Name: 中間径フィラメントと微小管 2次元直接確率光再構成顕微鏡イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: 学ぶ 2次元デュアルカラーdSTORMイメージング法で固定細胞内の微小管と中間径フィラメントを高分解能で可視化する手法。U373細胞を用いて細胞骨格ネットワークの相互作用を解析し、従来の蛍光顕微鏡では解像できない構造を観察できる。

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ミカエル ・ Lelek、オレシティス Faklaris と有意義な議論のニコラス ・城下町、アンドレイ Aristov と超解像技術のヘルプについてエレナ練とシャイラージャ ・ Seetharaman 原稿の注意深い読書のために感謝します感謝するフランス国立研究機関 (ANR 10 INSB 04; サポート フランス バイオ イメージング インフラストラクチャ ネットワークと同様、UtechS フォトニック バイオ イメージング (Imagopole) Citech のパスツール研究所 (パリ, フランス)未来への投資)、および地方イル (ドメーヌ d プログラム ' 水利 Majeur Malinf) Elyra 顕微鏡の使用のため。この仕事に支えられ、リーグ Contre le がんとフランス国立研究機関 (ANR-16-CE13-0019)。

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<li>Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+estimate+the+average+localization+precision+of+a+single-molecule+localization+microscopy+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment.</a> Histochem Cell Biol. 141 (6), 629-638 (2014).</li>
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<li>Olivier, N., Keller, D., Gonczy, P., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+doubling+in+3D-STORM+imaging+through+improved+buffers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Resolution doubling in 3D-STORM imaging through improved buffers.</a> PLoS One. 8 (7), e69004(2013).</li>
<li>Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Imaging+Conditions+for+Demanding+Multi-Color+Super+Resolution+Localization+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy.</a> PLoS One. 11 (7), e0158884(2016).</li>
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<li>Mikhaylova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+bundled+microtubules+using+anti-tubulin+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies.</a> Nat Commun. 6, 7933(2015).</li>
<li>Nieuwenhuizen, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+image+resolution+in+optical+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Measuring image resolution in optical nanoscopy.</a> Nat Methods. 10 (6), 557-562 (2013).</li>
<li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nprot.2017.024">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li>
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プロトコルの重要なステップ
微小管の dSTORM 画像内のアーティファクトとグリア細胞における IFs を最小にするプロトコルをご紹介します。サンプル準備およびイメージ投射の各ステップでの成果物を作成できます: 固定、ブロック、反応、ドリフトの買収により、非最適な点滅条件23。我々 は、最も重要な手順以下リストします。
表面に蛍光物質の非特異的結合を制限する重要なステップは、クリーニング、coverslips したがって dSTORM 画像の背景ノイズを制限します。
PFA (パラホルムアルデヒド) (ステップ n ° 3) とグルタールアルデヒドとトリトン、および固定のミックスを使用して抽出し、固定のソリューションの手順とサンプルを修正お勧めします。固定のプロトコルは、Chazeau et al12から適応された: 我々 は 60 に抽出/...

細胞の中間径フィラメント (IFs) は、直径 10 nm のヒト - または場合蛋白質の特定のサブセットを携帯型の heteropolymers です。IFs は、細胞運動、増殖やストレス応答など細胞機能の広い範囲に参加します。その重要な役割が 90 以上の人間の病気直接場合蛋白質で突然変異によって引き起こされるという事実によって強調表示されます。例えば、腫瘍の増殖および1,2,3を広める場合組成の変化を伴います。細胞の極性形成、部門と移行2,3などの細胞機能を制御する共同で 3 つの骨格システムが働くという証拠が高まっています。建築の空間と機能の間の密結合なので、他のフィラメントの場合の構造への洞察力を得るし、細胞骨格のクロストークを理解することが重要です。この記事は、超解像技術のデュアル カラー dSTORM (直接確率再建顕微鏡)4との間の相互作用を調査する使用方法と微小管を実行するプロトコルを提供しますで固定、培養2 次元 (2 D) 内のセル。
いくつかの超解像技術は、過去に開発されている年とそこ発見 2014年5ノーベル化学賞の原点であった。これらすべての方法の間であるパーム6 (Photo-Activated ローカリゼーション顕微鏡) スイッチング蛍光タンパク質を使用して嵐7 fluorophores が付いてまたは dSTORM4 のペアのような単一分子局在に基づく方法従来 fluorophores が付いています。ローカライズするためにこれらすべてのメソッドは、「オフ」状態に (i) 蛍光レポーターのほとんどのスイッチから成っている同じ原理に基づいています」(非蛍光灯)、(ii) それらのサブセットを蛍光の確率論的活性化状態のナノメートル精度、および (iii) できるだけ fluorophores の多くのサブセットをアクティブにするためにこのプロセスの繰り返しと空間的な位置。最終的なイメージは、20 ~ 40 までの横方向の分解能を提供する活性化分子のすべてのローカライズを使用して再構築されます nm。パーム/嵐をできるようにいくつか商品化された光学系のルーチンの実験のための生物学者に今あります。ここでは、1 つのようなシステムは微小管と IFs の結合構造を研究に使用されました。非常に薄い層状の領域を観察する最適ですのですべて単一分子局在ベースのメソッドの間でデュアル カラー dSTORM 手法が選ばれた (< 1 μ m) 付着性のセルの画像解像度の大幅な改善を提供することができます、最小限の時間とお金の投資。確かに、dSTORM は、細胞染色と蛍光抗体法により定期的に使用される標準的な有機色素と互換性がある非常に便利な汎用性の高いテクニックです。
限られている場合は特に、選択バッファーに正しく 2 つの染料が点滅する場合もあるので、実験の条件を最適化する必要がありますデュアル カラー dSTORM 1色 dSTORM 画像は Alexa6478蛍光体を使用して取得する比較的簡単なレーザー パワー。優秀な論文は dSTORM9,10、11,12,13, マルチカラー イメージングをセットアップする方法に使用されておりこれらの書類は、詳細に説明の可能なソース成果物と劣化画像の解像度だけでなく、それらを克服する方法。この記事は、細胞の固定、染色、サンプル準備の面で最適な実験条件、画像取得と画像再構成が密な細胞質場合ネットワークと微小管の画像を得るために説明デュアル カラー dSTORM とグリア細胞。簡単に言えば、Chazeau ら12の抽出/固定方法がグリア細胞に適応されポスト固定ステップ、最適化された抗体濃度で使用、10 ミリメートルと嵐バッファー MEA の記載したデンプシー9ら実験のセットアップとサンプル タイプに最適なことが判明します。
グリア細胞は主に 3 種類の場合はタンパク質を表現: ビメンチン、ネスチンと GFAP (グリア細胞の酸性タンパク質の線維性)。これらの 3 つのタンパク質は、アストロ サイト14共重合に示されていた。我々 は以前超解像の構造化照明顕微鏡 (SR SIM) 同じ単一の場合フィラメントのこれらの 3 つの場合の蛋白質を見つけることができます、グリア細胞15と同様の分布と動態表示ことを示した。3 の場合蛋白質の間の類似点のため全体の場合ネットワークの腔は使用レポーターとして。DSTORM を使用すると、回折では不可能でしたが微小管に沿って場合フォーム バンドルが顕微鏡技術15に限られた解決することができた。これらの観察は、ビメンチン IFs にテンプレート微小管ことができる方法を理解し、彼らの成長の軌道の細胞移行16中極性軸の整備を推進を規制できます。超解像画像 2 つの細胞骨格サブシステムの相互作用に重要な情報を提供し、空間協会とセル型特定17となるローカル関数間のリンクへの洞察力をもたらした。一般に、密度と特異性の面で条件が良い染色に達した、デュアル カラー dSTORM を骨格要素やその他の細胞小器官間のクロストークを勉強する使用できます。この手法は膠芽腫と星の中に、細胞骨格の変化を特徴付けるより役に立つでしょう、最も一般的なと最も悪性の腫瘍の場合蛋白質の表現が、中枢神経系の変更18 、19,20,21。

<table><tbody><tr><td>最小必須培地(MEM)</td><td>Gibco</td><td>41090-028</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>Gibco</td><td>1140-050</td><td>細胞培養 1/100e</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>細胞培養 1/100e</td></tr><tr><td>F&oE;タルウシ血清</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>細胞培養 1/10e</td></tr><tr><td>0,05 % トリプシン-EDTA (1X)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>フィッシャー 科学</td><td>11540486</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>カバースリップ 18 mm n&deg;1,5H</td><td>マリエンフィールド/ドミニク・ダッチャー</td><td>900556</td><td>カバースリップ</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド(PFA)溶液</td><td>シグマ</td><td>F8775</td><td>細胞固定</td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td>シグマ</td><td>G5882</td><td>細胞固定</td></tr><tr><td>トリトン X100</td><td>シグマ</td><td>T9284</td><td>非イオン性界面活性剤。細胞固定に使用</td></tr><tr><td>水素化ホウ素ナトリウム(NaBH4)</td>シ<td>グマ</td><td>452904-25ML</td>、<td>細胞固定</td></tr><tr><td>BSA</td><td>シグマ</td><td>A7906</td><td>サンプル不動態化 PBS中の3%</td></tr><tr><td>モノクローナル 抗ビメンチン(V9)マウスで産生</td>された抗体 <td>シグマ</td><td>V6630</td><td>一次抗体</td></tr> ラット<tr><td>抗アルファチューブリン</td><td>バイオラッド</td><td>MCA77G</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>ヤギ抗ラットIgG(H + L)二次抗体、Alexa Fluor 555</td>フィ<td>ッシャー科学</td><td>10635923</td><td>二次抗体</td></tr><tr><td>ロバ抗マウスIgG(H + L)二次抗体、Alexa Fluor 647</td>フィ<td>ッシャー科学</td><td>10226162</td><td>二次抗体</td></tr><tr><td>テトラスペックマイクロスフィア、0.1 & micro;m、蛍光ブルー/グリーン/オレンジ/ダークレッド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>T7279</td><td>蛍光ビーズ</td></tr><tr><td>チャムライド 磁気チャンバー</td><td>ライブセル機器</td><td>CM-B18-1</td><td>磁気サンプルホルダー、最大容量 1,2 mL</td></tr><tr><td>システアミン (MEA)</td> <td>シグマ</td><td>30070</td><td>点滅バッファー用</td></tr><tr><td>アスペルギルス・ニジェールからのグルコースオキシダーゼ</td><td>シグマ</td><td>G0543</td> 点滅<td>バッファー用</td></tr><tr>ウシの肝臓からの<td>まばたき緩衝液</td>カタラーゼのための<td>グルコース</td><td>シグマ</td><td></td></tr> 点滅<tr><td>緩衝液</td>のための<td></td><td>シグマ</td><td>C9322</td></tr><tr><td>トリス(trizma)</td>点滅<td>緩衝液のための</td><td>シグマ</td><td>T1503</td></tr><tr><td>ウォッシュNドライカバースリップラック</td><td>シグマ</td><td>Z688568</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>シグマ</td><td>P7793-1EA</td><td>パラフィンフィルム</td></tr><tr><td>超音波洗浄機</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>15-335-6</td><td></td></tr><tr><td>プラズマクリーナー</td><td>ハリックプラズマ</td><td>PDC-32G-2</td><td></td></tr></tbody></table>

中間径フィラメントと微小管 2次元直接確率光再構成顕微鏡イメージング

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

アクチン フィラメント、微小管、中間径フィラメント (場合) から成る骨格はセルの形状、極性・細胞運動の制御に重要な役割を果たしています。微小管とアクチン ネットワークの組織が広く研究されていますが、IFs のまだ完全に特徴付けられない。IFs は、細胞の細胞質に広がるネットワーク 10 nm とフォームの平均直径を有する。アクチンと微小管分子モーター、細胞骨格のリンカーを物理的に関連付けられています。このタイトな関連付けは、ほとんどの細胞機能に必要な 3 つの細胞骨格ネットワークの連携制御機構を確保する規制メカニズムの核心です。したがって、If だけで、また一緒にそれぞれの他の骨格のネットワークを可視化することが重要です。ただし、場合ネットワークはほとんどの細胞の種類、グリア細胞の特に中に非常に密な解像度に標準の蛍光顕微鏡と達成するために非常に困難なる (~ 250 の解像度を横 nm)。直接確率光再建顕微鏡 (dSTORM) はゲイン 1 桁の水平解像度で可能にする技法です。ここでは、横 dSTORM 解像度ある場合ネットワークの特に、もし束周囲の微小管の密な組織を解決するための十分なことを示します。このような緊密な関連が説明する、これら 2 つのネットワークの連携制御機構に参加する可能性がどのようにビメンチン IFs テンプレートと微小管の組織を安定させると同様、微小管依存の小胞輸送に影響を与える可能性があります。もっと一般に、デュアル カラー dSTORM 技術 2 つの細胞骨格成分の観測が彼らの相互作用に新しい洞察力をもたらす方法を示す.

アルファ Plan Apo 100 X 512 x 512 カメラ 50 mW 405 nm と 100 mW 488、561、642 nm 固体レーザ、EMCCD 搭載顕微鏡/570 650 を渡す/655 放出フィルターがロングパス 1.46 の目標とバンド以下に示す代表的な結果を得るのために使用されました。
図 1 aは、対雑音比 raw 画像取得時に使用する分子密度と信号の例を与えます。良い品質の画像は、隣接分子間 〜 1 μ m の最小値が得られます。良い点滅状態で fluorophores が付いてはのみ 1 つのフレーム内に存在する必要があります。画像バッファー条件 (pH、還元剤、酸素システムを消去) を調整する必要があります良い点滅とレーザーに- とオフ-料金の蛍光物質したがって、義務に影響を及ぼすサイクル (、fluorophore に費やしている時間の割合オン状態)<su...

この方法論の全体的な目標は、固定細胞における微小管、中間径フィラメントの 2D デュアル カラー dSTORM イメージを実行するために、画像の獲得および復興にサンプル準備から最適な実験条件を与えるには

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

この方法論の全体的な目標は、固定細胞内の微小管と中間フィラメントの2DデュアルカラーD-STORMイメージングを実行するために、サンプル調製から画像取得および再構成まで最適な実験条件を作成することです。この方法は、中間フィラメントや微小管などの高密度および複雑な細胞骨格ネットワーク間の物理的相互作用を特徴付けるのに役立ちます。この技術の主な利点は、従来の蛍光顕微鏡では解決できない細胞構造の観察を可能にすることです。アーティファクトの発生を制限するためには、サンプル調製の制御とローブリンキングデータの取得が重要であるため、この方法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。テキストプロトコルに従ってU373細胞を増殖させた後、まずPBSを使用して細胞を固定し、細胞を一度洗浄します。次に、PBSを取り外し、予熱した抽出固定液のウェルごとに1ミリリットルを追加します。細胞を室温で60秒間インキュベートします。次に、溶液を取り出し、新たに調製して予熱した4%PFAを細胞骨格緩衝液で希釈したウェルあたり1ミリリットルを加えます。12ウェルプレートを摂氏37度のインキュベーターに10分間戻します。次に、PFAを取り出し、ウェルごとに3ミリリットルのPBSを追加します。PBSを使用して細胞を2回洗浄します。次に、PBSを取り外し、グルタルアルデヒドからの自家蛍光を消光するために、PBSで希釈した新たに調製した10ミリモルの水素化ホウ素ナトリウムを追加します。細胞を室温で7分間インキュベートし、リサイクルされた水素化ホウ素ナトリウムを特定のビンに移します。PBSを使用して、ウェルを3回、それぞれ5分間洗浄します。次に、PSBを取り外し、ブロッキングソリューションとしてPBSに5%BSAを追加します。サンプルを免疫染色し、テキストプロトコールに従ってバッファー中の溶液を調製した後、標識細胞を含むカバーガラスを磁気サンプルホルダーにマウントします。そして、イメージングバッファーを追加して、チャンバーを完全に満たします。蓋をして、イメージングバッファーと蓋の間に気泡がないことを確認します。無水エタノールを使用して、サンプルの底を清掃し、漏れがないことを確認します。次に、必要に応じてグリースを使用してサンプルホールドを適切にシールします。イメージングを行うには、顕微鏡と取得ソフトウェアのスイッチを入れます。100倍NA 1.46対物レンズ、1.6倍Optivarレンズ、およびTIRF UHPモードを使用して、テキストプロトコルに従って取得パラメータを設定します。647トラックを作成して、Alexa Fluor 647でラベル付けされたビメンチンフィラメントを画像化します。405ナノメートルおよび642ナノメートルレーザーラインとLP655発光フィルターを選択します。次に、55

imaging-intermediate-filaments-microtubules-with-2-dimensional-direct

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は高速3D生細胞の蛍光顕微鏡および高分解能低温電子断層撮影法を組み合わせた相関顕微鏡法を記載している。我々はダイナミックイメージング、宿主HeLa細胞との相互作用小HIV-1粒子による相関法の能力を実証する。...

ダイナミックな相互作用の3次元構造解析のための相関顕微鏡

生細胞内の動的タンパク質に関する時空間的な情報は、生物学を理解するために非常に重要です。高速3D構造化照明顕微鏡(f3D-SIM)と呼ばれる超解像顕微鏡の一種は、細菌の細胞動態Zリングに関するユニークな情報、つまりそのビーズ状の外観とリング内のFtsZの急速なダイナミクスの両方を明らかにします。...

高速3D-構造化照明顕微鏡（F3D-SIM）を使用したライブ細菌における細胞質分裂のZリングの超解像イメージング

T細胞免疫シナプスにおける糸状アクチンの流れ速度と方向性を調査するために、生細胞の超解像イメージングと全反射蛍光を組み合わせ、時空間画像相関分光法で定量化します。...

構造化照明顕微鏡データの時空間画像相関分光法により定量化したT細胞における皮質アクチンの流れ

私たちは、接着性、哺乳動物細胞におけるアクチン細胞骨格のイメージングに、干渉光活性化ローカライゼーション顕微鏡（iPALM）、3次元の単一分子の局在超解像顕微鏡法の適用のためのプロトコルを提示します。このアプローチは、そうでなければ、従来の回折限界光学顕微鏡で未解決のままであるナノスケールの構造的特徴の光ベースの可視化を可能にします。...

干渉光活性化ローカライゼーション顕微鏡（iPALM）によってF-アクチンフィラメントの三次元超解像顕微鏡

このプロトコルは、インビトロ表面アッセイを用いて微小管の無標識、高コントラスト、高速イメージングのための標準的な蛍光顕微鏡上の干渉反射顕微鏡を実装するためのガイドです。...

微小管のラベルフリー高速イメージングのための干渉反射顕微鏡の実装

チップベースの超分解能光学顕微鏡は、蛍光顕微鏡検査の新しいアプローチであり、費用対効果とスループットの利点を提供します。ここでは、チップ調製およびイメージングのためのプロトコルをTIRF顕微鏡および局在化ベースの超解像顕微鏡用に示す。...

フォトニックチップを用いたハイスループット全内部反射蛍光と直接確率光学再構成顕微鏡

直接確率的光学再構成顕微鏡(dSTORM)は、光顕微鏡の典型的な回折限界をバイパスし、ナノメートルスケールでエキソソームを見るために使用されます。エキソソームを特徴付けるために2次元と3次元の両方で採用することができます。...

細胞外小胞の直接確率的光学再構成顕微鏡

ここでは、TIRF顕微鏡ベースの インビトロ...

TIRF顕微鏡による インビトロでの 架橋小管と単一微小管のダイナミクスの同時可視化

我々は、動的微小管および蛍光標識微小管関連タンパク質の同時イメージングのための干渉反射顕微鏡および全内部反射蛍光顕微鏡を実施するためのプロトコルを提示する。...

動的微小管および関連タンパク質をイメージングするための同時干渉反射および全内部反射蛍光顕微鏡

差動動的顕微鏡(DDM)は、動的光散乱と顕微鏡の機能を兼ね備えています。ここでは、DDMを使用して、ビメンチンネットワーク内の粒子の亜拡散およびケージドダイナミクスおよび活性ミオシン駆動アクチン - 微小管複合体の弾道運動を定量化することによって、再構成された細胞骨格ネットワークを特徴付けるプロセスを提示する。...

微分動的顕微鏡を用いた細胞骨格ダイナミクスの定量化

このプロトコルでは、単一対物レンズのライトシート蛍光顕微鏡の構築方法と、細胞骨格ネットワークを可視化するためのその使用法について詳しく説明します。...

細胞骨格ネットワークの可視化のためのカスタマイズ可能な単一対物レンズライトシート蛍光顕微鏡の設計と構築

学ぶ 2次元デュアルカラーdSTORMイメージング法で固定細胞内の微小管と中間径フィラメントを高分解能で可視化する手法。U373細胞を用いて細胞骨格ネットワークの相互作用を解析し、従来の蛍光顕微鏡では解像できない構造を観察できる。

中間径フィラメントと微小管 2次元直接確率光再構成顕微鏡イメージング

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