠心分離機 (15 s) 任意のサンプルを失わないよう 6,000 x g で。</li>
	<li>DC (互換性のある洗剤) 蛋白質の試金の実行 (材料の表を参照してください) または Lowry 蛋白質の試金 (細胞培養用それぞれの換散バッファーのサンプルの 1/5、1/10 組織溶解液のための開始の希釈を推奨) タンパク質の濃度を測定します。 注: タンパク質の濃度は、高濃縮のための DC またはロウリー アッセイを使用して読み取る必要があります。</li>
	<li>凍結融解の問題を避けるために 50 μ L バッチに割り切れるサンプル。 注: プロトコルを一時停止できるここでさらに生化学分析の前に-20 ° C で両方の分数を格納することによって</li>
</ol>3 西部のしみと定量化
<ol><li>実行報告として西部のしみ他1,13サンプル バッファー (ローディングの染料、削減 x 1 x 1.6) で 1:1 の 30 μ g 希釈します。 注: 分数あたり蛋白質の 30 μ g 十分、しかし最適解像度に調整することができます。3-8% トリス酢酸ポリアクリルアミドゲル不溶性画分を使用してください。4-12% ビス トリス ゲルは可溶性画分に適しています。</li>
	<li>簡単に 5 分遠心分離機のサンプル (沸騰) を沸騰 (15 s) サンプルを収集するために 6,000 x g で。</li>
	<li>減らされたサンプルの製造元のプロトコルに従って SDS-PAGE および西部のしみ、分数を分析します。 注: 不溶性画分を 0.45 μ M 硝酸セルロースの膜に転送されたとき最もよい解決します。0.45 または 0.2 μ M 硝酸セルロースは興味の蛋白質のサイズによって可溶性画分に使用できます。高分子材料の最適な移転に必要ないくつかの最適化があります。</li>
	<li>タンパク質効率の読み込みを視覚化するタンパク質全体染色 (例えばMEMcode、参照テーブルの材料) で膜を染色します。 注: 西部のしみは、平均輝度によって分析できます。可溶性画分は、実験システムに適した家は維持蛋白質の最高に正規化することができます。相対的な蛋白質量として不溶性画分は、可逆的なタンパク質染色または別のしみにヒストン 3 正規化によって確認されました。</li>
</ol>

<ol><li>Ochaba, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIAS1+Regulates+Mutant+Huntingtin+Accumulation+and+Huntington%27s+Disease-Associated+Phenotypes+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington's Disease-Associated Phenotypes In Vivo.</a> Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).</li>
<li>La Spada, A. R., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeat+expansion+disease%3A+progress+and+puzzles+in+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis.</a> Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).</li>
<li>Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+neuropathology+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Genetics and neuropathology of Huntington's disease.</a> Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).</li>
<li>The Huntington's Disease Collaborative Research Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington%27s+disease+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li>
<li>Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease%3A+the+current+state+of+research+with+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease: the current state of research with peripheral tissues.</a> Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).</li>
<li>Weydt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoregulatory+and+metabolic+defects+in+Huntington%27s+disease+transgenic+mice+implicate+PGC-1alpha+in+Huntington%27s+disease+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington's disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington's disease neurodegeneration.</a> Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).</li>
<li>Schulte, J., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+function+of+the+Huntingtin+protein+and+its+relevance+to+Huntington%27s+Disease+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Trends+Neurol%22%5BJournal%5D)">The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington's Disease pathology.</a> Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).</li>
<li>Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrantly+spliced+HTT%2C+a+new+player+in+Huntington%27s+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington's disease pathogenesis.</a> RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).</li>
<li>Neueder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenic+exon+1+HTT+protein+is+produced+by+incomplete+splicing+in+Huntington%27s+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington's disease patients.</a> Sci Rep. 7 (1), 1307(2017).</li>
<li>Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+the+first+17+amino+acids+of+huntingtin+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomol+Concepts%22%5BJournal%5D)">The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington's disease.</a> Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).</li>
<li>Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+acts+in+the+nucleus+to+induce+apoptosis+but+death+does+not+correlate+with+the+formation+of+intranuclear+inclusions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions.</a> Cell. 95 (1), 55-66 (1998).</li>
<li>Kim, S., Kim, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+Approaches+for+Inhibition+of+Protein+Aggregation+in+Huntington%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington's Disease.</a> Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).</li>
<li>O'Rourke, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-2+and+PIAS1+modulate+insoluble+mutant+huntingtin+protein+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation.</a> Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).</li>
<li>Shibata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+intracellular+accumulation+of+mutant+Huntingtin+by+Beclin+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1.</a> J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).</li>
<li>Apostol, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-based+assay+for+aggregation+inhibitors+as+therapeutics+of+polyglutamine-repeat+disease+and+validation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).</li>
<li>Wanker, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+filter+assay+for+detection+of+amyloid-like+polyglutamine-containing+protein+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates.</a> Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).</li>
<li>Sontag, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Mutant+Huntingtin+Aggregation+Conformers+and+Modulation+of+SDS-Soluble+Fibrillar+Oligomers+by+Small+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Huntingtons+Dis%22%5BJournal%5D)">Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules.</a> J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).</li>
<li>Grima, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+Huntingtin+Disrupts+the+Nuclear+Pore+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex.</a> Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).</li>
<li>Sontag, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylene+blue+modulates+huntingtin+aggregation+intermediates+and+is+protective+in+Huntington%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington's disease models.</a> J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).</li>
<li>Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricyclic+pyrone+compounds+prevent+aggregation+and+reverse+cellular+phenotypes+caused+by+expression+of+mutant+huntingtin+protein+in+striatal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons.</a> BMC Neurosci. 10, 73(2009).</li>
<li>Shahmoradian, S. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23853712">TRiC's tricks inhibit huntingtin aggregation.</a> Elife. 2, e00710(2013).</li>
<li>Kim, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+inhibition+induces+alpha-synuclein+SUMOylation+and+aggregate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation.</a> J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).</li>
<li>Goldberg, N. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Neural+Progenitor+Transplantation+Rescues+Behavior+and+Reduces+alpha-Synuclein+in+a+Transgenic+Model+of+Dementia+with+Lewy+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies.</a> Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

定量的な一貫性のある結果を確保するため上記のプロトコルのいくつかの対策が必要です。両方分数で mHTT が複数の凍結融解時に時間をかけて集計を自発的に形成するまず、特に高濃度で。したがって、タンパク質プレップの因数を凍結し、上記のプロトコルで説明されているように分析を実行する前に必要な量のみを解凍するが重要です。さらに、不溶性画分利回り融解時に白い鉛塩法は、再構成は追加 5 s 超音波パルス、5 分沸騰させると、再定量生化学的アッセイによる解析する前に、必要にあります。
この試金のため定量的な解像度は、読み込みコントロールまたは各サンプル内の家は維持遺伝子の可溶性画分の平均輝度を正規化することで達成可能です。下図のように、GAPDH として使用された家は維持遺伝子可溶性画分のそれは主に細胞質 (図 1) に局在するよう。他の一般的に使用される家は維持蛋白質は、アクチン、α-チューブリンと Erk 1/2 です。ただし、適切な正規化蛋白質は左右されない正確な正規化の定常状態式を確保するために検討されているシステムの最適化必要...

適切な折りたたみをするタンパク質品質管理ネットワークの中断、細胞蛋白質の低下はアルツハイマー病 (AD)、パーキンソン病 (PD)、ハンチントン病 (HD)、病理学に可能性が高い中央および他の「タンパク」2,3 を障害します。プロテオステイシス ネットワーク コンポーネントおよび病理学への貢献の詳細な理解したがって改善の治療上の介在を開発することが重要です。HD は polyglutamines (polyQ) (HTT) huntingtin 蛋白質4での拡張されたストレッチの結果 HD 遺伝子内の CAG リピートの異常な拡張によって引き起こされます。HD 発症の一貫した病理学的機能、蓄積、および正常細胞の恒常性と機能にいくつかの方法で干渉する示されている HTT 脳の地域および末梢組織での集計は、結果として得られる折りたたみとして、します。5,6。 中の HTT は普遍的表現、線条体中とげだらけニューロンは、選択的に脆弱性が存在と影響を受ける最もあからさま HD 病因にも関連付けられている注目すべき皮質萎縮。
脳内 HD 患者と動物モデルの HTT の集合体の形成は通常病気の進行とドミナント ネガティブ益 mHTT7の関数のプロキシ マーカーを務めています。どのタンパク質の折りたたみと集約に貢献するかもしれない mHTT 誘発毒性正確なメカニズムは不明と様々 な動物モデルの HD 患者の頭脳のこれらの介在物の生成は、不変、必然的な機能です。介在物表示を蓄積した HTT 断片を N 末端の主構成するその分解を示す polyQ を拡大し、9 8,をスプライシングの代替と同様、フルレングスの HTT の処理再生ことがあります、HTT ビジュアルエフェクト N 末端フラグメントの病因に重要な役割は、急速に集計することができます、核と加速や集計プロセス10を伝達する HTT の病理学的フォームを構成するかもしれない。
ただし、これらの介在物の存在では、HTT による毒性や細胞死11と必ずしも関連しません。HTT は不溶性の集計および介在物12に可溶性オリゴマー種と β シート線維を通じて水溶性モノマーから集計プロセスを経るに提案されています。標準生化学的アッセイを介してこれらの様々 な蛋白質種を解決する低洗剤換散バッファーで安定性と標準的な生化学的アッセイを使用して可視化の難しさのためフィールドで課題となっています。したがって、方法論的考察、程度や蓄積・集計 mHTT のパターンを検出するに重要です。
ここで提示されたプロトコルは HTT は、具体的に HD 病因と病気進行1,13 と密接に追跡するために表示される不溶性の HMW HTT 種の形成のいくつかの中間を可視化するメソッドを提供します。、14。解決および mHTT の複数の種を追跡することは、研究者に病因を研究し、変調して病気の発症に影響を与える潜在的な治療上の介在を評価する生化学的なツールを提供します。

<table><tbody><tr><td>滅菌フィルター</td><td>ミリポア</td><td>SCGP505RE</td><td>スクリューキャップ、滅菌真空フィルター</td></tr><tr><td>1 mL ティッシュグラインダー、Dounce</td><td>Wheaton</td><td>357538</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>モデル Q125</td><td></td></tr><tr><td>DC タンパク質アッセイ</td><td>Biorad</td><td>5000111</td><td>Lowry アッセイ</td></tr><tr><td>Tris 1M 緩衝液</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60636</td><td></td></tr> <tr>に匹敵する<td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 5M溶液</td><td>Teknova</td><td>S0251</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS溶液</td><td>Teknova</td><td>S0295</td><td></td></tr><tr><td>N-エチルマレイミド</td><td>Sigma</td><td>E1271</td><td></td></tr><tr><td>フェニルメチルスルホニーフッ化</td>物 <td>Sigma</td><td>P7626</td><td>100mMストック溶液を100%作成EtOH、4°Cで保存。C</td></tr><tr><td>オルトバナジン酸ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>S6508</td><td>水中で 0.5M ストック溶液を作成</td></tr><tr><td>ロイペプチン</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td>水中で 10mg/ml ストック溶液を作成</td></tr><tr><td>アプロチニン</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td>水中で 10mg/ml ストック溶液を作成</td></tr><tr><td>フッ化ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>S4504</td><td>水中で 500mM ストック溶液を作成</td></tr><tr><td>アンチ HTT</td><td>ミリポア</td><td>MAB5492</td><td>ウェスタンブロットには1:1000、フィルター遅延アッセイには1:500</td></tr>を使用 <tr><td>Anti-GAPDH</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-56875</td><td>可溶性ウェスタンブロットには1:1000を使用</td></tr></tbody></table>

水溶性と不溶性の huntingtin 種の解像度の分別

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

誤って折りたたまれたタンパク質の蓄積は、ハンティントン病 (HD) および他の多くの神経変性疾患の中心です。具体的には、HD の病理学的特徴は高分子量複合体に突然変異体の HTT (mHTT) 蛋白の異常な蓄積、断片および他の蛋白質の細胞内封入体が構成されます。測定および蛍光顕微鏡、西部のしみの分析、フィルターなどの mHTT を含む集計の様々 な形の貢献を理解する従来の方法は、アッセイをトラップします。
ただし、これらのメソッドのほとんどは、特定の構造、したがって mHTT タンパク質フラックス集計溶解度と解像度の複雑な性質のための完全な状態を解決できません。
集計 mHTT の変更されたフォームと複合体の様々 な識別、分離、細胞凝集体とフラグメントの可溶化は必須です。ここで分離し、可溶性 mHTT、モノマー、オリゴマー、フラグメントを視覚化する手法について述べるし、不溶性の高分子量分画法蓄積 mHTT 種。HMW mHTT を追跡、病気の進行とマウス動作の読み出しに対応し、有益ある特定の治療上の介在の1によって調整されています。この方法は、マウスの脳、末梢の組織および細胞培養で使用できるが他のモデル システムや疾患のコンテキストに適応することがあります。

水溶性と不溶性のセル lysates 分別を次の解像度は、ウエスタン解析とフィルター障害アッセイ (図 2) を使用して検出できます。例として HEK293T 細胞のトランスフェクション試薬 (例えば、lipofectamine 2000) を使用してを導入させた、HTT エクソン 1 エンコード cDNA 97 グルタミンを含む繰り返し15ポリ プロリンの豊富な地域に続いて、これらの細胞を許されました。特急 44 h. 細胞のいずれかの 5 μ m プロテアソームをブロックする MG132 または 18 収穫前に h ととして分離するためのコントロールとして DMSO 上記。分別のプロトコルに従い変異 HTT エクソン 1 水溶性モノマーとして約 45 kDa Bis トリス ページ ゲル 4-12%、3 ~ 8% トリス酢酸ページのゲル (図 2 a) の HMW の不溶性蓄積された種...

不溶解性および溶ける変異ハンチンチン種マウス脳と細胞培養からの分別の方法を説明します。記載されているメソッドは、特性評価および huntingtin 蛋白質フラックスと病気の発症と摂動存在下での蛋白質の恒常性の分析にエイズの定量化の便利

水溶性と不溶性の Huntingtin 種の解像度の分別

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

この手順の全体的な目標は、ハンチントン病モデルシステムにおけるタンパク質恒常性の分析のためのハンチンチンタンパク質フラックスの視覚化、特性評価、および定量化のための有用なツールを説明することです。この方法は、特定の治療介入が疾患の病因に与える影響を理解するなど、タンパク質の恒常性や神経変性疾患の分野における問題を理解するのに役立ちます。この手法の主な利点は、研究者が不溶性タンパク質種を分離して定量分析できることです。この方法は、ハンチントン病の病因における生化学的変化についての洞察を得ることができますが、パーキンソン病やアルツハイマー病などの他のタンパク質のミスフォールディング疾患にも適用できます。この手順を開始するには、各サンプルの2セットのチューブを可溶性および不溶性としてラベル付けします。可溶性チューブでサンプル溶解する直前に、適切な量の阻害剤を添加して溶解バッファーを調製します。次に、プロテアーゼ阻害剤を添加した氷冷作用可溶性溶解バッファーを組織に加えます。マウスの脳組織の場合、1ミリリットルのガラス製ダウンサーでゆっくりと30回ダウンスします。液体の表面を壊さないように注意してください。次に、氷上の不溶性標識チューブにピペットで入れます。細胞株については、各6ウェルプレートで細胞を10倍から5番目の細胞に5倍ずつ播種し、ほぼコンフルエントに増殖させました。その後、細胞を冷たい1X PBSで一度すすぎ、取り除きます。次に、最小限の量の溶解バッファーを細胞に塗布し、細胞スクレーパーで細胞を持ち上げます。次に、ホモジネートまたは細胞溶解物を標識された不溶性チューブに移し、氷上で1時間溶解します。細胞ライセートについては、インキュベーションを開始する前に数回回転させて細胞塊を分解し、気泡の形成を防ぎます。ライシングの途中で、各サンプルを1秒間パルスボルテックスします。その後、サンプルを摂氏4度で15, 000 x gで20分間遠心分離します。次に、上清を取り除きます。ペレットや曇った層を乱さないように注意してください。上清を可溶性画分として可溶性標識チューブにピペットで移し、氷上に保ちます。可溶性および不溶性の溶解バッファーを追跡することが重要です。バッファーを切り替えたり、不溶性バッファーやサンプルを氷上に置いたりすると、プロトコルの結果に悪影響を及ぼします。ペレットを500マイクロリットルの溶解緩衝液で洗浄し、摂氏4度で15, 000 x gで5分間遠心分離します。もう一度洗濯を繰り返します。その後、残りの洗浄バッファーをすべて取り除き、組織ペレットのみを残します。次に、4%SDSを添加した溶解緩衝液でペレットを再懸濁します。プローブ超音波処理器を使用して、室温で各サンプルを30秒間超音波処理します。少量を長期間超音波処理することは技術的に困難です。乳化または噴霧によってサンプルを失わないように注意してくださいampこのステップを完了する間。その後、サンプルを30分間煮沸します。次に、それらを6, 000 x gで短時間遠心分離します。その後、界面活性剤対応タンパク質アッセイまたはLowryタンパク質アッセイを実施して、タンパク質濃度を測定します。その後、凍結/融解の問題を避けるために、サンプルを50マイクロリットルのバッチに分注します。このステップでは、ローディングバッファー中で30マイクログラムのサンプルを1対1の比率で希釈することにより、ウェスタンブロットを行います。サンプルを5分間煮沸し、6, 000 x gで短時間遠心分離します。次に、SDSページとウェスタンブロットでフラクションを解析します。メンブレンを全タンパク質染色で染色し、タンパク質のローディング効率を可視化します。以下は、4-12%Bis-Trisおよび3-8%Tris-Acetateページゲルで分離されたHEK 293T細胞ライセートの可溶性および不溶性画分です。GAPDH負荷制御に正規化された可溶性画分は、プロテアーゼ阻害剤MG132への曝露に基づく変異型ハンチンチンエクソン1可溶性モノマーの変動を示しています。不溶性画分は、変異型ハンチンチンの高分子量蓄積種もMG132処理によって調節されることを示しています。そして、ウェスタンブロットおよびフィルター遅延分析を使用したHeLA細胞ライセートの可溶性および不溶性画分のサンプルを以下に示します。データは、過剰発現したSUMOアイソフォームの存在が、不溶性画分中の高分子量変異体と線維性不溶性変異体ハンチンチンの両方を増加させることを示しています。この図は、97Qハンチンチンエクソン1を発現するHeLa細胞からの不溶性分画における潜在的な治療薬を調節した後の高分子量変異ハンチンチン蓄積の調節を示しています。治療標的PIAS1は、PIAS1に対してsiRNAでサイレンシングされたか、過剰発現されました。PIAS1に対してマイクロRNAで処理し、3-8%Tris-Acetateページゲルで分離したマウス線条体由来の不溶性画分は、高分子量不溶性ハンチンチンの調節を示しています。NEMでの作業は非常に危険である可能性があるため、このプロトコルを実行する際には常にフェイスマスクの着用などの予防策を講じる必要があることを忘れないでください。一度習得すると、ライセートから分画終了までのこの手法は、サンプル数にもよりますが、約3〜4時間で実行できます。タンパク質の定量と分注には、さらに1時間かかるべきです。この手順に続いて、アガロースゲル電気泳動またはフィルター遅延などの他の方法を実施して、可溶性オリゴマーまたは不溶性フィブリルをそれぞれ検出することができます。このビデオを見れば、不溶性ミスフォールドタンパク質を分離して定量分析を行う方法について十分に理解できるはずです。

fractionation-for-resolution-soluble-insoluble-huntingtin

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

ここで、我々は、高活性Hsp104、六量体AAA +タンパク質酵母、タンパク質の分解に結合ATPの加水分解からの精製のためのプロトコルについて説明します。このスキームでは、からアフィニティー精製のためのしたHis6...

Hsp104の精製、タンパク質Disaggregase

このビデオでは、密度勾配遠心分離と非アミロイドタンパク質の消化を使用して、マウス脳組織抽出物からアミロイド線維を分離するプロトコルを示しています。...

脳組織抽出物からのアミロイド線維の単離

ここでは、異なるシナプスコンパートメントに属するタンパク質を単離するための堅牢な手順を表す脳膜分画プロトコルを提示します。...

脳膜分画：<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Subsynaptic Protein Localizationを評価するアプローチ

ひと死後脳から洗剤不溶性タンパク質凝集体の強化のため、省略された分別のプロトコルを説明します。...

人間の死後脳から洗剤不溶性タンパク質凝集体の濃縮

封入体、ミリグラム単位の微量のタンパク質を生成するための精製からカンピロバクター走 Tlp3 の dCACHE ペリプラズム...

高効率巻き戻しと受容体リガンド結合領域の浄化法

ここでは、ネイティブなタグ無料モノマーのミリグラム量と小さなユビキチン関連修飾子 (相撲) の一時的な融合に基づくハンチンチン蛋白質 (Httex1) の exon1 の線維の生産のための堅牢な最適化されたプロトコルを提案する.

ネイティブ、タグなしの Huntingtin Exon1 モノマーと相撲の融合戦略を使用して線維の生成

ヒドロラーゼドメイン含有タンパク質のフマリアルセトー酢酸水素の発現および精製は、例(大腸菌、FPLCにおける発現)と記載されている。精製タンパク質は、結晶化および抗体産生に使用され、酵素アッセイに使用されます。選択されたフォトメトリックアッセイは、オキサロアセテートデカルボキシラーゼおよびアシルピルベートヒドロラーゼとしてFAHD1の多機能性を表示するために提示される。...

フマリアルセトーアセテートヒドロラーゼドメイン含有タンパク質の発現、精製、結晶化、酵素アッセイ

生きた酵母や哺乳動物細胞におけるホルムアルデヒド架橋を用いた翻訳(タンパク質生合成)複合体を迅速に安定化させる技術を紹介する。このアプローチにより、一過性の中間体と動的RNA:タンパク質相互作用の解剖が可能になります。架橋された複合体は、深いシーケンシングベースのプロファイリング方法、顕微鏡、質量分析など、複数のダウンストリームアプリケーションで使用できます。...

真核細胞からのトランスレーショナル複合体の迅速な インビボ 固定と分離

HEK293細胞における完全長ヒトハンチンチンタンパク質変異体のコンストラクトデザイン、一過性トランスフェクション、発現および精製をカバーするスケーラブルなプロトコルを提供しています。...

一過性発現システムを用いた哺乳類細胞における完全長ヒトハンチンチン変異体の効率的かつスケーラブルな生産

このプロトコールは、ブタ腎臓およびマウス肝臓からフマリアセトアセテート加水分解酵素ドメイン含有タンパク質1(FAHD1)を抽出する方法を記載する。列挙された方法は、目的の他のタンパク質に適合させ、他の組織に対して改変してもよい。...

豚腎臓およびマウス肝臓からのFAHD1タンパク質の抽出および精製

このプロトコルは、マウスの脳から高純度のシナプトソーム、シナプス小胞、およびその他のシナプス画分を取得するための堅牢で詳細な方法を提供します。この方法は、タンパク質の局在と機能の生化学的分析を含むシナプスプロセスのコンパートメント分解能での評価を可能にします。...

マウス脳からのシナプス成分の単離のための細胞内分画

学ぶ水溶性と不溶性のHuntingtinタンパク質の分別法。マウス脳や細胞培養から変異Huntingtinを分離し、タンパク質恒常性を定量的に解析します。この手法はハンチントン病や他の神経変性疾患の研究に応用可能です。

水溶性と不溶性の Huntingtin 種の解像度の分別

さらに動画を探す