Name: 中間径フィラメントと微小管 2次元直接確率光再構成顕微鏡イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: 学ぶ 2次元デュアルカラーdSTORMイメージング法で固定細胞内の微小管と中間径フィラメントを高分解能で可視化する手法。U373細胞を用いて細胞骨格ネットワークの相互作用を解析し、従来の蛍光顕微鏡では解像できない構造を観察できる。

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ミカエル ・ Lelek、オレシティス Faklaris と有意義な議論のニコラス ・城下町、アンドレイ Aristov と超解像技術のヘルプについてエレナ練とシャイラージャ ・ Seetharaman 原稿の注意深い読書のために感謝します感謝するフランス国立研究機関 (ANR 10 INSB 04; サポート フランス バイオ イメージング インフラストラクチャ ネットワークと同様、UtechS フォトニック バイオ イメージング (Imagopole) Citech のパスツール研究所 (パリ, フランス)未来への投資)、および地方イル (ドメーヌ d プログラム ' 水利 Majeur Malinf) Elyra 顕微鏡の使用のため。この仕事に支えられ、リーグ Contre le がんとフランス国立研究機関 (ANR-16-CE13-0019)。

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<li>Skalli, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytoma+grade+IV+%28glioblastoma+multiforme%29+displays+3+subtypes+with+unique+expression+profiles+of+intermediate+filament+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Astrocytoma grade IV (glioblastoma multiforme) displays 3 subtypes with unique expression profiles of intermediate filament proteins.</a> Hum Pathol. 44 (10), 2081-2088 (2013).</li>
<li>Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+estimate+the+average+localization+precision+of+a+single-molecule+localization+microscopy+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment.</a> Histochem Cell Biol. 141 (6), 629-638 (2014).</li>
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<li>Olivier, N., Keller, D., Gonczy, P., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+doubling+in+3D-STORM+imaging+through+improved+buffers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Resolution doubling in 3D-STORM imaging through improved buffers.</a> PLoS One. 8 (7), e69004(2013).</li>
<li>Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Imaging+Conditions+for+Demanding+Multi-Color+Super+Resolution+Localization+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy.</a> PLoS One. 11 (7), e0158884(2016).</li>
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<li>Mikhaylova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+bundled+microtubules+using+anti-tubulin+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies.</a> Nat Commun. 6, 7933(2015).</li>
<li>Nieuwenhuizen, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+image+resolution+in+optical+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Measuring image resolution in optical nanoscopy.</a> Nat Methods. 10 (6), 557-562 (2013).</li>
<li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nprot.2017.024">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li>
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プロトコルの重要なステップ
微小管の dSTORM 画像内のアーティファクトとグリア細胞における IFs を最小にするプロトコルをご紹介します。サンプル準備およびイメージ投射の各ステップでの成果物を作成できます: 固定、ブロック、反応、ドリフトの買収により、非最適な点滅条件23。我々 は、最も重要な手順以下リストします。
表面に蛍光物質の非特異的結合を制限する重要なステップは、クリーニング、coverslips したがって dSTORM 画像の背景ノイズを制限します。
PFA (パラホルムアルデヒド) (ステップ n ° 3) とグルタールアルデヒドとトリトン、および固定のミックスを使用して抽出し、固定のソリューションの手順とサンプルを修正お勧めします。固定のプロトコルは、Chazeau et al12から適応された: 我々 は 60 に抽出/...

細胞の中間径フィラメント (IFs) は、直径 10 nm のヒト - または場合蛋白質の特定のサブセットを携帯型の heteropolymers です。IFs は、細胞運動、増殖やストレス応答など細胞機能の広い範囲に参加します。その重要な役割が 90 以上の人間の病気直接場合蛋白質で突然変異によって引き起こされるという事実によって強調表示されます。例えば、腫瘍の増殖および1,2,3を広める場合組成の変化を伴います。細胞の極性形成、部門と移行2,3などの細胞機能を制御する共同で 3 つの骨格システムが働くという証拠が高まっています。建築の空間と機能の間の密結合なので、他のフィラメントの場合の構造への洞察力を得るし、細胞骨格のクロストークを理解することが重要です。この記事は、超解像技術のデュアル カラー dSTORM (直接確率再建顕微鏡)4との間の相互作用を調査する使用方法と微小管を実行するプロトコルを提供しますで固定、培養2 次元 (2 D) 内のセル。
いくつかの超解像技術は、過去に開発されている年とそこ発見 2014年5ノーベル化学賞の原点であった。これらすべての方法の間であるパーム6 (Photo-Activated ローカリゼーション顕微鏡) スイッチング蛍光タンパク質を使用して嵐7 fluorophores が付いてまたは dSTORM4 のペアのような単一分子局在に基づく方法従来 fluorophores が付いています。ローカライズするためにこれらすべてのメソッドは、「オフ」状態に (i) 蛍光レポーターのほとんどのスイッチから成っている同じ原理に基づいています」(非蛍光灯)、(ii) それらのサブセットを蛍光の確率論的活性化状態のナノメートル精度、および (iii) できるだけ fluorophores の多くのサブセットをアクティブにするためにこのプロセスの繰り返しと空間的な位置。最終的なイメージは、20 ~ 40 までの横方向の分解能を提供する活性化分子のすべてのローカライズを使用して再構築されます nm。パーム/嵐をできるようにいくつか商品化された光学系のルーチンの実験のための生物学者に今あります。ここでは、1 つのようなシステムは微小管と IFs の結合構造を研究に使用されました。非常に薄い層状の領域を観察する最適ですのですべて単一分子局在ベースのメソッドの間でデュアル カラー dSTORM 手法が選ばれた (< 1 μ m) 付着性のセルの画像解像度の大幅な改善を提供することができます、最小限の時間とお金の投資。確かに、dSTORM は、細胞染色と蛍光抗体法により定期的に使用される標準的な有機色素と互換性がある非常に便利な汎用性の高いテクニックです。
限られている場合は特に、選択バッファーに正しく 2 つの染料が点滅する場合もあるので、実験の条件を最適化する必要がありますデュアル カラー dSTORM 1色 dSTORM 画像は Alexa6478蛍光体を使用して取得する比較的簡単なレーザー パワー。優秀な論文は dSTORM9,10、11,12,13, マルチカラー イメージングをセットアップする方法に使用されておりこれらの書類は、詳細に説明の可能なソース成果物と劣化画像の解像度だけでなく、それらを克服する方法。この記事は、細胞の固定、染色、サンプル準備の面で最適な実験条件、画像取得と画像再構成が密な細胞質場合ネットワークと微小管の画像を得るために説明デュアル カラー dSTORM とグリア細胞。簡単に言えば、Chazeau ら12の抽出/固定方法がグリア細胞に適応されポスト固定ステップ、最適化された抗体濃度で使用、10 ミリメートルと嵐バッファー MEA の記載したデンプシー9ら実験のセットアップとサンプル タイプに最適なことが判明します。
グリア細胞は主に 3 種類の場合はタンパク質を表現: ビメンチン、ネスチンと GFAP (グリア細胞の酸性タンパク質の線維性)。これらの 3 つのタンパク質は、アストロ サイト14共重合に示されていた。我々 は以前超解像の構造化照明顕微鏡 (SR SIM) 同じ単一の場合フィラメントのこれらの 3 つの場合の蛋白質を見つけることができます、グリア細胞15と同様の分布と動態表示ことを示した。3 の場合蛋白質の間の類似点のため全体の場合ネットワークの腔は使用レポーターとして。DSTORM を使用すると、回折では不可能でしたが微小管に沿って場合フォーム バンドルが顕微鏡技術15に限られた解決することができた。これらの観察は、ビメンチン IFs にテンプレート微小管ことができる方法を理解し、彼らの成長の軌道の細胞移行16中極性軸の整備を推進を規制できます。超解像画像 2 つの細胞骨格サブシステムの相互作用に重要な情報を提供し、空間協会とセル型特定17となるローカル関数間のリンクへの洞察力をもたらした。一般に、密度と特異性の面で条件が良い染色に達した、デュアル カラー dSTORM を骨格要素やその他の細胞小器官間のクロストークを勉強する使用できます。この手法は膠芽腫と星の中に、細胞骨格の変化を特徴付けるより役に立つでしょう、最も一般的なと最も悪性の腫瘍の場合蛋白質の表現が、中枢神経系の変更18 、19,20,21。

<table><tbody><tr><td>最小必須培地(MEM)</td><td>Gibco</td><td>41090-028</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>Gibco</td><td>1140-050</td><td>細胞培養 1/100e</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>細胞培養 1/100e</td></tr><tr><td>F&oE;タルウシ血清</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>細胞培養 1/10e</td></tr><tr><td>0,05 % トリプシン-EDTA (1X)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>フィッシャー 科学</td><td>11540486</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>カバースリップ 18 mm n&deg;1,5H</td><td>マリエンフィールド/ドミニク・ダッチャー</td><td>900556</td><td>カバースリップ</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド(PFA)溶液</td><td>シグマ</td><td>F8775</td><td>細胞固定</td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td>シグマ</td><td>G5882</td><td>細胞固定</td></tr><tr><td>トリトン X100</td><td>シグマ</td><td>T9284</td><td>非イオン性界面活性剤。細胞固定に使用</td></tr><tr><td>水素化ホウ素ナトリウム(NaBH4)</td>シ<td>グマ</td><td>452904-25ML</td>、<td>細胞固定</td></tr><tr><td>BSA</td><td>シグマ</td><td>A7906</td><td>サンプル不動態化 PBS中の3%</td></tr><tr><td>モノクローナル 抗ビメンチン(V9)マウスで産生</td>された抗体 <td>シグマ</td><td>V6630</td><td>一次抗体</td></tr> ラット<tr><td>抗アルファチューブリン</td><td>バイオラッド</td><td>MCA77G</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>ヤギ抗ラットIgG(H + L)二次抗体、Alexa Fluor 555</td>フィ<td>ッシャー科学</td><td>10635923</td><td>二次抗体</td></tr><tr><td>ロバ抗マウスIgG(H + L)二次抗体、Alexa Fluor 647</td>フィ<td>ッシャー科学</td><td>10226162</td><td>二次抗体</td></tr><tr><td>テトラスペックマイクロスフィア、0.1 & micro;m、蛍光ブルー/グリーン/オレンジ/ダークレッド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>T7279</td><td>蛍光ビーズ</td></tr><tr><td>チャムライド 磁気チャンバー</td><td>ライブセル機器</td><td>CM-B18-1</td><td>磁気サンプルホルダー、最大容量 1,2 mL</td></tr><tr><td>システアミン (MEA)</td> <td>シグマ</td><td>30070</td><td>点滅バッファー用</td></tr><tr><td>アスペルギルス・ニジェールからのグルコースオキシダーゼ</td><td>シグマ</td><td>G0543</td> 点滅<td>バッファー用</td></tr><tr>ウシの肝臓からの<td>まばたき緩衝液</td>カタラーゼのための<td>グルコース</td><td>シグマ</td><td></td></tr> 点滅<tr><td>緩衝液</td>のための<td></td><td>シグマ</td><td>C9322</td></tr><tr><td>トリス(trizma)</td>点滅<td>緩衝液のための</td><td>シグマ</td><td>T1503</td></tr><tr><td>ウォッシュNドライカバースリップラック</td><td>シグマ</td><td>Z688568</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>シグマ</td><td>P7793-1EA</td><td>パラフィンフィルム</td></tr><tr><td>超音波洗浄機</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>15-335-6</td><td></td></tr><tr><td>プラズマクリーナー</td><td>ハリックプラズマ</td><td>PDC-32G-2</td><td></td></tr></tbody></table>

中間径フィラメントと微小管 2次元直接確率光再構成顕微鏡イメージング

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

アクチン フィラメント、微小管、中間径フィラメント (場合) から成る骨格はセルの形状、極性・細胞運動の制御に重要な役割を果たしています。微小管とアクチン ネットワークの組織が広く研究されていますが、IFs のまだ完全に特徴付けられない。IFs は、細胞の細胞質に広がるネットワーク 10 nm とフォームの平均直径を有する。アクチンと微小管分子モーター、細胞骨格のリンカーを物理的に関連付けられています。このタイトな関連付けは、ほとんどの細胞機能に必要な 3 つの細胞骨格ネットワークの連携制御機構を確保する規制メカニズムの核心です。したがって、If だけで、また一緒にそれぞれの他の骨格のネットワークを可視化することが重要です。ただし、場合ネットワークはほとんどの細胞の種類、グリア細胞の特に中に非常に密な解像度に標準の蛍光顕微鏡と達成するために非常に困難なる (~ 250 の解像度を横 nm)。直接確率光再建顕微鏡 (dSTORM) はゲイン 1 桁の水平解像度で可能にする技法です。ここでは、横 dSTORM 解像度ある場合ネットワークの特に、もし束周囲の微小管の密な組織を解決するための十分なことを示します。このような緊密な関連が説明する、これら 2 つのネットワークの連携制御機構に参加する可能性がどのようにビメンチン IFs テンプレートと微小管の組織を安定させると同様、微小管依存の小胞輸送に影響を与える可能性があります。もっと一般に、デュアル カラー dSTORM 技術 2 つの細胞骨格成分の観測が彼らの相互作用に新しい洞察力をもたらす方法を示す.

アルファ Plan Apo 100 X 512 x 512 カメラ 50 mW 405 nm と 100 mW 488、561、642 nm 固体レーザ、EMCCD 搭載顕微鏡/570 650 を渡す/655 放出フィルターがロングパス 1.46 の目標とバンド以下に示す代表的な結果を得るのために使用されました。
図 1 aは、対雑音比 raw 画像取得時に使用する分子密度と信号の例を与えます。良い品質の画像は、隣接分子間 〜 1 μ m の最小値が得られます。良い点滅状態で fluorophores が付いてはのみ 1 つのフレーム内に存在する必要があります。画像バッファー条件 (pH、還元剤、酸素システムを消去) を調整する必要があります良い点滅とレーザーに- とオフ-料金の蛍光物質したがって、義務に影響を及ぼすサイクル (、fluorophore に費やしている時間の割合オン状態)<su...

この方法論の全体的な目標は、固定細胞における微小管、中間径フィラメントの 2D デュアル カラー dSTORM イメージを実行するために、画像の獲得および復興にサンプル準備から最適な実験条件を与えるには

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

この方法論の全体的な目標は、固定細胞内の微小管と中間フィラメントの2DデュアルカラーD-STORMイメージングを実行するために、サンプル調製から画像取得および再構成まで最適な実験条件を作成することです。この方法は、中間フィラメントや微小管などの高密度および複雑な細胞骨格ネットワーク間の物理的相互作用を特徴付けるのに役立ちます。この技術の主な利点は、従来の蛍光顕微鏡では解決できない細胞構造の観察を可能にすることです。アーティファクトの発生を制限するためには、サンプル調製の制御とローブリンキングデータの取得が重要であるため、この方法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。テキストプロトコルに従ってU373細胞を増殖させた後、まずPBSを使用して細胞を固定し、細胞を一度洗浄します。次に、PBSを取り外し、予熱した抽出固定液のウェルごとに1ミリリットルを追加します。細胞を室温で60秒間インキュベートします。次に、溶液を取り出し、新たに調製して予熱した4%PFAを細胞骨格緩衝液で希釈したウェルあたり1ミリリットルを加えます。12ウェルプレートを摂氏37度のインキュベーターに10分間戻します。次に、PFAを取り出し、ウェルごとに3ミリリットルのPBSを追加します。PBSを使用して細胞を2回洗浄します。次に、PBSを取り外し、グルタルアルデヒドからの自家蛍光を消光するために、PBSで希釈した新たに調製した10ミリモルの水素化ホウ素ナトリウムを追加します。細胞を室温で7分間インキュベートし、リサイクルされた水素化ホウ素ナトリウムを特定のビンに移します。PBSを使用して、ウェルを3回、それぞれ5分間洗浄します。次に、PSBを取り外し、ブロッキングソリューションとしてPBSに5%BSAを追加します。サンプルを免疫染色し、テキストプロトコールに従ってバッファー中の溶液を調製した後、標識細胞を含むカバーガラスを磁気サンプルホルダーにマウントします。そして、イメージングバッファーを追加して、チャンバーを完全に満たします。蓋をして、イメージングバッファーと蓋の間に気泡がないことを確認します。無水エタノールを使用して、サンプルの底を清掃し、漏れがないことを確認します。次に、必要に応じてグリースを使用してサンプルホールドを適切にシールします。イメージングを行うには、顕微鏡と取得ソフトウェアのスイッチを入れます。100倍NA 1.46対物レンズ、1.6倍Optivarレンズ、およびTIRF UHPモードを使用して、テキストプロトコルに従って取得パラメータを設定します。647トラックを作成して、Alexa Fluor 647でラベル付けされたビメンチンフィラメントを画像化します。405ナノメートルおよび642ナノメートルレーザーラインとLP655発光フィルターを選択します。次に、555トラックを作成して、Alexa Fluor 555で標識された微小管を画像化します。561、488、405ナノメートルのレーザーラインを選択して、蛍光色素とBP 570〜650蛍光フィルターをイメージングします。次に、対物レンズにオイルを加え、サンプルをレンズに置きます。次に、[位置]タブを選択し、蛍光ランプのシャッターを開きます。ピントを見つけ、接眼レンズを使用して、画像化する細胞を探します。次に、ジョイスティックを使用して、セルをフィールドの中央に配置します。取得タブをクリックして、取得モードに戻ります。次に、647トラックを選択し、642レーザー出力を0.2%に設定し、405レーザー出力を最小値に設定します。露光時間を 50 ミリ秒に、ゲインを 50 に設定します。次に、連続取得モードを選択して、画面上のセルを観察します。視野内に少なくとも1つの蛍光ビーズがあることを確認してください。ディスプレイに自動スケールモードを使用し、フォーカスを調整します。次に、スナップをクリックしてビメンチンネットワークの広視野落射蛍光画像を撮影し、画像を保存します。TIRFの照明を確認するには、TIRFをクリックし、連続を押して、均一な照明フィールドを持つために取得パラメータを調整します。次に、スナップを押して画像を保存します。555トラックを確認してください。647 トラックのチェックを外し、555 トラックを選択します。微小管ネットワークの落射蛍光画像を撮影し、保存します。次に、TIRF画像を撮って保存します。次に、647トラックを確認します。555 トラックのチェックを外し、647 トラックを選択します。ゲインを 0 に、露光時間を 10 ミリ秒に設定します。次に、連続を押します。642ナノメートルのレーザー出力を100%に設定して、ほとんどのAlexa 647色素を暗い状態に送り込みます。蛍光色素が点滅し始めたら、曝露を 15 ミリ秒に増やし、ゲインを 300 に増やします。範囲インジケーターモードを使用して、赤色で示されているように、単一分子の信号がカメラを飽和させないことを確認します。その場合は、彩度が消えるまでゲインを下げます。ビーズは、取得の開始時に飽和したままです。ストップを押すと、セルの観察が中止されます。オンライン処理ツールを展開し、[オンライン処理 PALM] をクリックして、取得中の STORM 画像を視覚化します。ピークマスクサイズには9を使用し、ノイズに対するピーク強度には6を使用します。次に、取得の開始を押します。取り込み中は、必要に応じてセルに再度焦点を合わせます。露光時間を調整し、最終的に0.001%から始まる405ナノメートルのレーザーラインをオンにして、単一分子間の最小距離1マイクロメートルで中密度の蛍光色素を維持します。再構成された画像の下のヒストグラムのローカリゼーション精度のピークが、10 ナノメートル付近またはそれ以下の中心にあることを確認します。100 万を超えるローカリゼーションに達したときにムービーを終了するには、stop キーを押します。STORM集録の生データをCZI形式で保存します。次に、チャネルツールでトラック555をチェックし、トラック647のチェックを外して、トラック555を選択します。次に、連続ボタンを押します。露光時間を 30 ミリ秒に、ゲインを 0 に設定します。次に、488レーザーと561レーザーの両方を100%に設定して、Alexa 555色素をダークステートにポンピングします。HILO モードのイルミネーションを使用します。蛍光色素がなくなったら、stopを押します。ゲインを250に設定し、488レーザーを50%に減らします範囲インジケーターを使用して、単一分子がカメラを飽和させないことを確認します。その場合は、ゲインを下げてください。次に、取得の開始を押します。取得中は、飽和の限界に達するまでゲインを徐々に増やします。405ナノメートルのレーザー出力を段階的に増やして、分子を活性化し、視野内で中密度に到達します。405レーザーが約15%のときに488ナノメートルのレーザー出力を30%に減らし、分子の点滅をできるだけ速く、中密度に保つために、405レーザーの出力を増やしながら488を徐々に減らします。488レーザーラインと最大強度の561励起レーザーの組み合わせは、蛍光色素のオンとオフの両方の速度を増加させますが、405レーザーラインはオン速度を増加させるだけです。500, 000 以上の局在化に達したとき、またはそれ以上の分子が点滅しなくなったときに、取得を停止します。次に、STORM集録の生データをCZI形式で保存します。PAL-Driftツールを使用して画像の再構成を実行するには、最大サイズが8つの自動セグメントを持つモデルベースの補正タイプを選択します。ドリフトが修正されるまで、applyを連続して複数回押します。このモデルベースの補正では、相互相関分析に基づくアルゴリズムが適用され、ドリフトが修正されます。PALフィルターツールを使用して、最も局在化した分子のみを選択することで、STORM画像の外観を改善します。たとえば、位置推定精度を 30 ナノメートルに制限し、PSF を 120 ナノメートルから 180 ナノメートルに制限します。PAL-Renderツールでは、5ナノメートルまたは10ナノメートルのピクセル解像度とテキストプロトコルに応じたパラメータを使用します。「95%の値で自動ダイナミックレンジHRをレンダリング」を選択し、90%の値で自動ダイナミックレンジSWFをレンダリングします。次に、[最高品質でレンダリング]を選択します。[処理] タブの [PALM] メニューで、[PALM 変換] を選択します。select を押してから適用します。最後に、作成した画像をCZIではなくLSM形式で保存します。この図は、Alexa 647で免疫標識したビメンチンフィラメントのD-STORM画像の典型的な例を示しています。解像度の向上は、標準的な広視野顕微鏡で取得した画像と比較するとはっきりと観察できます。このグラフに示されている蛍光強度プロファイルは、超解像顕微鏡イメージングによりビメンチンバンドルの分離が可能になることを示しています。D-STORMの分解能は、バンドル内に存在するフィラメントの数をカウントするのに十分です。ここに示されているのは、Alexa 647およびAlexa 555で免疫標識されたビメンチンおよび微小管ネットワークのデュアルカラーD-STORMイメージングの典型的な例です。良好なビメンチン画像は、マイクロメートルの二乗あたり少なくとも5, 000の局在化、微小管のマイクロメートルの二乗あたり2, 500の局在化を持つ必要があります。一度習得すれば、このテクニックは適切に実行されれば3日で完了することができます。この手順を試みる際には、画像化するタンパク質に固定とパラメータ化の方法を適応させることが重要です。例えば、グルタルアルデヒドのみによる固定は、中間フィラメントでは不十分な結果をもたらしますが、微小管の固定には最適です。調製したばかりのサンプルと溶液、特にpHを慎重に調整する必要があるMEAを使用することを忘れないでください。その開発後、この技術は、細胞生物学の分野の研究者がナノスケールの細胞構造の形態を探求する道を開きました。このビデオを見れば、サンプル調製、画像取得、中間フィラメントと微小管の2DデュアルカラーD-STORM画像の再構成を行う方法について十分に理解できるはずです。一部の溶液、特にPFA、NABH4の取り扱いは非常に危険であり、この手順を実行する際には、手袋の着用、化学フードの下での作業、特定のビンの使用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

imaging-intermediate-filaments-microtubules-with-2-dimensional-direct

Research

JoVE Journal

Biology

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学ぶ 2次元デュアルカラーdSTORMイメージング法で固定細胞内の微小管と中間径フィラメントを高分解能で可視化する手法。U373細胞を用いて細胞骨格ネットワークの相互作用を解析し、従来の蛍光顕微鏡では解像できない構造を観察できる。

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