Name: 人間の女性の生殖器官から樹状細胞の表現型および機能研究の分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: 学ぶ 人間女性生殖道から樹状細胞を分離する手法。表面マーカーを保持したまま即座に単離でき、表現型と機能解析が可能です。他の免疫細胞や組織への応用も期待されます。

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NIH がサポートした調査は、AI102838、AI117739 (CRW) を付与します。リチャード ・ Rossoll は、技術支援を感謝いたします。DartLab、Dartmouthsupported (P30CA023108 - 37) と (P30GM103415-15) で共有リソースのフローサイトメトリーによる解析を行った。

ヒトを対象研究は、ヘルシンキ宣言の表現の原則に基づき実施されました。研究は、ダートマス大学治験審査委員会との人間被験者保護 (CPHS) の委員会によって承認されました。書面によるインフォームド コンセントは、ダートマス Hitchcock 医療センター (レバノン、ニューハンプシャー) で子宮を受ける HIV 陰性女性から術前に得られました。訓練を受けた病理医は、EM、CX、ECX には、病変と病理のサイトから遠いから組織サンプルを選択しました。ダートマス Hitchcock 医療センターで募集されたボランティアの健康なドナーから血液サンプルを得た。献血者は匿名だった。手術室から新鮮単離の EM、CX、ECX の組織は、分離と分類以前独立した滅菌ポリプロピレン チューブの研究室に転送するために移されました。
1 組織の酵素の消化力
注: 滅菌材料を使用し、生物学的安全キャビネットで働きます。
<ol><li>変更されたハンクのバランスの取れた塩ソリューション (HBSS) 1 x HBSS を用いたフェノール赤、100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン、0.35 g/L NaHCO3、および 20 mM HEPES を準備します。</li>
	<li>酵素カクテルを準備 (2 mg/mL D-グルコース ・ HBSS、450 U/mL コラゲナーゼ IV, 0.01% [wt/巻] デオキシリボヌクレアーゼに変更)。ソリューションを滅菌 0.22 μ m フィルターを通過します。理想的には、消化酵素を使用、当日準備が、ストレージの-20 ° C で凍結することができます。繰り返しの凍結と融解の繰り返しは避けてください。</li>
	<li>変更された HBSS 100 × 15 mm2シャーレ内の場所と組織をすすいでください。利用可能な組織の量に基づくシャーレ サイズと使用される酵素カクテルのボリューム調整 (1.4.2 以下の手順を参照してください)。 注: 組織は、1 10 g に至る理から得られる手術のサンプルによってサイズが異なります。</li>
	<li>使い捨てメスと鉗子の物理的な処理:<ol>
<li>切削しながら乾燥を防ぐためにティッシュに消化酵素カクテル約 3 mL を追加します。</li>
		<li>組織を安定化し、カクテルの消化酵素にさらされている組織の表面積を高めるためメスでミンチに鉗子を使用します。小さな断片 (側の < 2 mm) に組織を切断します。すべての組織の部分 (組織の 5 mL/g) をカバーする十分な消化酵素カクテルを追加します。シャーレに蓋を配置します。</li>
		<li>45 分回転速度は徹底的にこぼしたり、泡を生産せず消化酵素カクテルをミックス確認のため約 80 rpm で回転上 5% CO2と 37 ° C で孵化させなさい。</li>
		<li>4 X を倒立顕微鏡で組織の準備作業と 10 X 目標を視覚化します。 注: 消化力の後小さな組織片と見える上皮腺を含む混合細胞懸濁液になければならない (図 1A参照)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2 単一のセルの物理的な分離
<ol><li>無菌環境で 150 × 15 mm2シャーレにホルダーにピンと張った 250 μ m メッシュを配置します。メッシュがペトリ皿の表面上約 0.5 cm であることを確認します。</li>
	<li>ウェットは 2 ml の変更された HBSS のメッシュとメッシュに消化組織を転送します。</li>
	<li>10 mL シリンジのプランジャーの平らな面を使用して、優しく、しっかりと、挽くメッシュを通して消化みじん切りにした組織です。 注意: 研削も積極的にメッシュを損傷し、細胞の死亡率を高めます。この手順は、結合組織、粘液から上皮細胞と間質細胞 (免疫細胞を含む) が分離されます。</li>
	<li>組織片を徹底的に分散させた、一度昇格メッシュとホルダー上にペトリ皿 3 mL でリンス 2 ~ 3 cm 変更 HBSS で追加のセルを回復します。</li>
	<li>細胞懸濁液を収集します。ペトリ皿と変更された HBSS の 2 mL でウェットにホルダーを 20 μ m メッシュを配置します。メッシュを保持メッシュを通して細胞懸濁液を注ぐ 2-3 cm シャーレと変更された HBSS の 6 mL でリンス。 メモ: この手順は、メッシュを通過する単一セルから、上に残されている上皮シートを区切ります。流れによる混合細胞懸濁液は免疫細胞や間質線維芽細胞です。</li>
	<li>混合細胞懸濁液と 10 分間吸引液 500 × g で遠心分離を収集し、密度勾配遠心法修正 HBSS 4 mL にペレットを再懸濁します。</li>
	<li>ないブレーキ付け層の混合細胞懸濁液 3 mL 以上 polysucrose ソリューションと 500 x g で部屋の温度で 30 分間遠心します。Polysucrose ソリューションの上から白いバンドを収集し、PBS で洗浄します。 注: この分数は濃縮混合細胞懸濁液、免疫細胞が豊富ですし、いくつかの間質線維芽細胞が含まれています。</li>
</ol>3. 死んだ細胞の除去
注: 死んだ細胞 (> 20%) の大きいパーセントが密度勾配遠心分離後濃縮混合細胞懸濁液に存在する磁気ビーズの死んだ細胞の除去が推奨です。死んだ細胞は、彼らは肯定的な磁気ビーズの選択プロセスを妨げる可能性がありますので削除する必要があります。
<ol><li>対物レンズ 10 倍の顕微鏡で診断を使用してセルをカウントします。濃縮混合細胞懸濁液 (500 × g、10 分、4 ° C) のすべてのセルをスピンダウンします。完全に吸引し、上清を破棄します。1 x 107合計のセルごと (ライブとデッド)、製造元の指示に従って死んだ細胞除去ビーズの 100 μ L を追加します。15 分間室温でインキュベートします。</li>
	<li>磁気の列に 30 μ m フィルターを配置、細胞懸濁液を適用し、ビード標識細胞は、磁気の列を該当します。</li>
	<li>推奨 (3 mL) として死んだ細胞の除去バッファーの列をすすいでください。生きた細胞を含む流れを収集します。死んだ細胞を除去した後の細胞回復の範囲は、図 1 bに提示されます。 注: これらの細胞は染色表現型研究 (セクション 5) のフローサイトメトリーを実行する使用ことができますまたは DC アイソレーション (セクション 4) に進みます。</li>
</ol>4. DC 正磁気ビーズの選択による浄化
<ol><li>次の死んだ細胞の除去 (ステップ 3.2)、セルをスピンダウン、上清を除去、1 x 10 の7セル (PBS、0.5% 熱不活化 AB 血清 (HS)、2 ミリメートルの EDTA) あたり 80 μ L 磁気選択バッファー内細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>DC 集団の肯定的な選択は、製造元の指示 (20 1 x 10 の7セルあたり μ L 磁気ビーズ) に従って CD1a または CD14 の磁気ビーズを追加します。4° Cで 15 分間インキュベートします。
</li>
	<li>磁気選択バッファーを持つセルを洗って、スピンダウン バッファーを完全に削除します。500 μ L 磁気選択バッファーの最小の細胞を再懸濁します。</li>
	<li>磁石に列を添付し、残りの細胞塊を保持する列の上に 30 μ m のフィルターを追加します。フィルターおよび列磁気選択バッファー推奨されているようにすすいでください。</li>
	<li>細胞懸濁液を列に適用します。磁気選択バッファーで 3 回を洗い流してください。</li>
	<li>15 mL チューブに列を転送磁気選択バッファー 5 mL を追加して、列の選択したセルを解放するプランジャーを適用します。</li>
	<li>純度を高め、新しいカラムを使用して回復した細胞と手順 4.4 4.6 を繰り返します。磁気ビーズを選択した後の細胞回復の範囲は、図 1で示されます。</li>
</ol>5. 細胞純度の評価: 流れの Cytometry と顕微鏡
<ol><li>フローサイトメトリー用染色抗体:<ol>
<li>20% を含む PBS 100 μ L の 10 の6セル × 1 まで再懸濁します熱非動化 Fc 受容体をブロックし、氷で 10 分間インキュベートする HS。</li>
		<li>追加希望蛍光標識抗体と死んだ細胞の同定のための試薬 (例については、セクション 6.5 を参照してください)。蛍光マイナス ゲートを確立し、補償のための単一染色コントロールを準備する補償ビーズを使用する 1 つの (FMO) コントロールを設定します。抗体の例を表 1に示した。光から保護、4 ° C で 20 分間インキュベートします。</li>
		<li>2 ml の磁気選択バッファーのセルを洗浄します。 メモ: EDTA の存在は細胞のフローサイトメトリーによる解析の凝集の形成を避けるために重要です。スピン ・ ダウンと上澄みを廃棄します。</li>
		<li>チューブあたり 2% パラホルムアルデヒド溶液 100 μ L を追加することによって、セルを修復します。</li>
		<li>流れの cytometer10,11のサンプルを分析します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>(例えばcytospin) 列をスピンし、ギムザ染色形態を分析するを使用します。<ol>
<li>磁気選択バッファーを 200 μ l 添加の細胞を再懸濁します。</li>
		<li>スピン列と 5 分スピンで読み込みます。スライドが完全に乾燥しなさい</li>
		<li>脱イオン水でスライド浸漬リンス 2 分の 100% メタノールでスライドを修正し、それを空気乾燥を許可します。</li>
		<li>標準ライト-ギムザ染色を行います。エオシンでセルをカバーし 10 分間インキュベート、脱イオン水で洗浄し、乾燥させてください。ライツ Geimsa 染色した細胞をカバー、1 分間インキュベート、脱イオン水ですすいでください、エアーで乾燥させます。</li>
		<li>倒立顕微鏡 (図 2 a、40 × 対物) と準備を確認します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6 DC 細胞機能を評価するために同種の刺激法
<ol><li>解凍冷凍の末梢血単核球 (PBMCs)<ol>
<li>10% の細胞培養媒体を暖かい 37 ° c. に HS</li>
		<li>凍結細胞培地量が少ないまま、cryotube までに、37 ° C の水浴中、cryotube を配置することによって、PBMCs を解凍します。無菌環境で、cryotube の内容を 10% に予め温めておいた細胞培地 10 mL に転送 15 mL チューブに HS。</li>
		<li>遠心分離機 〜 500 x g で 7 分間、メディアを取り出して、ペレットを分散、10%、HS と遠心分離機の細胞培養媒体の 10 mL で、PBMCs を再懸濁しますセル。</li>
		<li>洗浄ステップを 3 回繰り返します。セルをカウントします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ナイーブ T 細胞の選択:<ol>
<li>負の淘汰磁気抗体細胞選択キットを使用すると、製造元のプロトコルに従ってナイーブ T 細胞を分離します。</li>
		<li>分離後 CD45RA と CCR7 抗体を用いて純度を確認します。 注: 一般的な純度です > 99% ナイーブ T 細胞です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ナイーブ T 細胞増殖染料染色:<ol>
<li>細胞増殖の染料、染料を光への暴露から保護する 2 x 溶液の 600 μ L を準備します。</li>
		<li>ナイーブ T 細胞 2 を洗う PBS で x。500 μ L の PBS のセルを再懸濁します。</li>
		<li>軽くボルテックス中キャビネット、バイオ セーフティにおける細胞はナイーブ T 細胞に増殖染料 500 μ L を追加します。</li>
		<li>37° Cで 10 分間細胞をインキュベートします。
</li>
		<li>10% の細胞培養媒体の 5 mL を追加することによって細胞ラベリングを停止のセルに HS。光から保護、5 分間氷の上を孵化させなさい。</li>
		<li>細胞を遠心分離機 ~ 7 分、500 x g メディアを吸引し、10% の細胞培養媒体の 4 ° C で細胞を再懸濁します HS。3 洗浄の合計にさらに 2 回を繰り返します。最後の遠心分離前にカウントするセルの因数を取る。 注: 通常、最終的なナイーブ T 細胞の数は 5% と初期の PBMC 細胞数の 15% の間が範囲です。</li>
		<li>10% の細胞培養媒体の細胞を再懸濁します目的細胞濃度で HS。</li>
	</ol>
</li>
	<li>DC 同種ナイーブ T 細胞共培養:<ol>
<li>1:15 で孤立した Dc と 96 ウェル、丸底板のナイーブ T 細胞をプレート Dc T 細胞の比率。Dc 範囲 3,000 〜 5,000 細胞/ウェル間の最適な数を確認します。</li>
		<li>プレートを遠心分離機 ~ セルは、井戸の中心にあるように 3 分間 500 × g。細胞間接触が発生する適切なシグナリングのために重要です。</li>
		<li>37 ° C で 6 日間インキュベートします。井戸のように増殖が発生した (図 3 a) 顕微鏡による細胞のクラスターを監視します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>フローサイトメトリー評価増殖する染色します。<ol>
<li>6 日後、フローサイトメトリーによる細胞を調べることができます。フローサイトメトリー用共培養を染色します。</li>
		<li>PBS で黄色性色素 (最大排出量 572 nm) の 2 x ソリューションを準備します。 注: 血清なし PBS の使用は重要な血清としてタンパク質、色素を妨げる)。</li>
		<li>細胞をプレートを遠心分離機 ~ 500 × g で 5 分。</li>
		<li>上清の 100 μ L を削除します。 注: この時点で収集し、可溶性因子の分離解析の上清を保存します。</li>
		<li>PBS で 2 回細胞を洗う: PBS の 150 μ L/ウェルを追加、遠心分離機 〜 5 分 500 × g を 150 μ L ピペットで上澄みの削除します。各ウェルに残った上清を 50 μ l 添加があることを確認します。</li>
		<li>2 x 性色素の 50 μ L を各ウェルに追加します。光から保護、10 分間室温でインキュベートします。</li>
		<li>、インキュベーション中に目的とする抗体のマーカーのマスターの混合物を準備します。たとえば: CD3 APC/Cy7, PE CD4, CD8 FITCなど
</li>
		<li>各ウェルに抗体の混合物を追加します。光から保護、10 分間室温でインキュベートします。</li>
		<li>2 セルを洗浄して PBS + 2% x HS: PBS + 2% の 150 μ L/ウェルを追加 HS。遠心分離機 〜 5 分削除 150 μ L ピペットで上澄みの 500 x g。</li>
		<li>100 μ L/ウェル 2% パラ ホルムアルデヒドを追加することによって、セルを修復します。必要な場合: ポリプロピレン流れ cytometry チューブに細胞とメディアを転送します。チューブは 4 ° C で保管し、フローサイトメトリーによる解析まで、光から保護できます。</li>
		<li>流れの cytometer で読み取りチューブ。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wira, C. R., Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+sex+hormones+in+immune+protection+of+the+female+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of sex hormones in immune protection of the female reproductive tract.</a> Nat Rev Immunol. 15 (4), 217-230 (2015).</li>
<li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li>
<li>Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+monocyte-derived+cells%3A+Two+complementary+and+integrated+functional+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems.</a> Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).</li>
<li>Tagliani, E., Erlebacher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+function+at+the+maternal-fetal+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell function at the maternal-fetal interface.</a> Expert Rev Clin Immunol. 7 (5), 593-602 (2011).</li>
<li>Kaldensjo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+intraepithelial+and+stromal+Langerin+and+CCR5+positive+cells+in+the+human+endometrium%3A+potential+targets+for+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Detection of intraepithelial and stromal Langerin and CCR5 positive cells in the human endometrium: potential targets for HIV infection.</a> PLoS One. 6 (6), e21344(2011).</li>
<li>Schulke, L., Manconi, F., Markham, R., Fraser, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endometrial+dendritic+cell+populations+during+the+normal+menstrual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Endometrial dendritic cell populations during the normal menstrual cycle.</a> Hum Reprod. 23 (7), 1574-1580 (2008).</li>
<li>Ballweber, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaginal+langerhans+cells+nonproductively+transporting+HIV-1+mediate+infection+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Vaginal langerhans cells nonproductively transporting HIV-1 mediate infection of T cells.</a> J Virol. 85 (24), 13443-13447 (2011).</li>
<li>Hladik, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+events+in+establishing+vaginal+entry+and+infection+by+human+immunodeficiency+virus+type-1%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Initial events in establishing vaginal entry and infection by human immunodeficiency virus type-1.</a> Immunity. 26 (2), 257-270 (2007).</li>
<li>Duluc, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+diversity+of+human+vaginal+APC+subsets+in+directing+T-cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Functional diversity of human vaginal APC subsets in directing T-cell responses.</a> Mucosal Immunol. 6 (3), 626-638 (2013).</li>
<li>Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+flow+cytometry+data%3A+a+guide+for+the+perplexed%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed.</a> Nat Immunol. 7 (7), 681-685 (2006).</li>
<li>Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection%2C+isolation%2C+and+flow+cytometric+analysis+of+human+endocervical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li>
<li>Givan, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+leukocytes+in+the+human+female+reproductive+tract%3A+comparison+of+fallopian+tube%2C+uterus%2C+cervix%2C+and+vagina%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Reprod+Immunol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of leukocytes in the human female reproductive tract: comparison of fallopian tube, uterus, cervix, and vagina.</a> Am J Reprod Immunol. 38 (5), 350-359 (1997).</li>
<li>Rodriguez-Garcia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+from+the+human+female+reproductive+tract+rapidly+capture+and+respond+to+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells from the human female reproductive tract rapidly capture and respond to HIV.</a> Mucosal Immunol. 10 (2), 531-544 (2017).</li>
<li>Rodriguez-Garcia, M., Barr, F. D., Crist, S. G., Fahey, J. V., Wira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+and+susceptibility+to+HIV+infection+of+CD4%2B+Th17+cells+in+the+human+female+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phenotype and susceptibility to HIV infection of CD4+ Th17 cells in the human female reproductive tract.</a> Mucosal Immunol. 7 (6), 1375-1385 (2014).</li>
<li>Shen, Z., Rodriguez-Garcia, M., Ochsenbauer, C., Wira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+immune+cells+and+infection+by+HIV+in+human+ovarian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Reprod+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of immune cells and infection by HIV in human ovarian tissues.</a> Am J Reprod Immunol. , (2017).</li>
</ol>

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粘膜 Dc、組織3に入る彼らの表現型と機能が変更された組織の環境の影響を強く珍しいセル人口です。血が派生した Dc が非常に有用なモデル、完全に DC の個体数と組織での多様性を反映しません。そのため、粘膜 Dc のユニークな特性を理解する組織からの一次電池の分離が必要です。Frt 社の別の解剖学的サイトから Dc の分離では、DC 機能の in vitro研究し、DC サブセットおよび解剖学的位置を比較する機会を提供しています。
ここでは、機能性の in vitro評価のための人間の FRT ティッシュから Dc の精製を可能にするプロトコルを提供します。DCs は、低い数字で粘膜のサイトで発見され、以来、我々 は密度勾配遠心法と磁気ビーズの細胞分離前に死んだ細胞の除去による組織細胞調製を豊かにするプロトコルを開発しました。彼らはビードの分離を妨げるが、死んだ細胞の適切な除去は重要です。この手法では比較的短時間 (4-6 時間)、積極的に隔離されたセル (≈ 90%) の高純度、一晩インキュベート...

Frt 社は、着床と妊娠1しながら病原体からの保護のデュアル機能を有しています。これを達成するためには、ユニークな組織学的、免疫学的、および機能特性1を表示するそれぞれの解剖学的領域で、frt 社を区分します。
Dc の粘膜表面に存在する肺、腸、生殖管における微生物との接触し、潜在的な病原体2免疫監視を提供します。DCs は、首相のナイーブ T 細胞と免疫3をトリガーするユニークな能力を持っています。Frt 社の Dc も専門にする精子や胎児、妊娠の成功4を許可するなどの外国の抗原を容認します。そのため、場所によっては、DC の表現型と機能が、異なっています。それは彼らの数、表現型、および関数は、3存在する組織環境によって変更するよう Dc が組織環境によって強く影響を受けている知られています。したがって、FRT Dc は、感染症、妊娠、および、FRT でがんに果たす役割を理解し、居住者の Dc を派生の DC モデルが FRT 組織に規制の複雑さに対処する十分な血から、勉強する必要があります。
人間の組織の評価バイオハザード Dc 細胞粘膜組織中に存在数が少ないと人間の組織サンプルを入手できないのために困難です。Dc は、免疫組織化学5,を使用して6にして、組織内のセル位置について通知が機能研究を排除、細胞マーカー分析することができますを識別する数に制限は FRT で研究されています。一度に。また、フローサイトメトリーによる解析のための単一のセル隔離のプロトコル開発7,8,9をされています。これらのプロトコルの一部は移行これらのセルを隔離する Dc の渡り鳥の容量を活用します。これらのメソッドは、通常夜通し孵化し活性化された Dc の選択を必要とするが、定常状態における DCs の研究を可能にしません。
ここでは、子宮摘出標本を使用して、子宮内膜 (EM)、FRT で異なる解剖学的サイトから Dc を分離するためのプロトコルを最適化されたコルポ (CX) と、子宮頸膣部 (ECX)、表現型および機能解析を可能にします。非蛋白分解酵素の消化力のプロトコルを使用して、細胞の活性化せず細胞分離と流れフローサイトメトリー評価組織消化後すぐに進めることができます。フローサイトメトリー マルチ カラーを使用して、機能に関する細胞の低い数字を適応、我々 を識別でき、ビームステアの異なるサイトの Dc のまれなサブセットを特徴付ける

<table><tbody><tr><td>ハンクの平衡塩溶液 (HBSS)</td><td>ハイクロン</td><td>SH30015.03</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>ハイクロン</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>ハイクロン</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ IV</td><td>シグマ</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>デオキシリボヌクレアーゼ I</td><td>ワージントン 生化学的</td><td>LS002140</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>シグマ オルドリッチ</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>0.22 um ステリカップ 500 mL&nbsp; フィルター</td><td>ミリポア</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>100mm x 15mm ポリスチレン シャーレ</td><td>フィッシャーブランド</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>150mm x 15mm ポリスチレン シャーレ</td> フィ<td>ッシャーブランド</td><td>FB0875714</td><td></td></tr><tr><td>150mm x 25mm ポリスチレン ディッシュ</td><td>コーニング</td><td>430599</td><td>処理細胞培養ディッシュ</td></tr><tr><td>Isotemp インキュベーター</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>FICO3500TABB</td><td>5.0% CO2</td></tr><tr><td>American Rotator V</td><td>American DADE</td><td>R4140</td><td></td></tr><tr><td>250 um ナイロンメッシュ</td><td>Sefar</td><td>03-250/50</td><td></td></tr><tr><td>20 um ナイロンメッシュ</td><td></td><td>Sefar 03-20/14</td><td></td></tr><tr><td>ベックマン GS-6R 遠心分離機</td><td>ベックマン</td><td>358702</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 ゲンタマイシン付きL-Gln、フェノールレッド、1 L</td><td>ロンザ</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>ヒト AB 血清</td><td>バレー生物医学</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>シグマ オルドリッチ</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝液 (PBS)</td><td>National Diagnostics</td><td>CL-253</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>死細胞除去キット</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>プレセパレーション フィルター (30um)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>LSコラム</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-410</td><td></td></tr><tr><td>Quadro MACSセパレーター</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>MACSマルチスタンド</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>USB</td><td>15694</td><td></td></tr><tr><td>CD1a Microbeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-051-001</td><td></td></tr><tr><td>CD14マイクロビーズ、ヒト</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td></td></tr><tr><td>eFluor 670 細胞増殖色素</td><td>eBiosciences</td><td>65-0840-85</td><td></td></tr><tr><td>96 井戸丸底板</td><td>Falcon</td><td>9/8/2866</td><td></td></tr><tr><td>ゾンビイエロー生存率染料</td><td>Biolegend</td><td>423104</td><td></td></tr><tr><td>CD3 APC/Cy7、反ヒト</td><td>とんぼバイオサイエンス</td><td>25-0038-T100</td><td></td></tr><tr><td>CD4 PE, anti-human</td><td>eBiosciences</td><td>12-0048-42</td><td></td></tr><tr><td>CD8a FITC, anti-human</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0086-T100</td><td></td></tr><tr><td>Gallios Flow Cytometer</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>B43618</td><td>10色, VBR</td></tr><tr><td>MACSquant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td>8色, VBR</td></tr></tbody></table>

人間の女性の生殖器官から樹状細胞の表現型および機能研究の分離

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

ひと樹状細胞 (Dc) 粘膜組織における居住者の特性は、サンプルの取得の難しさのために挑戦し、組織あたりの Dc の低い数字を提示します。まだ、組織環境によって表現型と Dc の機能を変更すると、組織 DC 住民を分析、血が不完全な Dc を得られるので組織で DCs の複雑さを反映する必要は。人間女性の生殖器官 (FRT) 子宮摘出標本を用いた表現型および機能解析を可能にするから Dc を分離するためのプロトコルをご紹介します。プロトコルは、肯定的な磁気ビーズの選択に続いて、細胞懸濁液を混合、1 つのセルを生成する組織消化で構成されます。私たちの組織の消化力のプロトコルはない表面マーカーを切断一晩培養や細胞活性化せず、定常状態における DCs の表現型および機能分析が可能。このプロトコルは、他の免疫細胞の種類の分離または他の組織からの Dc の分離の合わせることができます。

図 1 a; のように、次の組織消化、上皮と腺のリリースを観察できます。この酵素の消化力が成功したことを示す肯定的なコントロールです。それぞれ、生菌数および組織の 1 グラムあたり回復の Dc の数は図 1 bと図 1は表示も。5-30% 密度遠心分離12,13前に間質細胞の間の免疫細胞を表します。図 2は、(図 2 a) の形態と孤立した Dc の純度 (図 2 b, C) を示します。プロトコルに記載されている 2 つのラウンドの選択が実行されると、予想される純度範...

ここで分離し、その表現型および機能特性評価のための人間の女性の生殖器官の別の解剖学的なコンパートメントから樹状細胞を浄化する手法について述べる。このメソッドは、他の免疫細胞やその他の粘膜組織から樹状細胞を分離する合わせることができます。

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...

この手順の全体的な目標は、ヒト女性の生殖管のさまざまな解剖学的コンパートメントから樹状細胞を分離して、それらの表現型および機能的特性を評価することです。この方法は、特定のサブセットの解剖学的区画化やそれらの機能特性など、女性の生殖管の組織に常在する樹状細胞に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、当社の組織消化プロトコルが表面マーカーを切断しないことであり、これにより、一晩のインキュベーションや細胞活性化なしに樹状細胞を即座に分離できます。この方法は、ヒト女性の生殖管から樹状細胞を単離するように最適化されていますが、他の免疫細胞や他の組織から樹状細胞を単離するように適応させることもできます。この手順を実演するのは、私たちの研究室の技術者であるFiona BarrとJared Fortierです。この手順は、改変されたHBSSで組織をすすぐことから始めます。100 x 15 mm四方のシャーレにティッシュを置き、約3ミリリットルの消化酵素カクテルを追加して、ティッシュが乾燥するのを防ぎます。鉗子を使用して組織を安定させながら、メスでミンチにして、消化酵素カクテルにさらされる組織の表面積を増やします。ティッシュを細かく切ります。すべての組織片を覆うのに十分な消化酵素カクテルを追加し、蓋をペトリ皿に置きます。5%二酸化炭素を含む37°Cで、ローテーター上で約80rpmで45分間インキュベートします。ローテーター速度が消化酵素カクテルをこぼしたり泡を出したりすることなく完全に混合することを確認します。45分後、倒立型光学顕微鏡で4Xおよび10X対物レンズを使用して組織調製物を視覚化します。酵素消化が成功すると、この代表的な画像に示すように、上皮シートと腺が放出されます。無菌環境で単一細胞の分離を行います。まず、ホルダー付きのピンと張った250マイクロメートルのメッシュを150 x 15 mm四方のシャーレに置き、メッシュがシャーレの表面から約0.5センチメートル上にあることを確認します。次に、メッシュを2ミリリットルの改変HBSSで濡らし、消化した組織をメッシュに移します。10ミリリットルのシリンジプランジャーの平らな面を使用して、メッシュを通して消化されたミンチ組織を優しく、しかししっかりと挽きます。組織片が完全に分散したら、メッシュとホルダーをペトリ皿から2〜3センチメートル上に持ち上げ、3ミリリットルの改変HBSSですすいで追加の細胞を回収します。細胞懸濁液を50ミリリットルの円錐管に移します。新しいペトリ皿の上に約2〜3センチメートルのホルダー付きの20マイクロメートルメッシュを置き、2ミリリットルの改質HBSSで濡らします。細胞懸濁液をメッシュに通し、6ミリリットルの改質HBSSですすいでください。混合細胞懸濁液を回収し、500 gで10分間遠心分離します。液体を吸引し、ペレットを4ミリリットルの変性HBSSに再懸濁します。混合細胞懸濁液を3ミリリットルのポリスクロース溶液に重ねて、密度勾配遠心分離を行います。室温で500g、ブレーキなしで30分間遠心分離します。ポリスクロース溶液の上部から白い帯を集め、PBSで洗います。濃縮混合細胞懸濁液を採取したら、10倍対物レンズを搭載した光学顕微鏡の血球計算盤を使用して細胞をカウントします。細胞懸濁液中のすべての細胞を10分間スピンダウンします。上清を完全に吸引して捨てます。その後、死細胞除去ビーズを添加し、室温で15分間インキュベートします。15 分後、カラムの上部に 30 μm フィルターを取り付けて、残っている組織破片や細胞凝集体を保持します。フィルターとカラムをデッドセル除去バッファーですすいでください。次に、細胞懸濁液を塗布し、ビーズ標識細胞を磁気カラムに流します。カラムを3ミリリットルの死細胞除去バッファーで4回すすぎます。生細胞を含むフロースルーを回収します。デッドセルを除去した後、セルをスピンダウンします。上清を除去し、細胞ペレットを磁気選択緩衝液に再懸濁し、7つの細胞に1×10の緩衝液80マイクロリットルを添加する。樹状細胞集団を確実に選択するには、CD1aまたはCD14磁気ビーズを添加し、摂氏4度で15分間インキュベートします。磁気選択バッファーで細胞を洗浄し、スピンダウンしてバッファーを完全に除去し、細胞を最小500マイクロリットルの磁気選択バッファーに再懸濁します。カラムを磁石に取り付け、カラムの上部に30 μmのフィルターを追加して、残っている組織破片や細胞凝集体を保持します。フィルターとカラムを磁気選択バッファーですすいでください。細胞懸濁液をカラムに塗布します。3ミリリットルの磁気選択バッファーで3回すすいでください。カラムを15ミリリットルのチューブに移します。5ミリリットルの磁気選択バッファーを追加し、プランジャーを適用して選択した細胞をカラムから解放します。純度を上げるには、新しいカラムを使用して、回収した細胞で精製ステップを繰り返します。その後、テキストプロトコルに記載されているように、フローサイトメトリーおよび顕微鏡法により細胞純度を評価します。このアッセイを開始する前に、市販のキットを使用して末梢血単核細胞からナイーブT細胞を単離します。ナイーブT細胞をPBSで2回洗浄します。細胞を500マイクロリットルのPBSに再懸濁します。プロトコルの残りの部分は暗闇で実行されます。バイオセーフティキャビネット内の細胞を穏やかにボルテックスしながら、細胞増殖色素の2倍溶液500マイクロリットルを細胞に加えます。細胞を摂氏37度で10分間インキュベートします。10%ヒトAB血清を含む5ミリリットルの細胞培養培地を細胞に添加することにより、細胞標識を停止します。光から保護されて、氷上で5分間インキュベートします。細胞を約500倍gで7分間遠心分離します。培地を吸引し、10%ヒトAB血清を含む5ミリリットルの細胞培養培地に細胞を再懸濁します。最後の遠心分離の前に、カウントする細胞のアリコートを取ります。3回目の洗浄後、細胞を10%ヒトAB血清を含む細胞培養培地に所望の細胞濃度で再懸濁します。樹状細胞の同種ナイーブT細胞共培養を開始するには、単離された樹状細胞とナイーブT細胞を96ウェルの丸底プレートに、樹状細胞とT細胞の比率が1対15の割合でプレートします。プレートを約500倍gで3分間遠心分離し、細胞がウェルの中心に位置することを確認します。摂氏37度で6日間インキュベートします。顕微鏡で細胞をモニターします。6日後、テキストプロトコルに記載されているように、フローサイトメトリーにより細胞増殖を評価します。このグラフは、各女性の生殖管コンパートメント、子宮内膜、子宮頸部、および外頸部における組織処理および死細胞除去後に回収された生存細胞の総数の範囲を示しています。次に、磁気ビーズ単離後の組織グラム当たりに回収される生電樹細胞の数を示します。単離された細胞の樹状形態は、ギムザ染色後の顕微鏡法によって決定されました。ビーズ単離前後の表現型マーカーの発現は、フローサイトメトリーによって決定されました。CD1a陽性およびCD14陽性ビーズの単離後、純度は85〜92%の範囲であり、樹状細胞の機能を評価するために同種刺激アッセイを実施した。増殖中のT細胞クラスター形成は、増殖色素染色によって確認されました。その後、増殖をフローサイトメトリーによって定量しました。ここに示されているのは、混合細胞懸濁液中の異なる樹状細胞を同定するためのゲーティング戦略です。マルチカラープロットの各ゲート母集団は、次のパネルに表示されます。ゲーティング戦略に従って、特定の樹状細胞サブセットが同定されます。組織樹状細胞はまれな集団であるため、細胞数は少ないと予想されます。一度習得すると、組織からの樹状細胞の分離は、適切に実行されれば4〜5時間で行うことができます。このビデオを見れば、組織を酵素的に消化して処理し、単一の混合細胞懸濁液を生成し、樹状細胞の磁気ビーズ選択を行い、さらなる特性評価を行う方法について十分に理解できるはずです。

isolation-dendritic-cells-from-human-female-reproductive-tract-for

Research

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人間の女性の生殖器官から樹状細胞の表現型および機能研究の分離

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