水溶性と不溶性の Huntingtin 種の解像度の分別

この手順の全体的な目標は、ハンチントン病モデルシステムにおけるタンパク質恒常性の分析のためのハンチンチンタンパク質フラックスの視覚化、特性評価、および定量化のための有用なツールを説明することです。この方法は、特定の治療介入が疾患の病因に与える影響を理解するなど、タンパク質の恒常性や神経変性疾患の分野における問題を理解するのに役立ちます。この手法の主な利点は、研究者が不溶性タンパク質種を分離して定量分析できることです。

この方法は、ハンチントン病の病因における生化学的変化についての洞察を得ることができますが、パーキンソン病やアルツハイマー病などの他のタンパク質のミスフォールディング疾患にも適用できます。この手順を開始するには、各サンプルの2セットのチューブを可溶性および不溶性としてラベル付けします。可溶性チューブでサンプル溶解する直前に、適切な量の阻害剤を添加して溶解バッファーを調製します。

次に、プロテアーゼ阻害剤を添加した氷冷作用可溶性溶解バッファーを組織に加えます。マウスの脳組織の場合、1ミリリットルのガラス製ダウンサーでゆっくりと30回ダウンスします。液体の表面を壊さないように注意してください。

次に、氷上の不溶性標識チューブにピペットで入れます。細胞株については、各6ウェルプレートで細胞を10倍から5番目の細胞に5倍ずつ播種し、ほぼコンフルエントに増殖させました。その後、細胞を冷たい1X PBSで一度すすぎ、取り除きます。

次に、最小限の量の溶解バッファーを細胞に塗布し、細胞スクレーパーで細胞を持ち上げます。次に、ホモジネートまたは細胞溶解物を標識された不溶性チューブに移し、氷上で1時間溶解します。細胞ライセートについては、インキュベーションを開始する前に数回回転させて細胞塊を分解し、気泡の形成を防ぎます。

ライシングの途中で、各サンプルを1秒間パルスボルテックスします。その後、サンプルを摂氏4度で15, 000 x gで20分間遠心分離します。次に、上清を取り除きます。

ペレットや曇った層を乱さないように注意してください。上清を可溶性画分として可溶性標識チューブにピペットで移し、氷上に保ちます。可溶性および不溶性の溶解バッファーを追跡することが重要です。

バッファーを切り替えたり、不溶性バッファーやサンプルを氷上に置いたりすると、プロトコルの結果に悪影響を及ぼします。ペレットを500マイクロリットルの溶解緩衝液で洗浄し、摂氏4度で15, 000 x gで5分間遠心分離します。もう一度洗濯を繰り返します。

その後、残りの洗浄バッファーをすべて取り除き、組織ペレットのみを残します。次に、4%SDSを添加した溶解緩衝液でペレットを再懸濁します。プローブ超音波処理器を使用して、室温で各サンプルを30秒間超音波処理します。

少量を長期間超音波処理することは技術的に困難です。乳化または噴霧によってサンプルを失わないように注意してくださいampこのステップを完了する間。その後、サンプルを30分間煮沸します。

次に、それらを6, 000 x gで短時間遠心分離します。その後、界面活性剤対応タンパク質アッセイまたはLowryタンパク質アッセイを実施して、タンパク質濃度を測定します。その後、凍結/融解の問題を避けるために、サンプルを50マイクロリットルのバッチに分注します。

このステップでは、ローディングバッファー中で30マイクログラムのサンプルを1対1の比率で希釈することにより、ウェスタンブロットを行います。サンプルを5分間煮沸し、6, 000 x gで短時間遠心分離します。次に、SDSページとウェスタンブロットでフラクションを解析します。

メンブレンを全タンパク質染色で染色し、タンパク質のローディング効率を可視化します。以下は、4-12%Bis-Trisおよび3-8%Tris-Acetateページゲルで分離されたHEK 293T細胞ライセートの可溶性および不溶性画分です。GAPDH負荷制御に正規化された可溶性画分は、プロテアーゼ阻害剤MG132への曝露に基づく変異型ハンチンチンエクソン1可溶性モノマーの変動を示しています。

不溶性画分は、変異型ハンチンチンの高分子量蓄積種もMG132処理によって調節されることを示しています。そして、ウェスタンブロットおよびフィルター遅延分析を使用したHeLA細胞ライセートの可溶性および不溶性画分のサンプルを以下に示します。データは、過剰発現したSUMOアイソフォームの存在が、不溶性画分中の高分子量変異体と線維性不溶性変異体ハンチンチンの両方を増加させることを示しています。

この図は、97Qハンチンチンエクソン1を発現するHeLa細胞からの不溶性分画における潜在的な治療薬を調節した後の高分子量変異ハンチンチン蓄積の調節を示しています。治療標的PIAS1は、PIAS1に対してsiRNAでサイレンシングされたか、過剰発現されました。PIAS1に対してマイクロRNAで処理し、3-8%Tris-Acetateページゲルで分離したマウス線条体由来の不溶性画分は、高分子量不溶性ハンチンチンの調節を示しています。

NEMでの作業は非常に危険である可能性があるため、このプロトコルを実行する際には常にフェイスマスクの着用などの予防策を講じる必要があることを忘れないでください。一度習得すると、ライセートから分画終了までのこの手法は、サンプル数にもよりますが、約3〜4時間で実行できます。タンパク質の定量と分注には、さらに1時間かかるべきです。

この手順に続いて、アガロースゲル電気泳動またはフィルター遅延などの他の方法を実施して、可溶性オリゴマーまたは不溶性フィブリルをそれぞれ検出することができます。このビデオを見れば、不溶性ミスフォールドタンパク質を分離して定量分析を行う方法について十分に理解できるはずです。