高齢者人間ブルッフ膜のEx Vivoモデルの網膜色素上皮細胞の培養

この実験手順の全体的な目標は、ブルッフ膜培養システムとして知られるex vivo-細胞外マトリックスを作成し、ブルッフ膜が網膜色素上皮細胞のオーバーレイに及ぼす影響を観察することです。この方法は、老化したブルッフ膜の変化がオーバーレイするRPE細胞の機能不全に寄与するかどうかなど、AMD病因分野のRPEサブバイオロジーにおける重要な質問に答えるのに役立つ可能性があります。この技術の主な利点は、研究者がさまざまな年齢のヒトドナーの眼から天然のブルッフ膜を分離し、RPE細胞培養のプロテオミクス研究に使用できることです。

ブルッフの膜を分離し、天然のブルッフの膜へのダメージを最小限に抑えた実際の生体培養システムを作ることは困難ですが、このビデオではその方法をご紹介します。まず、CO2に依存しないDMEMに浸した1.5平方インチのガーゼを100mmの皿に入れます。次に、アイグローブをガーゼにセットします。

次に、外科用ブレードを使用して、輪部の3mm後方にある強膜を切開します。次に、細い刃のハサミを使用して全層を切開し、目の周りのどちらの方向にも切開を円周方向に伸ばします。次に、角膜、水晶体、虹彩を含む前眼部を取り外して廃棄します。

また、硝子体と網膜を捨てます。次に、テフロンコーティングされたヘラを使用して、RPEブルッフの膜脈絡膜複合体を末梢から視神経まで強膜から慎重に剥がします。これは、膜複合体を引き裂かないように非常に慎重に行う必要があります。

次に、細い手術用ハサミを使用して、強膜に4つの放射状切開を行い、強膜を剥がします。次に、視神経からブルッフ膜脈絡膜外植片を切断し、この外植片をDPBS中に0.02モルの水酸化アンモニウムを含む60ミリメートル皿に移します。天然RPE細胞を除去するには、この外植片を室温で20分間インキュベートします。

インキュベーション後、テフロンコーティングされた鉗子でブルッフ膜上の視神経部位を固定し、組織の周りに溶液を流しながら、DPBSを使用して外植片を3回洗浄します。次に、外植片を浮かせ、ラミニン側を上に向けて二酸化炭素を含まない媒体に流します。ブルッフのメンブレンに4つの切開を行い、0.2ミクロンの細孔を持つラミネートされていない疎水性の厚さ65ミクロンのPTFEメンブレンを外植片に転写します。

これを基底層をPTFEメンブレンに当てて設定します。皿の中の余分な液体を取り除き、アセンブリをガラス微量分析真空フィルターホルダーシステムに移し、フリットガラスサポートの上に置きます。次に、基底椎弓板との接触を避けながら、テフロンコーティングされた鉗子を使用して脈絡膜側のカールした端を平らにします。

次に、15ミリリットルの4%アガロースをDPBSで液化し、摂氏37度に冷却します。次に、アガロースを外植片の脈絡膜側にゆっくりと注ぎ、穏やかに吸引して平らに保ちます。ゲルが固まり始めたら、メンブレンと一緒に氷上の60mmディッシュに移します。

ゲルを2〜3分間固化させてから、PTFEメンブレンをはがします。次に、外植片をDPBSに沈め、必要になるまで摂氏4度で保管します。液体4%アガロースで裏打ちされた60mmの皿で外植片を培養するときは、ブルッフの膜を上にします。

ポリスチレンで裏打ちされた96ウェルプレートで培養する場合は、ゲルで包んだブルッフメンブレン外植片を平らなテフロンシートの上に置き、ラミニン面を上にして置きます。次に、トレフィンを使用して、外植片から6〜8個の6ミリメートルボタンを切り取り、ティッシュボタンを液体アガロースを充填したウェルに移します。まず、先ほどと同様にDPBSを染み込ませたガーゼにアイグローブをセットします。

次に、虹彩と強膜の接触点である扁平部の5ミリメートル下に網膜下腔に円周方向の切開を行います。内部セグメント、硝子体液、および網膜を破棄します。次に、トランスファーピペットを使用して、2〜3ミリリットルの冷たいDPBSでアイカップを洗います。

合計で、アイカップを3回洗います。次に、RPE細胞を解離するために、アイカップをトリプシンで最大10分間処理します。次に、トリプシン処理したRPE細胞を50ミリリットルのチューブに移し、反応を急冷するために、37°CのFBSを含む25ミリリットルの培地を追加します。

次に、組織と溶液を200gで摂氏24度で10分間遠心分離します。次に、ペレットを15%FBSを含む5ミリリットルのDMEM完全培地に再懸濁します。今度は、細胞を数え、96ウェルプレートのブルッフの膜の各ボタンに抗生物質を含む無血清の最小必須培地の200マイクロリットルに15, 000の生存可能なRPE細胞を座らせます。

細胞を少なくとも24時間培養して接着します。その後、培地を温める完全DMEMにゆっくりと交換し、細胞の培養を続けます。このプロトコルを使用すると、老化して病気になったヒトブルッフ膜を、その上でRPE細胞を成長させることによって研究することができます。

通常、老化した外植片はRPE細胞の再接着を減少させます。また、老化したヒトBruch膜で培養されたRPE細胞は、重要なRPE機能であるロッドの外側セグメントを食作用させることも困難です。マイクロアレイを用いて、高齢のブルッフ膜で細胞を培養した場合と、若年者の細胞をブルッフ膜で培養した場合では、RPE細胞の遺伝子発現が異なることがわかりました。

このビデオを見れば、ブルッフ膜をヒトドナーの目から分離し、RPE細胞を培養できる外植片を作る方法についてよく理解できるはずです。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば約3時間で完了します。この手順を試みるときは、表面の損傷を避けるために、解剖ツールでブルッフ膜外植片のラミニン側に触れないように注意することが重要です。

この手順に続いて、RPE食作用やRPE細胞遺伝子発現研究などの他の方法を実行して、さまざまな高齢ドナーからのブルッフ膜や加齢性黄斑変性症のドナーからのブルッフ膜がRPE細胞機能のオーバーレイに影響を与えるかどうかなどの追加の質問に答えることができます。開発後、この技術は、加齢性黄斑変性症の分野の研究者が、ブルッフ膜ex vivoモデルシステムにおけるAMDの病因のメカニズムを探求する道を開きました。