Name: 角膜移植片の間質特徴の組織学的様解析のための全視野光コヒーレンス顕微鏡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 学ぶ全視野光コヒーレンス顕微鏡を用いた角膜移植片の組織学的様解析法。高解像度イメージングで角膜間質のケラチノサイト密度と反射率を定量的に評価し、正常と病変組織を区別して移植前ドナー組織のスクリーニング精度を向上させる。

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この研究は、PRTS(Projet de Recherche Translationelle en Santé)助成金No ANR-13-PRTS-0009(V.B.)の下で、およびMarie Skłodowska-Curie助成金契約No 709104(K.I.)の下で欧州連合のHorizon 2020研究およびイノベーションプログラムから資金提供を受けています。著者らは、細胞計数と組織学的処理の支援を提供してくれたセリーヌ・デ・スーザに感謝している。

ここに記載されているすべての方法は、ヘルシンキ宣言の信条に従って実行され、人間の組織に関する国際的な倫理要件に従いました。これは前向き観察症例対照研究でした。患者からインフォームドコンセントを得た。フランスの治療基準やフォローアップの変更は行われなかった。治験審査委員会(IRB)の承認は、イル・ド・フランスV(14944)の患者保護委員会から得られました。
1.組織の選択と準備
<ol><li>ドナー角膜を選択します。
	<ol><li>臓器培養培地26に保存されたドナー角膜をデキストラン補充臓器培養培地に3日間移し、FF−OCMイメージング28の前にデタージェッセンス27を可能にする(材料の表を参照)。</li>
	</ol></li>
	<li>サンプルを準備します。
	<ol><li>保存媒体に浸した角膜を、上皮を上に向けてサンプルホルダーに配置します。</li>
		<li>角膜の上に清潔なシリカカバーガラス(サンプルホルダーに付属)を置き、サンプルがカバーガラスの下にわずかに平らになり固定され、比較的均一なイメージング面が得られるまで、ベースをゆっくりと回してホルダーを閉じます。気泡を避けるために予防策を講じてください。</li>
		<li>液浸媒体としてカバーガラスに眼科用または光学用ゲルの厚い層を適用します。</li>
	</ol></li>
</ol>2. FF-OCMの初期化、セットアップ、画像取得
<ol><li>デバイスを初期化します。
	<ol><li>デバイスの背面にある電源スイッチを操作して、デバイスの電源を入れます。デバイスの前面にある緑色のLEDの点灯は、電源がオンになっていることを示します。</li>
		<li>前面の電源スイッチを操作して、専用コンピュータとハロゲン光源の電源を入れます。</li>
		<li>デスクトップショートカットをダブルクリックして、取得ソフトウェア( 材料表を参照)を起動します。</li>
		<li>可動トレイを除いて、イメージングステージが透明であることを確認してください。次に、「OK」をクリックして、プロンプトでモーターを初期化します。</li>
		<li>トレイを引き出し、専用容器にサンプルホルダーを挿入し、トレイをそっと押し戻します。</li>
	</ol></li>
	<li>デバイスをセットアップします。
	<ol><li>指定された必須フィールドに「サンプル識別子」を入力します。必要に応じて、「サンプルの説明」および/または「試験の説明」を入力します。</li>
		<li>準備ができたら[マクロ画像の取得]をクリックして、後で横方向の配置とナビゲーションの目的で使用できるサンプルのスナップショットを作成します。満足したら、プロンプトで「はい」をクリックして画像を検証し、その後、デバイスはサンプルトレイを対物レンズの下に移動し、自動調整を実行します。</li>
		<li>先に進む前に、顕微鏡の対物レンズが光学ゲルに十分に浸されていることを確認してください。</li>
	</ol></li>
	<li>スタックを取得します。
	<ol><li>「探索」タブを選択して、取得を準備します。
		<ol><li>画像のスタックを取得する前に、ジョイスティックの移動または画面上の手動選択を介して(つまり、取得したマクロ画像の赤い四角をクリックして目的の場所にドラッグすることにより)、角膜の中央に移動します。</li>
			<li>ジョイスティックの回転、スライダーの調整、またはグラフィカルユーザーインターフェイス(GUI)での手動キーボード入力を使用してイメージング深度を変化させ、平均値を調整します(最適な角膜イメージングには、通常、平均40が推奨されます)。 注:これは、角膜サンプルの厚さと、角膜の厚さ全体を通して画像化するために必要な平均化を決定するために行われ、最初と最後の画像の位置を深さで記録します。カバーガラスの底面は、断層画像(GUIの右側)に見られる平行な干渉縞を作成し、角膜表面の位置決めを容易にします。</li>
			<li>角膜表面値または最初の画像位置の深さを「深さ」フィールドに入力します。</li>
		</ol></li>
		<li>「取得タブ」を選択して、画像を取得します。
		<ol><li>「スライス間隔」(デフォルトの推奨設定は1μmで、デバイスの軸方向の分解能に一致)を選択し、「スライス数」の下に角膜の厚さの値を入力します。</li>
			<li>パラメータと取得時間を確認し、問題がなければ「OK」を押して取得を開始します。</li>
			<li>取得中は、FF-OCMが配置されているテーブルとの接触を避けてください。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>3. 取得画像の管理
<ol><li>画像を表示およびエクスポートします。
	<ol><li>デスクトップショートカットをダブルクリックして、FF-OCM表示ソフトウェア( 材料表を参照)を起動します。取得した画像(サンプルIDで識別)は、「地域研究」リストに表示されます。</li>
		<li>マクロ画像と取得した画像スタックの両方を含む対応するサンプルIDを持つスタディを選択し、一連の画像を右クリックして「DICOM」形式を選択して、生のピクセルデータとメタデータを保持し、さらに分析することで後者を「エクスポート」します。</li>
		<li>一連の画像をダブルクリックして、多面再構成(MPR)モードを使用して、3D画像スタックを 面 図と断面図で表示します。画像をナビゲートし(マウスホイールのスクロールやスライダーの調整など)、各スタックの代表的な 顔 と断面図を選択します。</li>
		<li>ウィンドウの右下にあるアイコンをクリックして、「DICOM」形式を使用して、選択したビューをエクスポートします。</li>
	</ol></li>
	<li>画像をインポートします。
	<ol><li>デスクトップショートカットをダブルクリックして画像処理ソフトウェア( 材料表を参照)を開き、「プラグイン」の下の「バイオフォーマット」「インポーター」に移動してDICOM画像をインポートします。「Bio-Formatsインポートオプション」ウィンドウで「類似した名前のファイルをグループ化する」が選択されていることを確認してください。</li>
	</ol></li>
</ol>4. 画像解析:間質形態・特徴の定性的・定量的評価
<ol><li>間質層とボーマン層の厚さを評価します。
	<ol><li>角膜断面、たとえば断面25を横切る5つの等間隔のポイントで距離を手動で測定します。<ol><li>既知の距離の2点の間に線を引き(画像全体の左から右、つまりデフォルトの視野である1,024ピクセルまたは780μmに従うなど)、[分析]に移動して[スケールの設定]を選択し、適切なフィールドに[既知の距離]と[長さの単位]を入力して、[OK]をクリックします。</li>
			<li>距離が不明な2点の間に線を引きます。ステータスバーから直接測定された長さまたは距離を読み取ります。</li>
		</ol></li>
		<li>平均と変動係数(COV)を記録します。ボーマンの層の厚さが6.5μm未満で、COVが18.6%を超える場合は、異常な角膜間質と関連しています25。</li>
	</ol></li>
	<li>角化細胞密度を決定します。
	<ol><li>共焦点顕微鏡の慣例に従う:7つのグループで間質 と顔 の画像を合計して、同等の厚さのスライスを生成します。このためには、「画像」タブに移動し、「スタック」の下の「再スライスZ」を選択します。</li>
		<li>間質24,25を通る進行における異なる(減少する)細胞密度を考慮に入れる。このため、間質は深さに応じて4つの領域で構成されていると考えることができます:(1)ボーマン層の下の非常に前部間質、つまり間質全体の厚さの2%です。残りの間質(すなわち、間質全体の厚さの98%)は、同じ厚さの3つのゾーンを有する:(2)前間質、(3)中間質、および(4)後間質。</li>
		<li>さらなる分析のために、非常に前間質のための利用可能なすべての enface スライス、前間質のための15の画像、中間質の5つの画像、および後部間質の5つの画像を含める(ここで、信頼できるカウントに必要な領域あたりの画像数は段階的分析によって決定された29)。</li>
		<li>各 エンフェイス 画像で、300 μm x 300 μmの関心領域を選択します。核の視覚化を強化するには、[編集]タブの[反転]を使用して画像を反転し、コントラストと明るさを調整します。後者の場合は、「画像」に移動し、「分析」の下の「明るさ/コントラスト」に移動します。</li>
		<li>細胞核を手動で計数することは、例えば「細胞カウンタ」機能25を使用する。このためには、「プラグイン」に移動し、「分析」の下の「セルカウンター」に移動します。「初期化」を押してから、カウンタータイプを選択します。次に、反転画像内の暗い楕円形の特徴をクリックして細胞核のカウントを開始し、画像25の4つの側面のうちの2つだけについて画像の境界に着地するものを考慮する。</li>
		<li>角化細胞密度が健康な被験者よりも患者(円錐角膜など)で低く、疾患の重症度と相関することが示されている共焦点顕微鏡法に従って、細胞密度を面積密度、つまり細胞/mm²(カウントした細胞の数を0.09で割って細胞/90,000μm²から細胞/mm²に変換する)で記録します。 注:移植後に完全に透明な角膜移植片を得るために、角質細胞密度の最小閾値が必要かどうかを判断するには、さらなる臨床研究が必要です。</li>
	</ol></li>
	<li>間質反射率を評価します。
	<ol><li>例えば「Z軸プロファイル」機能および/またはカスタムソフトウェア25,30,31を使用して、間質画像スタックの平均強度深度プロファイルを生成する。 注:FF-OCMは、サンプルの強度ではなく後方散乱された光の振幅を測定するため、これらは実際には振幅深度プロファイルです。<ol><li>各 面 スタックの平均グレーレベルを計算します。</li>
			<li>最小グレー値を減算し、最大グレー値で正規化します。</li>
			<li>間質の深さ(間質の厚さの%)の関数として対数スケールで表示します。</li>
			<li>結果の対数プロファイルを線形回帰直線で近似し、二乗残差の合計(最小二乗適合)を最小にします。</li>
			<li>線形性の尺度としてR2乗値(R²)を記録します。0.94未満の値は、角膜の病理を示している可能性があります25。 注:病理学の存在による線形対数回帰モデル(または単指数減衰モデル)の不十分さを単なる測定ノイズと区別するために、ベイズ推定による信号分析が行われてもよい31。また、線形対数(または単指数)間質深さプロファイル(例えば、R二乗値30または1に近いビルジ比31で表される)を有する角膜において、信号減衰速度からの光子平均自由行程の計算は、透明性の程度31をさらに定量化するために使用され得る。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>他の間質の特徴と病気の指標の可視性を評価します。
	<ol><li>瘢痕、線維組織、湖、またはフォークト脈理の存在を確認します。</li>
		<li>間質内の神経の平均厚さを評価します(測定に十分に見える場合)24。<ol><li>間質神経が最も目立つ 顔の画像を 1つ選択します(通常は間質中部領域)。</li>
			<li>たとえば5点24で神経の厚さを測定し、平均と標準偏差を計算します。9μmを超える神経の厚さは、円錐角膜24などの病理学の追加の指標となる可能性があります。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

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著者は開示するものは何もありません。

FF-OCMを用いた角膜ドナー間質の定性的および定量的評価のためにここで説明するプロトコルは、スペクトルドメインOCTおよび共焦点顕微鏡21,24,25の能力を超えて、間質状態を示す肉眼的および微視的特徴の組織学的様分析に基づいており、正常なヒト組織からの罹患者の区別を可能にする。
鏡面顕微鏡によるヒトドナー角膜の優れた内皮品質評価は別として、間質品質の評価はアイバンクでは困難であり、一般的に現在のプロトコルでは細隙灯生体顕微鏡および/または光学顕微鏡による肉眼的観察に限定されています。既存の方法では細かい解像度がないということは、角膜移植の結果を損なう間質性疾患のある角膜が選択される可能性があることを意味するだけでなく、角膜は、実際には前間質または上皮領域に制約され、内皮角膜移植術に使用できる間質混濁のために拒絶される可能性があることを意味します14。
現在のアイバンクプロトコルは、その優れた解像度により、角膜、特に間質(ボーマン層を含む)の品質評価を完了するための強力で非侵襲的なツールを構成するFF-OCMの追加によって補完することができます。細隙灯検査時とは異なり、グラフトはFF-OCM画像取得中ずっと記憶媒体で満たされた密閉チャンバーに浸されたままであり、汚染の潜在的なリスクを低減します。
FF-OCM( 材料表を参照)で画像取得を成功させるには、サンプルホルダーのカバーガラスの上に塗布された光学ゲルに顕微鏡対物レンズを十分に浸すことが重要です(ステップ2.2.3)。さらに、デバイスのキャリブレーションを定期的にチェックすることをお勧めしますが、これは自動調整が失敗した後(ステップ2.2.2)、取得ソフトウェアの「ツールとオプション」からアクセスすることもできます( 材料の表を参照)。サンプルホルダー内のキャリブレーションミラーを使用する手順は、カバーガラスを配置する前に光学ゲルをミラーに塗布する必要があることを除いて、通常のサンプル調製(ステップ1.2を参照)と同じです。
既存のアイバンク手順に従って正常な間質を有すると考えられる一連のドナー角膜移植片を使用して、この原稿のプロトコルを説明し、ドナー間質質の正確で信頼性の高い評価のためのFF-OCMの適合性を具体的に実証しました。これらの正常なドナー角膜を記憶媒体に浸した病理学的角膜と比較し、角膜移植片におけるいくつかの間質的特徴(図2、図3、図4、図5、図6、図7、および図8に図示)のFF-OCMで可能になった組織学的様分析が、罹患したヒト角膜組織と正常なヒト角膜組織を区別することを可能にすることを示した。 
瘢痕(図5および図7)、線維組織(図8)、湖(図2)、フォークト脈理(図4)、間質神経径の増加(図4)などの形態学的変化は別として、典型的な間質の特徴は罹患角膜に存在します。間質品質評価に特に関連する間質パラメータは、ボーマンの層の厚さとその変動性、および間質反射率であるように思われます。したがって、プロトコル内の重要なステップはステップ4.1と4.3です。
特にボーマン層は、人間の角膜の発達中に分泌されますが、妊娠19週までに明確になり、出生後に修復することはありません32。したがって、ボーマン層の損傷は不可逆的であり、屈折矯正手術、感染性角膜炎、円錐角膜によって引き起こされる損傷を含む、ドナー角膜組織における以前の間質損傷の理想的な指標として機能します。ドナー角膜使用の禁忌を構成するこのような角膜疾患は、中断と瘢痕化によるボーマン層の厚さの減少と変動に関連しており(図5)、ドナーの病歴が正確にわからない場合、現在のアイバンクプロトコルでは見逃される可能性があります。
死後の角膜浮腫によりドナー死亡後、角膜の透明性が損なわれますが、後方散乱光の量、または間質反射率は、間質の深さとともに指数関数的に減少すると予想されます(図3および図4Aを参照)。その結果、正規化された間質反射率の対数は、正常なドナー角膜の間質深さの一次関数になり、1に近いR2乗値で表されます。逆に、巨視的特徴の存在は、非線形対数深度プロファイルに関連しており、間質疾患を示しています(図4Bおよび図7)25。
角化細胞密度は間質コラーゲン線維および細胞外マトリックスの合成および再生に関与しているため、角化細胞密度はドナー間質の質を評価するための別の関連パラメータであり、非常に低い角質細胞数を示す組織は移植すべきではないと考えるのが妥当であるように思われる。したがって、このプロトコルには、アイバンク25で簡単に使用でき、共焦点顕微鏡の慣例に従うFF-OCM画像からケラトサイト密度を測定するための正確で信頼性の高い方法が含まれています。FF−OCMでは、角化細胞密度は、断面図33において角化細胞を直接計数することによっても決定することができ、これは、角化細胞を複数のエンフェイススライス上で計数することを必要とする共焦点顕微鏡法に対する潜在的な利点である。しかし、角化細胞密度が正常対照34,35,36,37よりも疾患患者で低く、疾患の重症度34,38と相関することが実証されている生きている患者とは異なり、これはヒトexvivo組織サンプルには当てはまりませんでした25移植後の良好な視力回復をもたらすために、ドナー角膜に最小限の数の角膜細胞が必要かどうかを判断するには、さらなる研究が必要です。病理組織におけるようにドナー組織における低い角化細胞密度は、老化、虚血によって誘発される細胞の死後喪失、および/またはドナー組織の貯蔵によって説明することができる27,39,40,41。また、このプロトコルで取得および画像化された正常なドナー角膜は、保存されて浮腫性または腫れが解消されたか、EUアイバンク協会の基準に従って内皮の質が悪いために移植前にアイバンクによって廃棄されていたことも指摘する必要があります。FF−OCMイメージングが記載されたプロトコルと共にアイバンク設定に含まれるとしたら、角膜は通常、ここで可能であったよりも新鮮な状態で評価され、角化細胞密度に影響を与える可能性がある。
間質品質分析のためにここで説明したプロトコルは、デスメ膜の評価のために拡張することができ、これは厚さおよび構造の観点からFF-OCMでも解決することができる21,24。これは、薄いデスメ膜を間質から分離するのがより困難である可能性があるデスメ膜内皮角膜移植術の組織の選択に役立つ可能性があります。
結論として、FF-OCMは、保存中のヒトドナー角膜間質の正確で信頼性の高い評価を可能にします。移植片の質を改善することにより、このプロトコルを現在のアイバンキング手順に追加することで、ドナー組織のスクリーニングと選択、ひいては角膜移植術の結果を改善する可能性があります。FF-OCMデバイスのアイバンクルーチンへの実際の統合は、カスタムCMOSカメラの開発による画像取得の高速化と視野の拡大、角膜の保管とイメージング中の取り扱いのためのカスタム滅菌使い捨てカセットの設計など、最近の技術アップデートによって促進されるはずです。

角膜疾患は、世界中の失明の主な原因の一つです1。いくつかの疾患は外科的にしか治療できず、多くの場合、最近死亡した個人から採取した提供された組織、移植片による、罹患した角膜の一部(すなわち、層状角膜形成術)または全体(すなわち、貫通性角膜形成術)の置換を伴う。内皮に影響を与えない角膜疾患(例えば、円錐角膜、感染性角膜炎後の間質瘢痕、外傷、および間質ジストロフィー)の場合、深部前層状角膜移植術(DALK)は現在、選択の外科的技術と見なされています2,3,4,5。この技術は、移植片拒絶反応の発生率の低下、内皮拒絶反応の欠如、内皮細胞損失の低下、および良好な費用対効果比に関連する中心角膜上皮および間質のみを置換することにより、レシピエントの角膜内皮の保存を可能にします6,7,8,9,10,11 .DALKはさらに、この妥協した層が移植されないため、内皮の品質が最適ではない角膜を移植片として使用することを可能にします12。逆に、ドナー角膜間質の質は、間質が残る唯一のドナー角膜層であり、ドナー上皮がレシピエント上皮に置き換えられるため、移植片の成功と視力回復の主要な制限要因になる可能性があります。残念ながら、アイバンクのドナー角膜間質を評価する手段は限られています。それらは通常、組織回収が除核によって行われる場合のドナー眼球の細隙灯検査およびドナー間質13の光学顕微鏡検査を含む。一部のアイバンクでは、フーリエ領域光干渉断層撮影法(FD-OCT)14を使用して、このような標準的な手順を補完し始めています。
超音波画像化15の光学類似体である眼科用光干渉断層撮影(OCT)は、広帯域光または同調可能な光の干渉を使用して、網膜16および前部セグメント17の光学切片を生成する。初期の臨床システムの基礎である時間領域OCTでは、参照ミラーの位置が変更され、参照ビームがさまざまな組織界面で反射されたビームとほぼ同じ時間移動するたびに干渉パターンが現れ、時間の関数としてA-スキャンが生成されます。現代のほとんどの臨床システムの基礎であるFD-OCT(スペクトル領域または周波数領域OCTとも呼ばれます)では、リファレンスミラーを1つの位置に固定し、すべての干渉パターンが混在した個々のA-スキャンを一度に取得し、フーリエ解析によって分解します。
臨床(時間領域またはスペクトル領域)OCTシステムでは、角膜の断面図と、細隙灯生体顕微鏡よりも高い軸方向分解能で間質混濁の検出が可能ですが、横方向の分解能は限られています。共焦点顕微鏡18 は、組織学的詳細に近づく横方向の解像度で角膜の検査を可能にするが、軸方向に制限される。
フルフィールド光干渉断層顕微鏡(FF-OCTまたはFF-OCM)19,20は、共焦点顕微鏡とOCTの両方の要素を組み合わせて、約1μmの軸分解能に匹敵する横方向の分解能を達成します。より具体的には、FF-OCMは、インコヒーレント広帯域光源(ハロゲンランプなど)と高開口光学系を使用して、横方向スキャンなしで顔2D断層画像を取得します。FF-OCMは、深さ方向にスキャンすることにより、新鮮または固定されたex vivo生体組織サンプルの非侵襲的な3Dイメージングを可能にします。角膜21、22、23を画像化するために用いられている。FF-OCMは、高解像度の顔面図と断面図の両方を提供することにより、角膜の組織学的構造と細胞の詳細の両方に関する情報を提供します。実際、FF-OCMは組織学よりも優れた構造情報を提供することが示されており、スペクトルドメインOCTと共焦点顕微鏡の組み合わせで可能であったように、より多くの疾患指標を特定することができました24,25。
ここでは、FF-OCMを用いた角膜ドナー間質の定性的および定量的評価のためのプロトコルについて説明します。この方法は、3つの定量的間質パラメータ(すなわち、ボーマン層の厚さとその変動性、および間質反射率)を含む、間質状態を示す巨視的および微視的特徴の組織学的様分析に基づいている。したがって、記載されたプロトコルは、正常および異常な角膜組織に適用され、正常なヒト角膜組織からの罹患の区別を可能にする。

<table><tbody><tr><td>Light-CT Scanner</td><td>LLTech, France</td><td>http://www.lltechimaging.com/products-applications/products/</td> <td>この原稿で画像化に使用したFF-OCM装置</td></tr><tr><td>CorneaJet</td><td>EuroBio, France</td><td>http://www.eurobio-cornea.com/en/corneamax-10-100-ml-xml-352-822.html</td><td>ドナー角膜が保存されている臓器培養液</td></tr><tr><td>CorneaMax</td><td>EuroBio, France</td><td>http://www.eurobio-cornea.com/en/corneajet-10-50-ml-xml-352-823.html</td><td>デキストランを添加した臓器培養液 濁液&nbsp;</td></tr><tr><td>Fiji (ImageJ)</td><td>National Institute of Health, Bethesda, MD, USA</td><td>https://fiji.sc/</td> <td>オープンソース画像処理ソフトウェア</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks, Inc., Natick, MA, USA</td><td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td><td>Mathematical computing software</td></tr></tbody></table>

角膜移植片の間質特徴の組織学的様解析のための全視野光コヒーレンス顕微鏡

Full-Field Optical Coherence Microscopy for Histology-Like Analysis of Stromal Features in Corneal Grafts

総角膜厚さの約90%を占めるドナー角膜間質の質は、深部前層状および穿通性角膜移植術の成功の主要な制限要因の1つである可能性があります。これらは、最近亡くなった個人から採取した寄付された組織である移植片によって、それぞれ病気の角膜層の一部または全部を置き換えることを含む外科的処置です。しかし、眼科バンクにおける角膜移植片の間質を評価する手段は限られており、疾患指標の高解像度定量的評価の能力に欠けている。フルフィールド光干渉顕微鏡(FF-OCM)は、新鮮または固定された ex vivo 生体組織サンプルの高解像度3Dイメージングを可能にし、ドナー角膜の評価に適した非侵襲的技術です。ここでは、FF-OCMを用いた角膜間質の定性的・定量的解析方法について述べる。このプロトコルは、正常なドナー角膜および病理学的角膜ボタンにうまく適用されており、肉眼的および微視的レベルの両方で健康および病理学的特徴を特定するために使用でき、それによって角膜移植術の結果を損なう可能性のある間質障害の検出を容易にします。移植片の品質管理を改善することにより、このプロトコルは、ドナー組織のより良い選択(および拒絶)をもたらし、したがって移植片の失敗を減らす可能性があります。

この原稿で使用されているFF-OCMデバイス(材料表を参照)28と一般的なセットアップを図1に示します。図2は、臓器培養培地に保存した後のヒトドナー角膜の腫脹を示しており、浮腫性角膜の病態生理学的モデルを与え、浸透深さが限られているため、角膜の厚さ全体にわたってFF-OCM画像の取得を妨げています。デキストラン補充臓器培養培地への転写は、図3に示すように、脱膨潤を引き起こし、正常な厚さのドナー角膜をもたらす。罹患角膜は、形態学的変化および間質の厚さの減少および変動(図4)および/またはボーマン層(図5)を含む典型的な間質の特徴によって認識することができる。角化細胞密度(図6)と間質反射率(図7)の評価は、臨床OCTシステムの能力を超えて、FF-OCMによる正常角膜組織と病理学的角膜組織の組織学的分析および鑑別をさらに支援する可能性があります(図8)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57104/57104fig1.jpg"> 図1:本作で使用した一般的なセットアップとFF-OCMデバイスの概略図と写真。(A) FF-OCMデバイスの写真(資料表参照)28.(B)デバイスの回路図と光学セットアップ。(C)サンプルホルダー内のヒトドナー角膜の写真。(D)液浸対物レンズとサンプルホルダーをズームします。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57104/57104fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57104/57104fig2.jpg"> 図2:乱流前の臓器培養正常ヒト角膜。 臓器培養培地への貯蔵によって引き起こされる腫脹(「浮腫性」)角膜の断面図(A)および en顔 図(B、間質をスライス)で、湖は暗い領域として見ることができます(矢印で示されています)。角膜の厚さは1,100μm以上に倍増し、深さ全体を通して画像取得が妨げられています。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57104/57104fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57104/57104fig3.jpg"> 図3:駆流後の臓器培養正常ヒト角膜。 角膜全体を通した断面図(A)およびデキストラン補充培地に浸された角膜の 伸潤 した角膜の正面図(B)は、規則的に分布した高反射性(白色)角化細胞を示す。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57104/57104fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57104/57104fig4.jpg"> 図4:間質の厚さを含む間質の形態と特徴の全体的な評価。 正常なヒト角膜(A)と比較して、円錐角膜(B)を有する角膜は、断面図で暗い垂直帯として観察できる多数の平行なVogt脈理、および中間質 顔 スライス(C)に見られる可能性のある厚い間質神経とともに、減少し、間質の厚さが変化することを特徴とする。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57104/57104fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57104/57104fig5.jpg"> 図5:超反射性上皮基底膜によって前方に、非常に前間質の超反射性角化細胞によって後方に描かれているボーマン層の厚さの評価。 正常なヒト角膜(A)と比較して、病理学的角膜(例えば、円錐角膜)(B)は、中断および瘢痕化のために減少し、ボーマン層の厚さが変動することを特徴とする。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57104/57104fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57104/57104fig6.jpg"> 図6:角化細胞密度の評価。 (A)角化細胞核は、300 μm x 300 μmの関心領域を選択した後、強化および反転した 顔 画像で手動でカウントされます。(B)カウントされた核は矢印で示されています。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57104/57104fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57104/57104fig7.jpg"> 図7:間質反射率の評価。 後方散乱光の量は、正常なドナー角膜の間質の深さとともに(指数関数的に)減少し(図 3 および 図4Aを参照)、1に近いR2乗値で表される線形対数深度プロファイル(緑色のトレース)になります。これは、光後方散乱が増加した間質領域を特徴とする病理学的角膜には当てはまらない可能性があります( 図4Bを参照)。感染性角膜炎後の間質性瘢痕を有する角膜の例(挿入図に描かれている)のように、そのような巨視的特徴の存在は、したがって、特定の閾値未満のR二乗値(例えば、0.9425未満;赤いトレース)で表される非線形対数強度深さプロファイルを作成する。対数振幅深度プロファイルは、FF-OCMがサンプルの強度ではなく後方散乱光の振幅を測定するため、実際には示されていることに注意してください。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57104/57104fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57104/57104fig8.jpg"> 図8:組織学およびスペクトルドメインOCTに対するFF-OCMの利点のデモンストレーション。 (A)組織像および(B)角膜移植術前のイン ビボで 同じ角膜上で取得された対応するスペクトルドメインOCT画像。(C)角膜移植後の ex vivo 角膜ボタンの対応するFF−OCM断面を、臨床スペクトル領域OCT画像と比較して優れた解像度を示す図である。線維症はまた、組織学よりもFF-OCM画像でよりはっきりと見える。上部間質におけるケラトサイトの高密度は、(C)断面図と(D) 顔 面図の両方ではっきりと見ることができます。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57104/57104fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

角膜ドナー間質の高品質評価のための方法としてのフルフィールド光干渉顕微鏡の使用について説明します。このプロトコルは、健康または疾患を示す特徴を特定するために使用でき、ドナー組織のスクリーニングと選択、したがって角膜移植術の結果を改善することを目的としています。

The quality of donor corneal stroma, which makes up about 90% of total corneal thickness, is likely to be one of the main, if not the major, limiting ...

この方法は、アイバンクにおける角膜ドナー組織のスクリーニングおよび選択を改善し、角膜移植の結果を高めることができる。この技術の主な利点は、その高解像度評価機能と、画像取得中ずっと角膜が記憶媒体で満たされた密閉チャンバーに浸されたままであり、汚染の潜在的なリスクを低減します。手順を実演するのは、私たちの研究室を卒業した博士号のマエル・ビルバートです。まず、上皮を上に向けて、サンプルホルダー内の保存媒体に浸した角膜を配置します。サンプルホルダーに付属の清潔なシリカカバースリップを角膜の上に置きます。次に、サンプルがわずかに平らになり、カバースリップの下に固定されるまでベースをゆっくりと回してホルダーを閉じ、比較的均一なイメージング面を提供します。気泡を避けるために予防策を講じてください。液浸媒体としてカバースリップに眼科用または光学用ゲルの厚い層を適用します。デバイスの背面にある電源スイッチをオンにして、デバイスを初期化します。デバイスの前面にある緑色のLEDの点灯は、電源がオンになっていることを示します。可動トレイを除いて、イメージングステージが透明であることを確認してください。次に、アクイジションソフトウェアで[OK]をクリックして、プロンプトでモーターを初期化します。デバイスを設定するには、指定された必須フィールドにサンプル識別子を入力します。また、必要に応じて、サンプルの説明と試験の説明を入力します。次に、[マクロ イメージの取得] をクリックして、後で横方向の配置やナビゲーションに使用できるサンプルのスナップショットを作成します。問題がなければ、[はい] をクリックしてプロンプトでイメージを検証します。その後、デバイスはサンプルトレイを対物レンズの下に移動し、自動調整を実行します。先に進む前に、顕微鏡の対物レンズが光学ゲルに十分に浸されていることを確認してください。[探索] タブに移動して取得を準備します。画像のスタックを取得する前に、ジョイスティックまたは画面上の手動選択を介して角膜の中心に移動します。ジョイスティックの回転、スライダーの調整、またはグラフィカルユーザーインターフェイスの手動キーボード入力により、イメージング深度を変化させます。次に、最適な角膜イメージングのために平均値を40に調整します。角膜表面値または最初の画像位置を深度フィールドに入力します。次に、[取得]タブを選択して画像を取得します。デバイスの軸方向の解像度に一致するスライス間隔を選択して設定します。[スライス数] に角膜の厚さの値を入力します。パラメータと取得時間を確認します。そして、満足したら、[OK]を押して取得を開始します。取得中は、顕微鏡が配置されているテーブルとの接触を避けてください。間質層とボーマン層の厚さを評価するには、角膜断面の距離を測定します。たとえば、テキスト原稿で説明されているように、断面全体に5つの等間隔のポイントを追加します。既知の距離の 2 つのポイント間に、デフォルトの視野に従って線を引きます。次に、[分析]タブに移動し、[スケールの設定]を選択します。既知の距離と長さの単位を適切なフィールドに入力します。1024 ピクセルまたは 780 マイクロメートルに設定し、[OK] をクリックします。距離が不明な2点の間に線を引き、ステータスバーから直接測定された長さまたは距離を読み取ります。平均と変動係数を記録します。[画像]タブをクリックし、[スタック]の下の[再スライスZ]を選択して、ケラチノサイト密度を決定します。これにより、間質と顔の画像を7つのグループに合計して、同等の厚さのスライスが生成されます。さらなる分析のために、前部間質の利用可能なすべての顔スライス、前間質の15枚の画像、中間質の5枚の画像、および後部間質の5枚の画像を含めます。各エンフェイス画像で、300 x 300マイクロメートルの関心領域を選択します。核の視覚化を強化するには、[編集]タブの[反転]を使用して画像を反転します。コントラストと明るさを調整するには、[画像]タブをクリックし、[明るさ-コントラスト]に移動します。細胞核を手動でカウントするには、[プラグイン]に移動し、[分析]タブの[セルカウンター]に移動します。 [初期化]を押して、カウンターの種類を選択します。次に、反転画像内の暗い楕円形の特徴をクリックして細胞核を数え、画像の4つの側面のうち2つだけの画像の境界に着地するものを考慮します。選択されたヒトドナー角膜は、臓器培養培地に保存した後に腫脹し、浮腫性角膜の病態生理学的モデルを与え、浸透深さが限られているため角膜の厚さ全体を通して画像取得を妨げました。デキストリン補充臓器培養培地への移送は、腫脹を減少させ、正常な厚さのドナー角膜をもたらした。罹患角膜は、形態学的変化および可変間質厚さまたはボーマン層の減少を含む典型的な間質的特徴によって認識された。ケラチノサイト密度と間質反射率の評価は、臨床光干渉断層撮影システムの能力を超えたフルフィールド光干渉顕微鏡による正常角膜組織と病理学的角膜組織の組織学的分析と鑑別をさらに支援しました。このビデオを見た後、正常なヒト角膜組織からの疾患の区別を可能にする角膜間質の定性的および定量的組織学的分析を実行する方法をよく理解する必要があります。

full-field-optical-coherence-microscopy-for-histology-like-analysis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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