角膜移植片の間質特徴の組織学的様解析のための全視野光コヒーレンス顕微鏡
2022年10月21日
角膜ドナー間質の高品質評価のための方法としてのフルフィールド光干渉顕微鏡の使用について説明します。このプロトコルは、健康または疾患を示す特徴を特定するために使用でき、ドナー組織のスクリーニングと選択、したがって角膜移植術の結果を改善することを目的としています。
この方法は、アイバンクにおける角膜ドナー組織のスクリーニングおよび選択を改善し、角膜移植の結果を高めることができる。この技術の主な利点は、その高解像度評価機能と、画像取得中ずっと角膜が記憶媒体で満たされた密閉チャンバーに浸されたままであり、汚染の潜在的なリスクを低減します。手順を実演するのは、私たちの研究室を卒業した博士号のマエル・ビルバートです。
まず、上皮を上に向けて、サンプルホルダー内の保存媒体に浸した角膜を配置します。サンプルホルダーに付属の清潔なシリカカバースリップを角膜の上に置きます。次に、サンプルがわずかに平らになり、カバースリップの下に固定されるまでベースをゆっくりと回してホルダーを閉じ、比較的均一なイメージング面を提供します。
気泡を避けるために予防策を講じてください。液浸媒体としてカバースリップに眼科用または光学用ゲルの厚い層を適用します。デバイスの背面にある電源スイッチをオンにして、デバイスを初期化します。
デバイスの前面にある緑色のLEDの点灯は、電源がオンになっていることを示します。可動トレイを除いて、イメージングステージが透明であることを確認してください。次に、アクイジションソフトウェアで[OK]をクリックして、プロンプトでモーターを初期化します。
デバイスを設定するには、指定された必須フィールドにサンプル識別子を入力します。また、必要に応じて、サンプルの説明と試験の説明を入力します。次に、[マクロ イメージの取得] をクリックして、後で横方向の配置やナビゲーションに使用できるサンプルのスナップショットを作成します。
問題がなければ、[はい] をクリックしてプロンプトでイメージを検証します。その後、デバイスはサンプルトレイを対物レンズの下に移動し、自動調整を実行します。先に進む前に、顕微鏡の対物レンズが光学ゲルに十分に浸されていることを確認してください。
[探索] タブに移動して取得を準備します。画像のスタックを取得する前に、ジョイスティックまたは画面上の手動選択を介して角膜の中心に移動します。ジョイスティックの回転、スライダーの調整、またはグラフィカルユーザーインターフェイスの手動キーボード入力により、イメージング深度を変化させます。
次に、最適な角膜イメージングのために平均値を40に調整します。角膜表面値または最初の画像位置を深度フィールドに入力します。次に、[取得]タブを選択して画像を取得します。
デバイスの軸方向の解像度に一致するスライス間隔を選択して設定します。[スライス数] に角膜の厚さの値を入力します。パラメータと取得時間を確認します。
そして、満足したら、[OK]を押して取得を開始します。取得中は、顕微鏡が配置されているテーブルとの接触を避けてください。間質層とボーマン層の厚さを評価するには、角膜断面の距離を測定します。
たとえば、テキスト原稿で説明されているように、断面全体に5つの等間隔のポイントを追加します。既知の距離の 2 つのポイント間に、デフォルトの視野に従って線を引きます。次に、[分析]タブに移動し、[スケールの設定]を選択します。
既知の距離と長さの単位を適切なフィールドに入力します。1024 ピクセルまたは 780 マイクロメートルに設定し、[OK] をクリックします。距離が不明な2点の間に線を引き、ステータスバーから直接測定された長さまたは距離を読み取ります。平均と変動係数を記録します。
[画像]タブをクリックし、[スタック]の下の[再スライスZ]を選択して、ケラチノサイト密度を決定します。これにより、間質と顔の画像を7つのグループに合計して、同等の厚さのスライスが生成されます。さらなる分析のために、前部間質の利用可能なすべての顔スライス、前間質の15枚の画像、中間質の5枚の画像、および後部間質の5枚の画像を含めます。
各エンフェイス画像で、300 x 300マイクロメートルの関心領域を選択します。核の視覚化を強化するには、[編集]タブの[反転]を使用して画像を反転します。コントラストと明るさを調整するには、[画像]タブをクリックし、[明るさ-コントラスト]に移動します。
細胞核を手動でカウントするには、[プラグイン]に移動し、[分析]タブの[セルカウンター]に移動します。 [初期化]を押して、カウンターの種類を選択します。次に、反転画像内の暗い楕円形の特徴をクリックして細胞核を数え、画像の4つの側面のうち2つだけの画像の境界に着地するものを考慮します。
選択されたヒトドナー角膜は、臓器培養培地に保存した後に腫脹し、浮腫性角膜の病態生理学的モデルを与え、浸透深さが限られているため角膜の厚さ全体を通して画像取得を妨げました。デキストリン補充臓器培養培地への移送は、腫脹を減少させ、正常な厚さのドナー角膜をもたらした。罹患角膜は、形態学的変化および可変間質厚さまたはボーマン層の減少を含む典型的な間質的特徴によって認識された。
ケラチノサイト密度と間質反射率の評価は、臨床光干渉断層撮影システムの能力を超えたフルフィールド光干渉顕微鏡による正常角膜組織と病理学的角膜組織の組織学的分析と鑑別をさらに支援しました。このビデオを見た後、正常なヒト角膜組織からの疾患の区別を可能にする角膜間質の定性的および定量的組織学的分析を実行する方法をよく理解する必要があります。
概要
本記事では、角膜ドナー実質の品質評価における全視野光干渉断層顕微鏡（full-field optical coherence microscopy）の使用について説明します。この手法は、ドナー組織のスクリーニングを強化し、角膜移植の転帰を改善することを目的としています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 光干渉断層顕微鏡法
- 角膜健康状態の評価
- 組織移植
背景
- 角膜ドナー組織の品質は、移植を成功させるために極めて重要です。
- 現在の手法では、評価に十分な詳細情報が得られない場合があります。
- 高解像度イメージング技術により、診断能力を向上させることができます。
- 全視野光干渉断層計（フルフィールド光干渉顕微鏡）は、従来の手法に比べて優れた利点があります。
研究目的
- 角膜ドナー組織のスクリーニングおよび選択プロセスを改善すること。
- 角膜の健康状態の高解像度評価を提供すること。
- 正常な角膜組織と病変のある角膜組織を区別すること。
使用した手法
- イメージングの間、角膜を保存液に浸漬させます。
- イメージングを向上させるため、浸漬媒体として光学ジェルを使用します。
- 画像取得では、深度とスライス間隔のパラメータを設定します。
- 組織学的評価のため、角化細胞密度と実質の反射率を解析します。
主要な結果
- 本手法により、角膜組織の定性的および定量的な解析が可能になります。
- 正常な角膜の状態と病的な状態を効果的に区別できます。
- 実質厚と角化細胞密度の評価が可能です。
- 疾患を示す形態学的変化を特定できる能力が実証されています。
結論
- 全視野光干渉断層顕微鏡（Full-field optical coherence microscopy）は、角膜評価における有用なツールである。
- この技術により、移植に用いるドナー組織の選定精度が向上する。
- 標準的な手法では不可能な、角膜の状態に関する詳細な知見を得ることができる。
よくある質問
産業界における重要性
ドナー角膜移植片における実質の質を評価することは、角膜移植術における移植不全を減らすために極めて重要です。全視野光干渉断層撮影（Full-field optical coherence microscopy）により、角膜実質の高解像度かつ非侵襲的な3Dイメージングが可能となり、実質の厚さや角質細胞密度などの定量的指標を得ることができます。この機能は、移植結果を損なう可能性のある病理学的特徴を特定することで、眼バンクにおけるドナー組織選択の向上を支援します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 角膜疾患モデルにおける病原性メカニズムを解明するために、ストローマ（基質）の微細構造の解析を可能にする。
- 実用的価値： 切片作成や染色を行うことなく、新鮮または固定されたex vivo組織の再現性のあるラベルフリーイメージングを提供する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 後続のバイオマーカーおよび表現型スクリーニングワークフローに適した、検証済みの角膜実質標本の作製を容易にします。
- 運用的価値： 定量的なen faceイメージングと調整可能なスライス間隔により、一貫した実質解析に向けたアッセイの標準化を支援します。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値： 間質の特徴を組織学的に解析することで、正常組織と疾患組織を区別することを可能にし、前臨床モデルの検証を支援します。
- 運用的価値： 器官培養システムにおいて、間質を縦断的に評価するための非破壊的な手法を提供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、移植前の角膜組織評価におけるゴー/ノーゴー判断の根拠となるストロマの定量的な読み出し値を提供することで、ディスカバリーワークフローに統合されます。
- 探索生物学：間質厚と角化細胞密度の測定を可能にし、組織の健全性と疾患の進行を評価します。
- スクリーニング：ドナー組織の標準化された評価に向けて、間質構造の再現性の高い高解像度3Dイメージングを提供します。
- 分析：間質の反射率やen face画像強度など、条件間の比較分析に用いる定量的出力を生成します。
- トランスレーショナルリサーチ：移植の成功を予測する間質の特徴を特定することで、ドナーのスクリーニングから臨床移植までの継続性をサポートします。
- エンタープライズ再利用：複数のドナーバッチや疾患モデルにわたる角膜間質評価のための、再利用可能なイメージングプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 定量的な組織学的解析により、実質の状態評価における予測の信頼性を提供します。
- 運用上の価値： 密閉チャンバーへの浸漬と一貫した光学ゲルの使用により、再現性と標準化を確保します。
- 戦略的価値： ドナー組織の選択を改善し、移植不全率を低下させることで、後半段階における生物学的リスクを軽減します。
- ポートフォリオへの影響： 実質品質の指標に基づいた、リスク調整済みの角膜移植優先順位付けを可能にします。
実施上の考慮事項
- ストローマ厚および角化細胞密度の測定には、光学顕微鏡および画像解析ソフトウェアに関する専門知識が必要です。
- 光学ゲル浸漬機能を備えたフルフィールド光干渉断層顕微鏡システムに依存します。
- スライス間隔、平均化回数、関心領域（ROI）のサイズなどの撮像パラメータの標準化が必要です。
- 器官培養における角膜厚の変動や浮腫状態への適応を考慮する必要があります。
- 高度に浮腫化した組織では浸透深さが制限されるため、全層評価には浮腫を軽減させるための前処理が必要です。
バイオファーマに関するよくある質問
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:47
Sample Preparation
1:31
FF‐OCM Initialization, Setup, and Image Acquisition
3:48
Image Analysis: Qualitative and Quantitative Assessment of Stromal Morphology and Features
6:08
Results: Qualitative and Quantitative Assessment of Corneal Donor Stroma
7:21
Conclusion
