Name: 動的なを促進するために齧歯動物のミクログリアの分離と培養分岐無血清培地の形態 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: 学ぶ齧歯動物のミクログリア分離・培養法。無血清培地で高純度ミクログリアを維持し、形態とCNS細胞との相互作用を研究。神経科学におけるミクログリア機能解明に有用な手法です。

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この作品はクリストファーと脊髄損傷、博士ミリアムとシェルドン g. アデルソン医療研究財団、JPB、ノバルティス研究所の基礎研究、ダナ リーブ財団国際研究コンソーシアムによって支持されました。デイモン ・ ラニアンがん研究振興財団 (DRG-2125-12) とステラ ・ コーツ、ヴィンセントからの寛大な貢献。

齧歯動物を含むすべてのプロシージャは、国立と州法およびポリシーに準拠したスタンフォード大学のガイドラインに適合。動物のすべてのプロシージャは、スタンフォード大学の研究所動物愛護管理パネルによって承認されました。
注: すべてのソリューションとバッファー組成材料のテーブルで提供されます。
1. 準備ペトリ皿 CD11b Immunopanning (0 日)
注: は、すべての 1-2 の幼若ラット脳の 1 immunopanning 料理を準備します。
<ol><li>15 cm のシャーレに 50 mm Tris pH 9.5 液 25 mL を追加します。</li>
	<li>6 μ G/ml の最終的な集中のための料理にヤギ抗マウス IgG (H + L 鎖) を追加します。均等に板を旋回します。</li>
	<li>37 ° C で 1-3 h の皿を孵化させなさい</li>
	<li>DPBS ++ (リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) Ca2 +と Mg2 +) と 3 回リンス料理パン 1 μ G/ml OX42 抗体を含むバッファーのソリューションに置き換えます。平らな面に室温で一晩料理を残します。</li>
</ol>2. 組織コレクション (1 日目)
注: このプロトコルは、3 〜 4 時間を取る必要があります。
<ol><li>始める前に、すべてのソリューションは、滅菌、冷たい氷の上を確認します。氷の上のすべての機器を冷やすし、使用前にエタノールで消毒します。</li>
	<li>次の適切な規制制定手続、二酸化炭素の窒息によって少年の実験用ラットを犠牲に。 注: また、若い動物が犠牲になるケタミン ・ キシラジン (24 mg/mL ケタミン、2.4 mg/mL キシラジンの 100-200 μ L) の致命的な線量を持つ。動物は年齢の 14 日以内である場合、ケタミン ・ キシラジンを使用する必要があります。複数の動物を使用している場合 1 つの動物から組織を抽出し、その後動物に進む前に氷の上あらかじめ冷やした DPBS+ +に配置。</li>
	<li>続行する前に動物から完全な応答がないを確保して、後足をピンチします。</li>
	<li>Transcardially は、10-30 mL の冷たい血流バッファー バッファー クリアを実行するまでに 27 G の針を使用して動物を灌流します。 注: 灌流バッファーの量は、動物のサイズ/年齢によって異なります。</li>
	<li>灌流後すぐに動物の頭を削除します。両側後頭顆を解剖ハサミで切って脊髄から来て、脳を損傷しないように注意します。慎重にそれぞれの側を切り、頭頂に向かって鼻の骨の前面の骨に沿って片側をカットします。鉗子で慎重に頭蓋骨の上部を引いて、すぐに取り外し脳 (または興味の中枢神経系の構造)、中古冷蔵 DPBS+ +に氷の上。</li>
	<li>残りのすべての動物に対して繰り返します。 注: 適切な無菌条件の下で層流フードの手続のすべての手順を実行必要があります。</li>
</ol>3. 機械的解離 (1 日目)
<ol><li>すべての脳が収集された後冷たいメス刃で氷の上のシャーレに 1 mm3チャンクに一つの脳をチョップし、5-7 mL 冷たい douncing バッファーと冷たい dounce ホモジナイザー転送します。一度に 1 つの脳を切り離します。</li>
	<li>ゆったりした dounce ホモジナイザーを用いた 10-20 穏やかで不完全なストロークを使用して組織を切り離して考えます。直接粉砕、ホモジナイザーの下部組織ではなく、代わりにピストンの側面と、ホモジナイザー間の空間を通じて組織をインペル世話をします。</li>
	<li>気泡の導入を防ぐためにピストンを慎重に取り外します。ホモジナイザーの底に沈殿する不十分な解離組織塊を許可し、上清を新しい冷蔵 50 mL コニカル チューブに転送します。</li>
	<li>新鮮な douncing のバッファー、削除されたボリュームに置き換え、3-4 ラウンド、またはすべての組織が関連付けが解除されるまで合計 3.2 と 3.3 の手順を繰り返します。それぞれの脳の手順を繰り返します。</li>
</ol>4. ミエリン除去 (1 日目)
注: ミエリン除去は、ミクログリア P12 より古い動物からの分離に使用されます。
<ol><li>25 mL のピペットを使用して 50 mL コニカル チューブに細胞懸濁液の体積を測定し、33.5 mL に容量を調整する冷たい douncing バッファーを追加します。</li>
	<li>数回チューブの反転によって徹底的に細胞懸濁液とミックスに 10 mL の髄分離バッファー (MSB) を追加します。これは 43.5 mL の容積の MSB の 23% の最終濃度になります。</li>
	<li>ゆっくりブレーキを 4 ° C で 500 × g で 15 分の細胞を遠心します。 注: 遠心分離機は、減速する約 1.5-2 分を取る必要があります。これはミエリンと死んだ細胞の残骸、やや濁った上澄み、生きた細胞の濃縮は小さいペレットの上位層が生成されます。</li>
	<li>ミエリン/破片やピペットで上澄みの最上位のレイヤーを削除します。それの多くは可能な限り削除されますを確保するための最上位のレイヤーを削除するとき注意してください。</li>
	<li>バッファーをパンの 12 mL の細胞ペレットを再懸濁します。残っているかもしれない細胞の任意の塊を破るに細胞懸濁液をそっとカップ刻んだ。</li>
</ol>5. Immunopanning (1 日目)
<ol><li>細胞懸濁液の大きい残骸または細胞塊を削除する 70 μ m セル ストレーナーに通過します。</li>
	<li>3 回 DPBS+ +と OX42 コーティングのパン皿をすすいでください。プレートを許可しない洗浄の間完全に乾燥。</li>
	<li>最後の DPBS+ +洗浄を離れて注ぎ、フィルター処理された細胞懸濁液をパン皿に適用します。優しく細胞を配布するプレートを旋回し、付着する細胞を許可する 20 分間室温で平らな面にプレートを孵化させなさい。20 分以上インキュベートはないまたは細胞がお皿から復旧が非常に困難になります。</li>
	<li>非付着性のセルを削除する DPBS+ +とパン皿 10 倍をすすいでください。ミクログリアとなりますので他の非付着性のセルの除去を確保するため各リンス版は渦巻きプレートにしっかりと取り付け。</li>
	<li>最後の DPBS+ +洗浄を離れて注ぎ、15 mL DPBS+ +と 200 μ L トリプシン (1.25% 原液) で置き換えます。</li>
	<li>10% CO2 trypsinize 37 ° C で ≤10 分の皿を孵化させなさい。 注: が 10 分以上続行しないでくださいまたはミクログリアは除去が困難になります。</li>
	<li>Trypsinization の 10 分後に、ミクログリアがプレートにまだ立ち往生しているが。トリプシン/DPBS+ +を注ぎ、水洗いしてトリプシンを削除、冷たいミクログリア培 (MGM) 12 mL に置き換えます DPBS+ +で 2 倍。</li>
	<li>セル/基板相互作用を弱めるし、料理を確認できる場所を 2 分間氷の上の皿をパンはパン皿の分野の乾燥を防ぐためにフラットです。</li>
	<li>積極的のピペット 10 mL ピペット、ピペット コント ローラーと高速パン皿から細胞を回復します。すべてのセルを削除しようとするピペットから液の流れに 16 × 16 のグリッドを描画します。</li>
	<li>細胞をプレートからデタッチを確認する 20 倍の倍率の顕微鏡下の細胞をチェックしてください。細胞がまだ立ち往生している皿の上にスポットをマークとこれらの分野でピペッティング繰り返し。</li>
	<li>細胞懸濁液上清 15 mL の円錐管あたりの分注 3-4 mL を収集します。ゆっくりブレーキを 4 ° C で 500 × g で 15 分間スピンします。 注: セルの最大復旧できます少量によるミクログリアを回転します。</li>
	<li>細胞ペレットに MGM の 0.5 mL を残して上清を吸引します。</li>
	<li>残りの MGM でペレットを再懸濁し、すべての管から細胞のプールします。</li>
	<li>検定でのセルをカウントします。</li>
	<li>手順 6 - アプリケーションに応じて 7 で説明したように細胞をプレート。</li>
	<li>10% の CO2と 37 ° C で培養細胞。 注: 正規メディア変更で最大 3-4 週間またはメディア変更なしで 1 週間の文化は、細胞がすることができます。</li>
</ol>6. スポット コーティング組織培養プレート/Coverslips (1 日目)
<ol><li>24 ウェル アニオン ・ カチオン コート培養皿の中央に直接コラーゲン IV コーティングの 15 μ L をプレート (詳細については材料の表を参照) と 10% の CO2と 37 ° C で 15 分間インキュベートします。</li>
	<li>検定とセル数を計数後 MGM の 105/mL × 2.3 に細胞を希釈します。コラーゲン IV スポット、すぐにこの場所; に細胞懸濁液の板 15 μ L を吸引します。これは 10 の3セル/スポット x 3.5 を与えます。井戸の中に優しく付着、500 μ L の CO2 -平衡 TGF-β 2/IL-34/コレステロール含んでいる成長媒体 (TIC) を追加するセルを許可する 10% CO2と 37 ° C で 5-10 分間インキュベートします。</li>
	<li>めっき 10 μ G/ml の策略-D-リジン (PDL) H2O の場合は常温では、1 h での最初のコート滅菌ガラス coverslips coverslips 場合 H2O、3 回を洗浄し、紫外線の下でフードに乾燥させます。Coverslips 乾燥されたら、続行、coverslips スポットめっきステップ 6.2 で説明するよう。</li>
</ol>7. RNA ・ タンパク質分離用めっき
<ol><li>日 1、コート全域、24 ウェル アニオン ・ カチオンのコラーゲン IV コーティングと組織培養プレートのコーティングし 10% CO2、37 ° C で 10 分-1 時間のためのインキュベートを削除し、すぐにプレートの 3 ~ 5 倍の CO2の 10 の4細胞/ウェル平衡TIC メディア。</li>
	<li>2 日目、それぞれの準備の翌日も 50% メディアの変更を実行します。死んだ細胞で、井戸の中心クラスター、だからそこからメディアを取りがちであります。</li>
	<li>文化を維持するために 50% メディア変更ごとに 2-3 日間を実行します。メディアの変更は、文化の不要な変数を導入、細胞は定期的なメンテナンスで 3 週間以上のではなく、メディア変更せず約 1 週間生き残ることができます。</li>
</ol>

<ol><li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+Function+in+the+Central+Nervous+System+During+Health+and+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration.</a> Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).</li>
<li>Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+Dynamic+Mediators+of+Synapse+Development+and+Plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity.</a> Trends Immunol. 36 (10), 605-613 (2015).</li>
<li>Lou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+receptor+P2RY12-dependent+microglial+closure+of+the+injured+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Purinergic receptor P2RY12-dependent microglial closure of the injured blood-brain barrier.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (4), 1074-1079 (2016).</li>
<li>Haynes, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P2Y12+receptor+regulates+microglial+activation+by+extracellular+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1512-1519 (2006).</li>
<li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li>
<li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophage+enhancer+landscapes+are+shaped+by+the+local+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment.</a> Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).</li>
<li>Hoeffel, G., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+Tissue-Resident+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of Tissue-Resident Macrophages.</a> Front Immunol. 6, 486(2015).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li>
<li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival%2C+Specification%2C+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li>
<li>Herz, J., Filiano, A. J., Smith, A., Yogev, N., Kipnis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+Cells+in+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Myeloid Cells in the Central Nervous System.</a> Immunity. 46 (6), 943-956 (2017).</li>
</ol>

著者らは、調査した潜在的な利益相反として解釈される可能性が商業や金融関係の不在を宣言します。

ミクログリアは、sentinel 中枢神経系の免疫担当細胞として機能するため、環境の変化に非常に敏感したがって、分離、文化8時に細胞内での炎症反応を最小限に抑えるため細心の注意が必要です。これは、速度と温度をこのプロトコルで実現されます。動物は冷たい血流バッファーと灌流し、組織の間の時間を最小限に抑えるために合理化されましたプロトコルまたは 4 ° C で氷の上のセルを維持可能な大幅活性化、ので 4 ° C で遠心分離のすべての手順を実行するたびに、抽出、細胞培養します。単離細胞の遺伝子発現パターンを評価し場合、は、分離による変化を最小限にとどめるための trypsinization 前 CD11b immunopanning 皿から直接のセル lysates を収穫します。注意すべきことも慎重に分離されたミクログリアおそらく本質的に分離のプロシージャに関連付けられている被害関連シグナルの認識のための暖かい温度に置かれている時にすぐに炎症性応答を実行します。プロトコルが正常に実行された場合は、2.5-5 105セル/幼若ラット x が期待されています。
<p ...

中枢神経系の柔組織のマクロファージ、ミクログリア神経回路とグリア細胞のシグナリング ネットワークの広大な配列と通信します。彼らは開発およびシナプスの刈り込み、アポトーシス細胞のクリアランスと神経突起1,2で一時的な相互作用を介して脳の恒常性の重要な役割を果たします。ミクログリアは、病変部に炎症性応答を調整し出血の3、4を制限する彼らの長い、細いプロセスを拡張する神経学的な傷害に初期応答です。ミクログリアの形態と機能の変化は、急性および慢性の両方の中枢神経系傷害、ユビキタス、ミクログリア展示変更形態、ローカリゼーション、および多様な疾患状態1中の炎症メディエーターの発現。人間の遺伝学的研究を示す神経変性疾患のための危険を変える突然変異は、病気の発症や進行5 におけるミクログリアの重要な役割を指して、そのまま中枢神経系におけるミクログリアによって表現頻繁に主にまたは専らこと.けがや病気の彼らの卓越性を与えられた、新しい治療上のアプローチを開発するための高い優先度は、ミクログリアの生物学の理解を促進します。
ミクログリアの生物学の理解には多くの重要な進歩はテクニックとメカニズム他マクロファージを培養、遺伝子発現プロファイル、および機能の定義を含む集団の研究で発見された推定することによって生じています。形態/状態。マクロファージ機能しばしば中枢神経系ランドス ケープ内で意外な方法で再生を一般化、ミクログリアは自分自身、専門性の高い、分岐された形態および他の組織から離れてそれらを設定するユニークな遺伝子発現シグネチャを出展マクロファージ6。ミクログリアは他のほとんどのティッシュの大食細胞の異なる系統があります。彼らは原始造血の初期胚性波の中に中枢神経系を植民地化し、自己決定的な造血7からの貢献の独立した、生涯更新します。大人マイクログリアの完全に成熟した遺伝子発現シグネチャは、第 2 の8の生後週まで達成されていません。周囲の組織から環境の手がかりは、組織固有のマクロファージ機能6、中枢神経系血液脳関門9によって与えられた血液媒介要因への限られた露出を含むを口述筆記で主要な役割を果たします。
完全にミクログリアへの中枢神経の恒常性や病気を理解するための 1 つの障害が見られる成熟したミクログリア体内浄化された細胞の特殊なプロパティをさたの難しさ体外。分離する多くの方法が開発されている、文化そのままミクログリアがほとんどアプローチ細胞生存率をサポートするための血清に依存します。生理活性分子の広大な配列を含む本質的に変数の試薬は、ミクログリアの操作それはアメーバの形態を促進するため増加増殖は、特に問題となる、血清を加えている示されていると貪食亢進9は、ミクログリアが血液血液-脳関門の破壊後の要素にさらされる生体内でよく見かけます。これらのメトリックによって血清曝露細胞は、けがや病気の状態、ミクログリアを似ていますが、このような変化を減少しているミクログリアを亜セレン酸、コレステロール、TGF-β 髄液 1 (または IL-34) を含む定義された成長培地で培養すると。
このプロトコルは、最近出版された仕事9に関連する無血清条件下で幼若ラット ミクログリアを培養するための詳細を提供します。このプロトコルは、ラット生後 21-30 (P21 - P30) より合理化されていますが、収量および全体的な生存率は種および動物の年齢によって異なりますがラットおよびあらゆる年齢のマウスのミクログリアの分離に適応することができます。最大利回りし、若干未熟なミクログリアを使用するときに最適な生存を達成 (~ P9)、利回りと徐々 に先を細くやや大人動物の下位レベルの生存率。ミクログリアはマウスから分離することができますが、我々 はラットの細胞を示す有意に高い利回り、実行可能性、および分岐された形態の複雑さ無血清培養マウス細胞と比較して発見しました。動物が P50 より大きい高齢者このプロトコルで評価されていません。この immunopanning の分離のプロシージャは分離中ミクログリア転写プロファイルの変化を最小限にしてセルの下流の可能性を最大化する最適化されています。これらの技術とメディアの製剤を使用して、週間高生存率初代培養を維持できます。これらの条件下で培養したミクログリアは急速な拡張とプロセスの撤回を含む高度分岐し形態を展示し、増殖率が比較的低い。これらのプロパティの血清露出の意義を強調し、他のアプローチと比較してこの方法の長所と短所を話し合います。

<table><tbody><tr><td>ラット: Sprague-Dawley</td><td>Charles River</td><td>Cat# 400</td><td></td></tr><tr><td>マウス アンチラット CD11b モノクローナル (クローン OX42)</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat# MCA275R</td><td>パンニング: 1:1,000;染色: 1:500</td></tr><tr><td>ヤギ polycolonal anti-Iba1</td><td>Abcam</td><td>Cat# AB5076</td><td>染色: 1:500</td></tr><tr><td>ウサギ polyclonal anti-Ki67</td><td>Abcam</td><td>Cat# AB15580</td><td>染色: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey 抗マウス 594</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 11055</td><td>染色: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey 抗ヤギ 488</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# A-21203</td><td>染色: 1:500</td></tr><tr><td>AlexaFluor Donkey anti-Rabbit 647</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# A-31573</td><td>染色: 1:500</td></tr><tr><td>Triton-X (ICC染色の界面活性剤)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 28313</td><td></td></tr><tr><td>ヘパラン硫酸ガ</td><td>レン研究所用品</td><td>Cat# GAG-HS01</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>Cat# M3149</td><td></td></tr><tr><td>乳固形物からのペプトン</td><td>Sigma</td><td>Cat# P6838</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta;2</td><td>Peprotech</td><td>Cat#100-35B</td><td></td></tr><tr><td>マウスIL-34</td><td>R&D Systems</td><td>Cat# 5195-ML/CF</td><td></td></tr><tr><td>Ovine wool cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>Cat# 700000P</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン IV</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>Cat# 354233</td><td></td></tr><tr><td>オレイン酸</td><td>ケイマンケミカルズ&nbsp;</td><td>Cat# 90260</td><td></td></tr><tr><td>11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid</td><td>Cayman Chemicals&nbsp;</td><td>Cat# 20606</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM dye</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium homodimer-1</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# E1169</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Worthington</td><td>Cat# DPRFS</td><td></td></tr><tr><td>Percoll PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>Cat# 17-5445-02</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>Cat# T9935</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>Cat# 21041-02</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>Cat# 15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Gibco</td><td>Cat# 25030-081</td><td></td></tr><tr><td>N-アセチルシステイン&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>Cat# A9165</td><td></td></tr><tr><td>インスリン</td><td>Sigma</td><td>Cat# 16634</td><td></td></tr><tr><td>アポトランスフェリン&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# T1147</td><td></td></tr><tr><td>亜セレン酸ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>Cat# S-5261</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (高グルコース)</td><td>Gibco</td><td>Cat# 11960-044</td><td></td></tr><tr><td>Dapi Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>Cat# 0100-20&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-D-リジン&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>キャット# A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>プリマリアプレート&nbsp;</td><td>VWR</td><td>Cat# 62406-456</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Stock試薬&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrin</td><td></td><td></td><td>再構成:PBS 中の10mg / mL使用濃度:1:100 保存:-20°C;C</td></tr><tr><td>N-アセチルシステイン</td><td></td><td></td><td>再構成:H2O 中の5 mg/mL 使用濃度:1:1,000 保存:-20°C;C</td></tr><tr><td>亜セレン酸</td><td></td><td></td>ナトリウム <td>再構成: H2O で 2.5 mg/mL 使用濃度: 1:25,000 保存: -20°C;C</td></tr><tr><td>コラーゲン IV</td><td></td><td></td><td>再構成: 200 &mu;PBS 中のg / mL 使用濃度:1:100 保存:-80°C;C</td></tr><tr><td>TGF-b2</td><td></td><td></td>再構成<td>:PBS で2mg / mL使用濃度:1:1,000 保存:-20°C;C</td></tr><tr><td>IL-34</td><td></td><td></td><td>再構成:200 &mu;PBS の g/mL 使用濃度: 1:1,000 保存: -80°C;C</td></tr><tr><td>ヒツジウールコレステロール</td><td></td><td></td><td>再構成:100%エタノール で1.5mg / mL 使用濃度:1:1,000 保存:-20°C;C</td></tr><tr><td>ヘパラン硫酸</td><td></td><td></td><td>再構成:H2O 中の1mg/mL 使用濃度:1:1,000 保存方法:-20°C;C</td></tr><tr><td>オレイン酸/ゴンド酸</td><td></td><td></td><td>再構成:ゴンド酸:0.001mg / mL;オレイン酸:100%エタノール 中の0.1mg / mL 使用濃度:1:1,000 貯蔵:-20°C;C</td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td></td><td></td><td>再構成:PBS 中の50mg / mL使用濃度:1:100 貯蔵:-20°C;C</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>ソリューション&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>灌流バッファー</td><td></td><td></td><td>レシピ:50 &mu;DPBS++のg / mLヘパリン(Ca++およびMg + +を含むPBS) コメント:氷冷時に使用</td></tr><tr><td>Douncing Buffer</td><td></td><td></td><td>レシピ:200 &mu;50 mLのDPBS++ コメント:氷冷時に使用</td></tr><tr><td>パニングバッファー</td><td></td><td></td>レシピ:DPBS ++ミクログリア増殖培地(MGM)<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>中の乳固形物からの2 mg / mLペプトンレシピ<td>:100ユニット/ mLペニシリン、100 & μ;g/mL ストレプトマイシン、2 mM グルタミン、5 &mu;g/mL N-アセチルシステイン、5 &mu;g/mL インスリン、100 &mu;g/mL アポトランスフェリン、および 100 ng/mL 亜セレン酸ナトリウム コメント: 氷冷した MGM を使用して、イムノパニング皿からミクログリアをパンします。</td></tr><tr><td>コラーゲンIVコーティング</td><td></td><td></td><td>レシピ:MGM2&mu;g/mL コラーゲン IV</td></tr><tr><td>ミエリン分離バッファー</td><td></td><td></td><td>レシピ: 9 mL Percoll PLUS、1 mL 10x PBS (Ca++ および Mg++、9 &mu;L 1 M CaCl2, 5 &μ;L 1 M MgCl2 コメント:&nbspを添加した後、よく混ぜてください。CaCl2およびMgCl2</td></tr><tr><td>TGF-b2/IL-34/コレステロール含有増殖培地(TIC)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>レシピ:ヒト 2 ng/mL TGF-b2、100 ng/mL マウス IL-34、1.5 &mu;g / mLヒツジウールコレステロール、10 &mu;g/mL ヘパラン硫酸、0.1 &mu;g/ml オレイン酸、および 0.001 &mu;g / mlゴン酸 コメント:37°Cに温めた培地にコレステロールを追加してください。C で、1.5 &mu を超えないようにします。g / mLまたは沈殿します。コレステロール含有媒体をろ過しないでください。TIC培地を10%CO2で30分間1時間平衡化してから、細胞に添加して最適なpHを確保します。</td></tr></tbody></table>

動的なを促進するために齧歯動物のミクログリアの分離と培養分岐無血清培地の形態

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

ミクログリアは、中枢神経系 (CNS) のすべてのセルの 5-10% を表し、開発、恒常性と病の間に彼らの貢献のための注目に高まっています。マクロファージは、数十年、ミクログリアの特殊な機能、中枢神経系の組織に常駐マクロファージの詳細研究されてきたが大きく神秘的な成熟したミクログリアを要約する能力の制限により一部に残っています。文化のプロパティ。ここでは、私たちは成熟した齧歯動物の脳から純粋なミクログリアの急速な隔離のための簡単な手順を示しています。時間をかけてミクログリア生存率の高レベルをサポートする無血清培養条件についても述べる。これら定義培地条件下で培養したミクログリア精巧な区分されたプロセスと動的監視行動を表わします。我々 は議論するどのミクログリアの生体内と同様、両方の文化の血清露出に比較してこれらの無血清培養および培養マイクログリアに及ぼす血清露出を示しています。

このプロトコルは、幼若ラットから文化分岐高純度ミクログリアにメソッドを説明します。同様の結果は、後述するように未熟な周産期および大人の動物を使用して取得できます。細胞分離には微妙なニュアンスや細胞を死の多くの機会があります、ので、さまざまな段階での成功を決定するため品質管理のチェックポイントを使いました。我々 は通常の隔離のプロトコル (図 1 a) 複数のステップで、検定を用いた細胞懸濁液を監視しました。成功した分離は、2.5-5 105セル/少年動物 x を得られるはず。P7 - P15 から動物は、P30 より古い動物から分離した細胞を示す動物5セル/10 x 2.5 に近い利回りに対し 5 105セル/動物、x に近い利回りを表示します。合計セルを監視を超えて、プロトコル全体カウントそれは難しいことができますこの方法で分離したミクログリア文化の最初の数日中に丸みを帯びたまたはバイポーラの形態を持っているので隔離されたセルの全体的な稼働状態を...

ミクログリアの機能の詳細を理解するための努力は、生体内で成熟したミクログリアの特性を要約ミクログリア培養モデルの欠如によって妨げられています。このプロトコルは定義されている培地条件下で高度分岐し成熟ラット ミクログリアの堅牢な生存を維持するために設計された分離と培養手法を指します。

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

この細胞培養プロトコルの全体的な目標は、血清への曝露なしに維持できる、発生中のまたは成体のげっ歯類からミクログリアの高純度の培養物を生成することです。この手順は、ミクログリアの形態、線維性ケトーシス、およびミクログリアと他のCNS細胞タイプとの相互作用に関連する神経科学の主要な質問に答えるのに役立ちます。このプロトコルの主な利点は、ミクログリアをあらゆる年齢のげっ歯類組織から迅速に単離し、血清に曝露することなく培養できることです。脳を切除するには、脳を傷つけないように注意しながら、動物の脊髄から両側の後頭顆を解剖ハサミで切り取ります。次に、頭蓋骨の上部に沿って皮膚を切り取り、頭頂骨と前頭骨に沿って鼻骨に向かって片側を切り取ります。鉗子で頭蓋骨の上部を慎重に引き戻し、脳をすばやく取り外して、氷上の予冷したDPBSに入れます。残りのすべての動物について手順を繰り返します。脳を冷たいDPBSに集めた後、冷たいメスの刃で氷の上のシャーレで各脳を1つの立方ミリメートルの塊に切り刻み、5〜7ミリリットルの氷冷斗緩衝液を備えた氷冷ダウンスホモジナイザーに移します。次に、ルーズフィットのダウンスホモジナイザーを使用して、10〜20回の穏やかで不完全なストロークで組織を解離します。ホモジナイザーの底にある組織を直接押しつぶさないように注意してください。代わりに、ピストンとホモジナイザーの側面の間のスペースに組織を送り込みます。ミクログリアの生存率を維持するためには、複数回のダウンシングで組織をゆっくりと均質化することが重要です。その後、気泡が入らないようにピストンを慎重に取り外します。解離が不十分な組織塊をホモジナイザーの底に沈殿させ、上清を新しい冷却された50ミリリットルの円錐形チューブに移します。その後、除去したボリュームを新しいドウンシングバッファーと交換し、合計3〜4ラウンド、またはすべての組織が解離するまで解離手順を繰り返します。この手順では、細胞懸濁液を含む50ミリリットルの円錐管に氷冷ドウンシングバッファーを追加し、総容量を33.5ミリリットルに調整します。次に、細胞懸濁液に10ミリリットルのMSBを加え、チューブを数回反転させて十分に混合します。これにより、43.5ミリリットルの容量中にMSBの最終濃度が23%になります。その後、細胞を500 x g、摂氏4度で15分間遠心分離し、ゆっくりとブレーキをかけます。次に、ミエリンと破片の最上層、および上清をピペットで取り除きます。最上層を取り外すときは、できるだけ多くの層が取り除かれるように注意してください。その後、セルペレットを12ミリリットルのパンニングバッファーに再懸濁します。細胞懸濁液を穏やかに粉砕して、残っている細胞の塊を分解します。このステップでは、細胞懸濁液を70マイクロメートルのセルストレーナーに通して、大きな破片や細胞の塊を取り除きます。OX42コーティングパンディッシュをDPBSで3回すすぎます。洗濯の合間にプレートを完全に乾かさないでください。最後のDPBS洗浄液を注ぎ、ろ過した細胞懸濁液をパン皿に塗布します。プレートを静かに渦巻かせて細胞を分散させます。その後、プレートを平らな面に室温で20分間インキュベートし、細胞が接着します。20分以上インキュベートしないと、細胞が皿から回収するのが非常に困難になります。その後、パン皿をDPBSで10回すすぎ、非接着性細胞を取り除きます。ミクログリアはプレートにしっかりと付着しますので、すすぎのたびにプレートを回転させて、他の非接着性細胞を確実に除去します。最後のDPBS洗浄液を注ぎ、15ミリリットルのDPBSと200マイクロリットルのトリプシンと交換します。細胞をトリプシン化するには、皿を摂氏37度で10分以下でインキュベートします。トリプシン化の10分後、ミクログリアはまだプレートに付着しています。混合物を注ぎ、プレートをDPBSで2回優しく洗浄してトリプシンを取り除きます。次に、12ミリリットルの氷冷MGMと交換します。その後、パンニングディッシュを氷の上に2分間置いて、細胞と基質の相互作用を弱め、パンニングディッシュの領域が乾燥するのを防ぐためにディッシュが平らであることを確認します。その後、10ミリリットルのピペットとピペットコントローラーで高速に勢いよくピペッティングを行い、パンニングディッシュから細胞を回収します。ピペットからの液体の流れで16 x 16のグリッドを描き、すべての細胞を取り除こうとします。全体的な細胞の回復と培養の健康状態とのバランスを見つけることが重要です。パンニングディッシュに対して細胞上清を繰り返しピペッティングすると、培養物の生存率が低下します。顕微鏡で20倍の倍率で細胞をチェックし、プレートから細胞が剥がれていることを確認します。細胞が詰まっている場所を皿の上にマークし、それらの領域でピペッティングを繰り返します。細胞懸濁液を収集し、各15ミリリットルの円錐管に3〜4ミリリットルの上清を割り当てます。500 x g、摂氏4度で15分間回転させ、ゆっくりとブレーキをかけます。15分後、上清を吸引し、細胞ペレットに0.5ミリリットルのMGMを残します。次に、各ペレットを残りのMGMに再懸濁し、すべてのチューブから細胞を引き出します。その後、血球計算盤で細胞をカウントします。次に、15マイクロリットルのコラーゲンIVコーティングを24ウェル陰イオン性コーティング組織培養プレートの中央に直接プレートし、摂氏37度で15分間インキュベートします。血球計算盤で細胞をカウントした後、MGMで2.3×10に5ミリリットルに希釈します。コラーゲンIVスポットを吸引し、直ちにこのスポットに15マイクロリットルの細胞懸濁液をプレートして、スポットあたり3つの細胞に3.5×10を生成します。次に、37°Cで5〜10分間インキュベートし、細胞が接着するのを待ちます。次に、500マイクロリットルのCO2平衡化TICをウェルに穏やかに加えます。カバースリップにめっきする場合は、まず滅菌ガラスカバースリップに1ミリリットルあたり10マイクログラムのPDLを室温で1時間水にコーティングします。その後、水で3回洗い、UVライトの下でフード内で乾かしてから、カバースリップにスポットメッキを施します。高純度ミクログリアの単離と培養を成功させるために、P21ラットからミクログリアを単離し、これらの細胞をTICまたは10%FCSを添加したTICで8日間培養しました。次に、細胞を固定し、ミクログリアマーカーと増殖マーカーで染色しました。TICで培養した細胞は、分岐した形態、低レベルの増殖、およびミクログリアマーカーの発現を示します。これに対し、10%FCSを添加したTICで培養した細胞は、ミクログリアマーカーについても染色されましたが、活性化ミクログリアによく見られる高レベルの増殖とアメーバ形態を示しています。細胞マーカーの染色に加えて、新たに単離された細胞上のRNA-Seqは、細胞のRNAプロファイルを評価するための強力で高感度なツールを提供し、培養の開始純度を知らせるのに役立ちます。CD11bのマイクロパンニングは、典型的には、CD11b陽性のミクログリアに加えて、CD11b陽性好中球および単球のキャリーオーバーのわずかな割合をもたらす。これらの細胞は数日後にTICで死滅しますが、それ以前の時点の解析を複雑にする可能性があります。こちらはTICでのP21ラットミクログリアの14DIV後のタイムラプスムービーです。2週間後、無血清培養物は、ディッシュ全体での迅速なプロセス拡張および収縮を伴う動的監視挙動を示します。これは、子牛胎児血清への曝露前後のTICで5回のDIVを行った後のP21ラットミクログリアのタイムラプスムービーです。血清曝露後に急速な形態学的変化が明らかです。このプロトコルをマスターすると、適切に実行すれば、4〜5時間で完了します。この手順に続いて、食作用、走化性、生存、サイトカイン放出、刺激に対する転写応答をモニターする他のアッセイを実施して、ミクログリア機能に関する追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、成虫のげっ歯類組織からミクログリアを迅速に分離し、無血清条件下でミクログリアを培養する方法について十分に理解できるはずです。

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JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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新生仔ラットの脳組織の混合グリア細胞培養物から主要なミクログリアの分離

このビデオでは、ラットの脳からミクログリアを分離して培養する方法を紹介しています。これは、ミクログリアに特異的なモノクローナル抗体でコーティングされたプレートを使用して、ミクログリアを他の神経細胞および非神経細胞から分離することを伴います。...

無血清培地を用いたラット脳からのミクログリアの単離と培養

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ラット小脳顆粒ニューロン培養物からのミクログリアの選択的除去

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新生児と大人の中枢神経系から培養ミクログリア

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マウス新生児から保護免疫表現と機能皮質ミクログリアの分離

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強化された純度と汎用性を持つ初代ミクログリアの迅速かつ洗練されたCD11b磁気分離

特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリ ミクログリアの分離

このプロトコルは、生きている、大人、人間の脳組織から原発ミクログリアを単離する効率的で費用対効果が高く、堅牢な方法です。孤立した原発性ヒトミクログリアは、恒常性および疾患における細胞プロセスを研究するためのツールとして役立つ。...

成人ヒト脳組織からのヒトミクログリアの取得

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マウス脊髄ミクログリアの迅速かつ効率的な濃縮

学ぶ齧歯動物のミクログリア分離・培養法。無血清培地で高純度ミクログリアを維持し、形態とCNS細胞との相互作用を研究。神経科学におけるミクログリア機能解明に有用な手法です。

動的なを促進するために齧歯動物のミクログリアの分離と培養分岐無血清培地の形態

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