Name: 脂肪酸13C Isotopologue プロファイリング栄養炭素転送および無脊椎動物消費者の脂質代謝への洞察力を提供します。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: 学ぶアイソトポローグプロファイリングによる無脊椎動物消費者の脂質代謝と食物網生態学の解明。土壌生態系における栄養炭素転送の追跡手法を習得できます。

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R ・ メンツェルとドイツ研究振興協会 (RU RU780/11-1) によって L. ・ ルッスの財政支援は、感謝します。R. Nehring RU 780/10-1 によって資金を供給されました。最後に、原稿の校正のため博士ハシバミ Ruvimbo Maboreke に非常に感謝しています。

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<li>Bec, A., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.2041-210X.2011.00111.x/abstract">Assessing the reliability of fatty acid-specific stable isotope analysis for trophic studies.</a> Methods in Ecology and Evolution. 2 (6), 651-659 (2011).</li>
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<li>Eisenreich, W., Dandekar, T., Heesemann, J., Goebel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+metabolism+of+intracellular+bacterial+pathogens+and+possible+links+to+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Carbon metabolism of intracellular bacterial pathogens and possible links to virulence.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (6), 401-412 (2010).</li>
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<li>Haubert, D., Haggblom, M. M., Scheu, S., Ruess, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fungal+food+quality+and+starvation+on+the+fatty+acid+composition+of+Protaphorura+fimata+%28Collembola%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+B-Biochemistry+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of fungal food quality and starvation on the fatty acid composition of Protaphorura fimata (Collembola).</a> Comparative Biochemistry and Physiology B-Biochemistry & Molecular Biology. 138 (1), 41-52 (2004).</li>
</ol>

Isotopologue のプロファイル
FAs 13C 分布の定量的側面の詳細な分析では、炭素の食物網でのパーティション分割を割り当てるには最先端の技術を必要があります。現在の仕事は isotopologue 13C を評価するためにプロファイリングを採用/熱帯の相互作用のための共通の FA バイオ マーカー12C 比。このメソッドでは、液体クロマトグラフィー (LC MS) によるアミノ酸分析の確立しているし、病原細菌17,23炭素代謝の調査に適用しました。ごく最近、isotopologue プロファイルさらに開発された小さな土壌無脊椎動物の脂質の食事ルーティングを研究するためのツールとしてメンツェルらによって24このメソッドは13C 信号の上「キャリー」によって妨げられていな...

土壌など不可解な生息地で栄養関係解決困難な動物のサイズが小さいによってさらに制限されます。最後の十年は、フィールド条件1,2,3の下の土壌動物相の供給戦略を定義するためのバイオ マーカーとしての脂肪酸の使用で特に、生化学的な生態学の進歩を見ています。これは全体の分子として消費者組織のリソースから脂肪酸を組み込むことができるという事実に基づく、食事ルーティング4と呼ばれる、プロセス。脂肪酸の転送は、以上 3 つ栄養のレベル、すなわち、菌類から粘管目5線虫に報告されています。最近では、捕食動物は、6、7を考慮され、土壌食物網における栄養マーカーとして脂肪酸の最初のレビューが公開された8,9をされています。
栄養相互作用の詳細については、脂肪酸の安定同位体プロービング (FA SIP) によって達成されます。13C の定量/ダイエットと消費することができます脂肪酸12C 比バイナリ リンクのせいと関連付けられている炭素フローを見積もるし、地上波で採用されている、淡水、海洋の食物網10,11 ,12,13。基本的な前提は、ルーティングされた脂肪酸が酵素プロセスの対象とはしたがっての13C 信号、すなわち、 13C/12C 消費者の脂肪酸の比はダイエット1に類似しています。ただし、食物連鎖を13C 署名の段階的な減少は栄養研究14,,1516FA SIP の広範なアプリケーションをそれにより妨げる水生システムで報告されています。さらに、地上の食物網におけるほとんどの無脊椎動物の脂質代謝の知識はまだ限られています。
栄養マーカー脂肪酸食物網生態学における定量的炭素フローの決定のための手段としての使用のための消費者における脂質代謝経路の理解が欠かせません。念頭、 13C isotopologue のプロファイリングは、原理的にはすべての生物学的システムの17、炭素代謝の調査のため適用できる有望な方法であります。13C 標識炭素基板、 13C 代謝ネットワーク内の分布の導入は消費者を特定の isotopologue 分布の生成された代謝産物からトレースできます。これは定量核代謝共鳴分光法18,19または質量20,は21、その高いため低バイオマス後者の支持された生体試料によって評価されることができます。感度。
ただし、isotopologue プロファイルがされて正常にアミノ酸に適用し、細菌性病原体17,22,23, 脂肪酸の実装の体内の炭素代謝に洞察力を提供酸が遅れています。安定同位体標識前駆体脂肪酸、その食物ルーティングや劣化、土壌無脊椎動物の消費者に β 酸化を介しての運命の最初の詳細な分析、最近メンツェルらによって実行されました。24. 13C 標識脂肪酸 isotopologue による頻繁な土壌無脊椎動物、トビムシ、キーの子孫の後で導入実験の方法論的基礎を提供するここでは。これらの植栽は、土壌食物網とがよく、栄養マーカー脂肪酸8,25の調査の重要なコンポーネントは、フォームの良いモデル グループです。
栄養マーカー脂肪酸食物網生態学における定量的炭素フローの決定のための手段としての使用のための消費者における脂質代謝経路の理解が欠かせません。現在のプロトコルは、トビムシから実験、および抽出および支配的な脂質画分 (中性脂質、リン脂質) のメチル化のための生化学的なプロシージャを供給所のデザインと設定を与えます。質量分析法による脂肪酸の isotopologue 組成を分析する方法について説明し、関連の数式と計算について説明します。この手順の結果: (i) 1 つ以上によって (すなわち、脂肪酸分子イオン M+) 親イオンの質量を超える isotopologues の比質量単位 (M+1、+2M、M+3、等) および (ii) 全体1313C 標識前駆体由来の脂肪酸で C 濃縮。このアプローチは、これらは、成功したラベルの吸収量を確保するための制御された条件下で十分な量の培養とその後を前提に他の捕食者-被食者相互作用に適用できる一般にトビムシに使用、検証します。

<table><tbody><tr><td>neoLab-Round jars</td><td>neoLab</td><td>2-1506</td><td>69 x 40 mm, 10 pacs/pack</td></tr><tr><td>Charcoal activated</td><td>Carl Roth</td><td>X865.1</td><td>p.a., powder, CAS No. 7440-44-0</td></tr><tr><td>Alabaster Dental</td><td>R&Ouml;HRICH-GIPSE</td><td>---</td><td>http://www.roehrich-gipse.de/dentalgipse.php</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>カール ロス</td><td>7331.1</td><td>HPLC &ge; 99,9 %</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>カール ロス</td><td>P717.1</td><td>HPLC &ge; 99,9 %</td></tr><tr><td>ヘキサン</td><td>カール ロス</td><td>7339.1</td><td>HPLC &ge; 98 %</td></tr><tr><td>tert-ブチル メチル エーテル (MTBE)</td><td>カール ロス</td><td>T175.1</td><td>HPLC &ge; 99,5 %</td></tr><tr><td>アセトン</td><td>カール ロス</td><td>7328.2</td><td>HPLC &ge; 99,9 %</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>カール ロス</td><td>6771.1</td><td>p.a. &ge;99%、ペレット</td></tr><tr><td>ジナトリウム水素リンファット</td><td>カールロス</td><td>P030.1</td><td>p.a. &ge;99%、水を含まない</td></tr><tr><td>Na-ジ水素リンファット二水産物</td><td>カールロス</td><td>T879.1</td><td>p.a. &ge;99 %</td></tr><tr><td>次亜塩素酸 (6 N)</td><td>VWR International</td><td>26,115,000</td><td>AVS TITRINORM vol. solution</td></tr><tr><td>Bond Elut (Columns)</td><td>Agilent Tech.</td><td>14102037</td><td>HF Bond Elut-SI、500 mg、3 mL、50/PK</td></tr><tr><td>Pr&auml;パラテングル&auml;ser Duran</td><td>Glasger&auml;tebau Ochs</td><td>135215</td><td>&Oslash; 16 x 100 mm、および便利なローレットと統合されたPTFE/シリコーンガスケットを備えたスクリューキャップ</td></tr><tr><td>Supelco 37 Component FAME Mix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47885-U Supelco</td><td>10&nbsp;塩化メチレン中のmg/mL、分析標準</td></tr>液 <tr><td>FlowMesh</td><td>Carl Roth</td><td>2796.1</td><td>ポリプロピレンメッシュ、厚さ約0.3 mm、ストランド間隔1 mm</td></tr> 細菌<tr><td>酸メチルエステル(BAME)ミックス</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47080-U Supelco</td><td>10&nbsp;mg/mL カプロン酸メチル、分析標準</td></tr><tr><td>ノナデカン酸メチル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74208</td><td>分析標準 &ge; 98.0 %</td></tr><tr><td>ヘキサデカン酸-1-13C (パルミチン酸)</td><td>Larodan Fine Chemicals</td><td>78-1600</td><td>GC &ge; 98.0 % (13C: 99.0 %)</td></tr><tr><td>RVC 2-25 CDplus</td><td>Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen</td><td></td><td>コンパクト卓上型濃縮器</td></tr><tr><td>Alpha 2-4 LDplus</td><td>Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen</td><td></td><td>乾燥マニホールド</td></tr><tr><td>MZ 2C NT</td><td>Vacuubrand GMBH</td><td></td><td>真空ポンプ</td></tr><tr><td>ロトシェイク Genie</td><td>Scientific Industries</td><td></td><td>ロトシェイクと回転装置の組み合わせ</td></tr><tr><td>XP64 マイクロコンパレータ</td><td>メトラー・トレド</td><td></td><td>超高精度バランス</td></tr><tr><td>GCシステム 7890A</td><td>Agilent Tech.</td><td></td><td>ガスクロマトグラフ</td></tr><tr><td>7000 GC/MS Triple Quad</td><td>Agilent Tech.</td><td></td><td>トリプルクワッド質量分析計</td></tr><tr><td>7683B Series Injector</td><td>Agilent Tech.</td><td></td><td>サンプルインジェクター</td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge 3SR+</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Centrifuge with 10 ml tube rotor</td></tr></tbody></table>

脂肪酸13c isotopologue プロファイリング栄養炭素転送および無脊椎動物消費者の脂質代謝への洞察力を提供します。

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

通常完全な分子として同化、マイナーまたはなしの変更は、異なる栄養段階の間食事ルーティングできるように消費者組織に転送されるため、脂肪酸 (FAs)、食物網の生態学的に有用なバイオ マーカーです。しかし、FA 栄養マーカー アプローチはまだ土壌動物相の脂質代謝の限られた知識によって妨げられます。この調査は、脂肪酸代謝経路の 2 つの広範な土壌トビムシ、 Protaphorura fimataとHeteromurus 光沢苔のトレーサーとして完全ラベル パルミチン酸 (13C16:0、99 の atom %) を使用しました。運命、この前駆体の新陳代謝の変更を調査するために isotopologue のプロファイリングの手法を提案する単一イオンのモニタリングを用いた質量分析法によって行います。さらに、上流の研究室実験を供給、抽出および支配的な脂質画分 (中性脂質、リン脂質) と関連数式および計算のメチル化して説明します。Isotopologue プロファイリング13C 標識前駆体由来の脂肪酸で全体の13C 濃縮収量のみではなく、また親イオン (すなわちFA の分子イオンの質量を超える isotopologues のパターンを生成M+) それぞれのラベルの 1 つまたは複数の質量単位(M+1、+2M、M+3等)で FA。この知識は、デノボ合成と比較して完全に消費された FA の栄養経路の比率に結論をことができます。Isotopologue のプロファイリングは、栄養相互作用を分離する土壌動物における脂肪酸代謝の評価のための便利なツールとして使用することをお勧めします。

トビムシの新鮮な重量と脂質含量 記述されている実験の過程で NLFAs および PLFAs の内容変わりませんでした大幅時間をかけて大幅24が、供試体の重量がわずかに増加したに対し。両方のパラメーターは、トビムシ標本の体力の良いレベルを示します。脂肪酸組成と同位体分析のためのサンプリング日に対応する実験中のトビムシの新鮮な重量および脂質コンテンツを調査するため注意してください。重量の損失および/または実験期間中の脂質含量の減少を示す試験生物の減少フィットネス派生データは大幅に意義を失うことに注意してください。
Isotopologue 検出 プロジェクトのプロファイル isotopologue の特別な意味は個々 の検出と分子イオンと特定の脂肪酸ですべて isotopologues の定量化であります。たとえば、16:0 の場...

すなわち、分子全体消費者組織への伝達と脂肪酸の同化脂肪酸の栄養マーカー アプローチ変更が小さい土壌無脊椎動物の脂肪酸代謝の知識のギャップによって妨げられて無またはマイナー。Isotopologue ・ プロファイリングは、栄養相互作用を分離するための貴重なツールとして提供されます。

脂肪酸13C Isotopologue プロファイリング栄養炭素転送および無脊椎動物消費者の脂質代謝への洞察力を提供します。

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer ...

この同位体プロファイリングの全体的な目標は、無脊椎動物の消費者における食性脂肪酸の栄養移動(その処理や、鎖の伸長やベータ酸化などの脂質代謝を含む)を追跡することです。この方法は、誰が誰を食べているのかなど、土壌のような謎めいた生態系では簡単に答えられない質問など、食物網の生態学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術を実演するのは、Liliane Ruess教授の研究室の修士課程の学生であるDilara Simsekです。しっかりとフィットする蓋付きのプラスチックの小宇宙を準備するには、石膏ポットで、パリの石膏9部と乾燥活性炭1部を混ぜます。蒸留水10部を加え、混合物を5分間攪拌せずに室温で放置します。ラボスプーンを使用して、混合物を時計回りに適度な速度でかき混ぜ、濃厚でスープのような粘稠度が達成されるまで気泡を避けます。次に、混合物を約1センチメートルの高さまで小宇宙に注ぎます。漆喰をベンチを軽く叩いて渦を巻くことで、石膏を滑らかにします。気泡や溝からの穴に滅菌ヘラが追加されると、肥沃なコレンボラがそこに卵を産むのを促進する可能性があることに注意してください。しかし、この研究では、穴や溝を避け、同じ再現可能な条件を持つことを支持しました。小宇宙を乾燥させてから湿らせた後、小さなメッシュを取り付けた吸引チューブを使用して、孵化したばかりの30個のコレンボラを小宇宙の石膏ベースに移します。ナイフの先端約1本分の粒状乾燥パン酵母を食品として提供し、少なくとも週に2回更新します。サンプリング日ごとに 3 回の独立した反復を計画します。この研究では、0日目から7日目と14日目をサンプリングしました。15°Cの暗闇で小宇宙をインキュベートし、脂肪酸は動物の代謝によって膜の流動性の要件を満たすように変化するため、一定の温度を維持します。動物を収穫するには、テキストプロトコルに従って計量した直後に、動物をスケールパンから10ミリリットルのガラス試験管に慎重に移します。1ミリリットルのHPLCグレードのメタノールを使用してチューブを充填し、分析まで摂氏マイナス20度で保存します。サンプルの各バッチに3本のガラス試験管を調製し、サンプルに塗布したメタノールを還元して保存した後、ブランクを含む5ミリリットルの単相抽出溶媒を各サンプルに加え、室温で200rpmで一晩振とうしてCollenbolan脂質を抽出します。テキストプロトコルに従ってサンプルを抽出した後、脂肪酸パターン分析を実施するために、各カラムに2ミリリットルのクロロホルムを添加することにより、各サンプルのシリカ酸カラムを予め調整します。クロロホルムがカラムを通過した後、ガラス製のパスツールピペットを使用して、サンプルから下部クロロホルム相を除去します。次に、それを個々の列に転送します。5ミリリットルのクロロホルムを使用して、中性脂質(NLFA)を個々のガラス容器に分画的に溶出します。次に、10ミリリットルのアセトンを使用して糖脂質を溶出し、5ミリリットルのメタノールを使用してリン脂質脂肪酸(PLFA)を溶出します。抽出後、NLFAおよびPLFAオープンチューブを回転真空濃縮器(RVC)に移し、サンプルを摂氏60度で24hPaの真空で約90分間または乾燥するまで蒸発させます。脂肪酸メチルエステル(FAME)を単離して洗浄した後、ガラスパスツールピペットを使用して、上部脂質含有相をテフロンセプタムを備えたガラス製クロマトグラフィーサンプルバイアルに移します。バイアルをカプセル化し、分析まで摂氏マイナス20度で保管します。NFLAおよびPLFAサンプル中のFAMEを同定するには、GC-FIDで、製造元の指示に従って、装置のそれぞれのソフトウェアでシーケンスを設定します。外部標準混合物でシーケンスを開始し、次にサンプルを並べます。GCカラムからの脂肪酸の溶出時間には、各分析でわずかに遅延が生じます。サンプル配列に10回目ごとの分析に標準試料を含めるか、パルミチン酸の保持時間ロックを使用します。プログラムを設定し、テキストプロトコルに従って脂肪酸のnmolを計算します。同位体プロファイリングによる炭素13分析を行うには、極性キャピラリーカラムを使用すると、同じ数の二重結合でも不飽和脂肪酸を分離できます。GCカラムの選択は、脂肪酸中の分子イオンの適切な表現を決定するため、結果にとって重要です。DB-23カラムの場合、オーブンの温度を摂氏130度で開始し、毎分摂氏6.5度ずつ上昇させて摂氏170度にします。続いて、毎分摂氏3度から摂氏203度まで上げ、1.9分間保持します。その後、毎分40°Cずつ増やして230°Cまで進め、8.3分間保持します。トランスファーラインの温度を摂氏280度に設定します。テキストプロトコルに従ってプログラムのセットアップが完了したら、最初に最初のスキャンを実行して脂肪酸の分子イオンに炭素13が組み込まれていることを判定します。次に、適切なイオンに対して選択イオンモニタリング(SIM)を実行し、それぞれの脂肪酸のクロマトグラフィーピーク時間を網羅したm/zスキャンウィンドウ(SIMグループ)を選択することで、目的の分子量でデータを取得します。通常、分析種と時間枠ごとに2〜4個のイオンをモニターします。質量開発には、外部脂肪酸標準試料を含む総イオンカウントを使用します。それらの保持時間とフラグメントイオンに基づいて、時間セグメントが選択されます。それぞれの脂肪酸とそのすべての同位体(M plus one、M plus twoなど)の分子イオン(M plus)を検出します。栄養炭素フラックス、炭素13取り込みの位置を割り当て、テキストプロトコルに従って炭素13濃縮を計算します。この図は、純粋な 16 対 0 のパルミチン酸の SIM-MS スペクトルを示しています。この化合物中の炭素13の自然な存在量は、分子イオンM plusに加えて、M plus oneおよびM plus twoの同位体の存在によって検出可能になります。比較すると、このスペクトログラムは、標識されたパルミチン酸全体を表します。ここで、イオンM plus 16の唯一の出現は、合成標識化合物の高純度を反映しています。以下のSIMスキャンは、標識後の最初のサンプリング日におけるHeteromurus nitidusのPLFA画分中の4つの主要な脂肪酸から得られたものです。標識されたマーカー分子のパルミチン酸への同化は、標識された脂肪酸全体を表すため、M plus 16同位体の存在量によって明らかになります。さらに、16から0への彩度低下、または伸びと彩度の低下を割り当てることができます。これにより、Mプラス16よりも大きい同位体、例えば、Mプラス17およびMプラス18の検出は、C2−13フラグメントの使用による標識前駆体16のゼロへの鎖延長を実証する。ここに示されているのは、イオン M プラス 1 から M プラス 3 および M プラス 16 から M プラス 20 の相対的な部分で、Protaphorura fimata からの最も重く標識された NLFA と PLFA の 5 つであり、0 日目と 1 日目に推定されます。この手順を試みる際には、消費者が特定のC同位体を自然に構成していることを覚えておくことが重要です。この量は、ラベル食を使用しない対照実験で決定する必要があります。この自然な特定のC信号送信は、ラベルテンプレートから背景として差し引かれます。溶剤の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、予防策を講じる必要があることを忘れないでください。

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脂肪酸¹³C Isotopologue プロファイリング栄養炭素転送および無脊椎動物消費者の脂質代謝への洞察力を提供します。

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