新規パッシブ全体の中枢神経系組織における光透過性の急速な生産のための方法をクリア
2018年5月8日
MPACT 最大の光透過性とそのまま齧歯動物のティッシュ血管系の後続の顕微解析を実現するため、psPACT 2 つの新しい方法論を提案するここでは、全体の中枢神経系。
これらのpsPACTおよびmPACT法の全体的な目標は、電気泳動組織透明化システムを必要とせずに、CNS組織全体を迅速に透明化することです。この方法は、アルツハイマー病や傷害、変性、腫瘍形成など、ヒト疾患研究モデル分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、マウスの中枢神経系組織が電気泳動組織クリアリングによって損傷を受けず、修正パッシブクリアリングによって迅速にクリアされることです。
この方法のアイデアは、オリジナルのPACTと過去の脳のクリアリングの方法を使用した後に最初に思いつきました。psPACT法とmPACT法は、サンプル調製の複数の段階があるため、実行が難しいため、この方法の視覚的なデモンストレーションは重要です。VA-044粉末を4%PFAと4%アクリルアミドの最終濃度0.25%の溶液に加えてPACTカクテル溶液を調製することから始めますPACT溶液で組織を灌流した後、冷やしたPACT溶液を含む50ミリリットルのチューブに脳全体と脊髄を完全に浸し、摂氏4度で24時間保存します。
24時間後、組織を新鮮で冷たいPACT溶液を含む50ミリリットルのチューブに移し、チューブキャップを組織ゲルハイブリダイゼーションシステムに接続し、窒素タンクに接続して摂氏37度に設定します。その後、真空とガスを10分間オンにして、サンプルを窒素ガスに埋め込みます。ハイドロゲルを重合するには、サンプルの入ったチューブを150rpm、37°Cに設定した振とうインキュベーターに3時間、または重合が完了するまで置きます。
インキュベーション後、あぶらとり紙を使用して、組織の周囲に残っている重合ヒドロゲルを除去します。次に、組織を透明化溶液の入った50ミリリットルのチューブに移します。37°C、150rpmに設定された振盪器にサンプルを、組織が透明
になるまで置きます。マウスの中枢神経系が完全に透明になるまでには、平均して約20日かかります。4%PFAで灌流したマウスからCNSでpsPACTを開始し、4%PFAで摂氏4度で24時間後固定します。固定組織を0.1モルPBSで1時間洗浄します。
洗浄後、組織をA4P0溶液に移し、摂氏37度で24時間インキュベートします。翌日、PBSで組織を5分間洗浄した後、PBSの0.25%VA-044に組織を浸漬し、37°Cで6〜24時間インキュベートします。アクリルアミドとその後のVA-044ステップを分離することで、PACTで透明性を達成した後に最終的な組織の完全性を損なう可能性のある、組織を囲む残りの未重合ヒドロゲルモノマーを除去する必要がなくなります。
インキュベーション後、組織を新鮮で冷たいVA-044溶液に移します。その後、サンプルを窒素ガスに10分間埋め込みます。組織を清浄な溶液に移します。
次に、摂氏37度、150rpmに設定された振とうインキュベーターで、組織が透明になるまでサンプルをインキュベートします。マウスの中枢神経系が完全に透明になるまでには、平均して約17日かかります。mPACTの場合は、クリアリングソリューションステップまでpsPACTのプロトコルに従います。
次に、8%SDSに加えて、褐変剤である0.5%α-チオグリセロールを含む組織透明溶液を0.1モルPBSに完全に浸します。37°C、150rpmに設定された振盪器にサンプルを、組織が透明になるまで置きます。マウスの中枢神経系がmPACTを使用して完全な明瞭さを達成するのに、平均してわずか2週間しかかかりません。
本研究では、mPACTプロトコルで処理したマウス脳サンプルは、PACTプロトコルとpsPACTプロトコルで処理したサンプルよりも先に、14日後に光透過性を達成しました。mPACTでクリアしたラット全CNSサンプルは、20日間で最大のクリアランスを達成しました。成体ラットの脳は、CNS全体とは対照的に、mPACTによってわずか5日間でクリアされました。
この手法を習得すると、適切に実行すれば、マウスの全中枢神経系で2週間で行うことができます。その開発後、この技術は、神経科学と解剖学の分野の研究者が、哺乳類のCNSモデルにおける組織損傷、発達奇形、癌、神経変性疾患などの病態生理学的疾患を探求する道を開きました。
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概要
本研究では、齧歯類の完全な中枢神経系（CNS）血管系の光学的透明性を向上させ、顕微鏡解析を容易にするための2つの革新的な手法、psPACTおよびmPACTを導入します。これらの技術は、CNS組織全体を損傷させることなく迅速に透明化することを目的としており、アルツハイマー病や腫瘍形成などのヒト疾患モデルに関連する重要な課題の解決を目指しています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 組織透明化技術
- 顕微鏡イメージング
背景
- 本研究は従来の手法に基づいたものであり、電気泳動による組織透明化法の限界を明らかにしています。
- 齧歯類の中枢神経系（CNS）組織において、迅速かつ効果的な透明化プロセスの必要性を強調しています。
- 神経科学における基礎研究と臨床的な意義の両面に対して解決策を提示しています。
研究目的
- CNS組織透明化のための効率的なプロトコルとして、psPACTおよびmPACTを開発し、検証すること。
- 神経病理学的状態を研究する研究者の能力を拡張すること。
- CNSにおける組織血管系のより優れた視覚化を促進すること。
使用した方法
- 本手法では、PACT溶液を用いてCNS組織を調製および透明化するための多段階プロトコルを用います。
- 主要な生物学的モデルにはマウスおよびラットのCNSサンプルが含まれ、光学的な透明性の達成に重点を置いています。
- psPACTで完全に透明になるまでには通常約20日かかりますが、mPACTでは約14日で達成可能です。
- 重合および透明化プロセスには、専用の溶液とインキュベーション環境が採用されています。
主な結果
- mPACTは、従来の手法と比較して組織透明化時間を大幅に短縮します。
- mPACTで処理したサンプルは、より短時間で光学的な透明性を示し、研究への応用において効率性が向上することが示唆されました。
- これらの手法は、さまざまな神経疾患の研究を促進する上で有効であることが証明されています。
結論
- 本研究により、CNS組織の迅速かつ効率的な透明化が可能となり、神経科学分野における研究能力が向上します。
- この新しい手法は、疾患メカニズムや組織損傷を探索するための貴重なツールとなります。
- イメージング技術の向上を通じて、神経変性疾患の理解を深め、病理学的研究を強化することへの意義は極めて大きいです。
よくある質問
業界における重要性
psPACTやmPACTなどの新しい受動的透明化法は、電気泳動による損傷を与えることなく、中枢神経系（CNS）組織全体の迅速かつ高忠実度な光学的透明化を可能にすることで、神経科学の研究開発における重大なボトルネックを解消します。この機能は、サブセルラー構造を維持しながらイメージング時間を短縮することで、神経変性疾患モデルにおけるターゲットの検証およびメカニズムのリスク低減を支援します。これらの手法は、神経病理学的表現型の可視化を改善することにより、アルツハイマー病、腫瘍形成、および損傷モデルの前臨床研究における予測の信頼性を向上させます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： サブセルラー構造および細胞回路を維持することで、標的結合研究のための完全なCNSモデルにおける治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値： 電気泳動的クリアリングに伴う組織処理アーティファクトを低減し、表現型スクリーニング結果の再現性を向上させる。
- 予測的価値： 疾患関連システムにおける神経変性進行のより明確なリードアウトを提供することで、ポートフォリオの選別（トリアージ）を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： サブセルラーバイオマーカーの高解像度イメージングおよびパスウェイ変調に適した、標準化され透過性の高いCNS（中枢神経系）標本を作製します。
- 運用上の価値： 特殊な電気泳動装置が不要になるため、創薬チーム全体でのアッセイ導入における障壁が低減されます。
- 拡張性： mPACTは約14日間でマウスCNSの透明化を実現し、化合物スクリーニングキャンペーンにおける予測可能なタイムラインを可能にします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性：腫瘍形成や発生異常の縦断的研究に向けて組織の完全性を維持することで、創薬から前臨床検証へのシームレスな移行を促進します。
- メカニズム解明によるリスク低減：病理組織における細胞内構造の可視化を可能にし、ターゲットメカニズムの解釈における曖昧さを低減します。
- 疾患モデルの忠実度：齧歯類種（マウス/ラット）間で一貫した中枢神経系（CNS）のクリアリングをサポートし、安全性薬理学における研究間の比較可能性を高めます。
パイプラインおよびワークフローの統合
psPACTおよびmPACTは、初期探索から前臨床に至る一連の流れに適合し、定量可能でイメージングに適したCNSモデルを提供することで、ターゲット検証からリード最適化までを具体的に支援します。
- ディスカバリー生物学：未処理の組織におけるタンパク質発現と細胞分布の3Dマッピングを通じて仮説検証を可能にし、疾患モデルにおけるパスウェイの関与を明確にします。
- スクリーニング：再現性のある定量的な組織調製を実現し、中枢神経系（CNS）構造に対する化合物の影響について標準化された評価をサポートします。
- アナリティクス：高解像度のイメージング出力を生成し、向上したSN比により、治療条件間での構造変化の比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：ディスカバリー段階から前臨床段階までプロテオームおよび構造的な連続性を維持し、神経変性および損傷モデルにおけるバイオマーカーの整合性をサポートします。
- エンタープライズ再利用：神経病理学を研究する複数のプロジェクトに適用可能な再利用可能なCNS透明化プラットフォームを確立し、冗長なメソッド開発を削減します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：組織をそのまま可視化することでメカニズムの曖昧さを排除し、ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を向上させる。
- 運用的価値：変動しやすい電気泳動パラメータや装置への依存を回避することで、標準化と再現性を高める。
- 戦略的価値：中枢神経系（CNS）標的候補物質の前臨床データ生成を加速させ、go/no-go判断の効率を改善する。
- ポートフォリオへの影響：より迅速かつ明確な表現型リードアウトを通じて、神経変性疾患および腫瘍学プログラムのリスク調整済み優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- 多段階の試料調製を管理するため、組織組織学、ハイドロゲル化学、およびインキュベーションプロトコルの実行に関する専門知識が必要です。
- ハイドロゲルの重合および透明化フェーズにおいて、振盪インキュベーター、窒素ガスシステム、および温度管理環境に依存します。
- ラボ間の再現性を確保するため、溶液調製（例：VA-044、SDS濃度）およびタイミング制御のチーム間での標準化が不可欠です。
- 出典資料に記載されている通り、非中枢神経系（CNS）組織（例：腎臓、脾臓）への適用には、透明化時間と構造保存の検証が必要です。
- 実用上の制限：プロトコルの成功は、調製段階が多いため綿密な実行に依存しており、逸脱は不完全な透明化や組織損傷を招くリスクがあります。
