Name: 新規パッシブ全体の中枢神経系組織における光透過性の急速な生産のための方法をクリア (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: 学ぶpsPACTとmPACTによるマウスおよびラットのCNS組織の高速透明化法。電気泳動を用いずに組織を損傷せずに透明化し、アルツハイマー病や神経変性疾患の病態研究に有用な視覚化技術を提供します。

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この作品は、延世大学医科学脳韓国 21 プラス プロジェクトによって支えられました。さらに、この作品は、韓国の国立研究財団 (NRF-2017R1D1A1B03030315) からの助成金によって支えられました。

すべてのプロシージャは、延世大学医科大学研究倫理委員会によって承認されています。延世大学医科大学実験動物の世話委員会のガイドラインに従ってすべての実験動物が犠牲に。
1. 試薬の調製
注意: パラホルムアルデヒド (PFA) アクリルアミドおよびナトリウム dodecyl 硫酸塩 (SDS) 有害刺激を適切な個人用保護具 (PPE; 白衣、手袋、保護メガネ) と発煙のフードでこうして扱う必要があります。
<ol><li>4% アクリルアミド (AA の) 溶液 (A4P0): 0.1 M リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 180 mL 40% アクリルアミド溶液 20 mL を加えます。</li>
	<li>0.25% VA 044 ソリューション: 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane 0.5 g を追加] 0.1 M リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 200 mL に塩酸 (VA-044) 粉末。VA 044 粉末は、常温で保存できますが、一方、PBS で可溶化時に 4 ° C で保存されなければなりません。最高の結果を得るには、実験に必要なソリューションの量だけを準備します。</li>
	<li>協定カクテル ソリューション: 4% パラホルムアルデヒド (PFA) ソリューションの 225 mL にアクリルアミドの 10 g を追加し、4% と 200 mL にボリュームを調整する PFA。使用前に VA 044 粉末 100 mg を 50 mL の円錐管に混合物の 40 mL に追加します。</li>
	<li>協定ソリューション バッファーをクリア: ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) の 40 g を 350 mL の 0.1 M PBS に追加し、0.1 M PBS と 500 mL にボリュームを調整します。MPACT クリア ソリューション、ソリューション バッファーをクリア協定に 0.5% α-チオグリセを追加します。</li>
	<li>マウスをこの研究で使用された 2 週齢 BALB オスのマウス本研究で使用されるラットは 2 週齢雄 SD ラット.</li>
</ol>2. 麻酔および灌流外科
注意: PFA とアクリルアミドは、有害刺激を適切な PPE と発煙のフードでこうして扱う必要があります。
<ol><li>26 g 針、1 mL の注射器を使用して zoletil の 30 mg/kg の病原体フリー部屋に動物を麻酔します。5 のための動物を監視-10 分。</li>
	<li>動物の麻酔外科平面に達している、つま先ピンチ応答メソッドを使用して麻酔の深さを確認します。応答がないを確認します。 注: マウスおよびラットの手術を伴う次の手順前研究11で使用される同様のプロトコルに従います。</li>
	<li>外皮と腹部の壁を通して、胸郭の下に 5-6 cm の切開を行います。</li>
	<li>あらかじめ切開のサイトを検索するのに胸部領域を触診、横隔膜の切開をするのに鈍い曲線ハサミを使用します。</li>
	<li>切開を胸腔内に公開する胸部の全体の長さにわたって。</li>
	<li>慎重に肺を置き換えません。鎖骨まで胸部のカットを作る。アイリスのはさみを使用して、左心室の後部の端に小さな切開を作る。カットの心室を通過、上行大動脈に 18 ゲージ鈍やオリーブをひっくり返した灌流針を挿入します。</li>
	<li>針を固定し、止血の中心をクランプして漏れを防ぐ。また、針の先端を大動脈のクランプに変更された止血を使用します。</li>
	<li>右心房、大動脈に与えるダメージを最小限を確保するよう配慮で大きな切開を行います。ラットは、灌流の準備が整いました。</li>
</ol>3. 全体の血流とラットの解剖
注意: PFA とアクリルアミドは、有害刺激を適切な PPE と発煙のフードでこうして扱う必要があります。
注: 手順全体の灌流はウーらによる以前の研究で使用されるプロトコルに似ています。(2016)10,11。
<ol><li>18 ゲージ針、空気の泡を導入しないように注意しながら心臓の右心房に接続します。</li>
	<li>50 mL の注射器を使用すると、迅速かつ均一にヘパリン (10 単位/ml) を含む冷たい 0.1 M PBS 溶液 50 mL をポンプします。</li>
	<li>蠕動ポンプのチューブに 18 g 針を接続します。</li>
	<li>10 mL/min の循環速度で 200 mL のヘパリン (10 単位/ml) を含む冷たい 0.1 M PBS 溶液で洗ってください。</li>
	<li>250 mL の循環速度を 10 mL/min で冷 4 %pfa 溶液で固定します。ラットは、この段階では硬いはずです。</li>
	<li>収集し、処分のため残りの PFA ソリューションを格納します。</li>
	<li>協定、18 ゲージ針、チルド協定 4 %pfa があり、4% アクリルアミドと 0.25% VA 044 パウダー カクテル溶液で組織を灌流、頭と背骨を取り外します。首から鼻の正中切開することによって頭蓋骨を公開します。この追加灌流ステップは、psPACT と mPACT メソッドに必要です固定後すぐに頭と背骨を分離し、頭蓋骨を公開します。</li>
	<li>任意の残留首と背骨の筋を除去することによって、頭蓋底を公開します。</li>
	<li>Rongeurs とはさみを使って頭蓋骨をはがします。脳と脊髄を削除します。</li>
	<li>4% で組織を保存 4 ° c; PFA組織は、1 週間まで保存できます。</li>
</ol>4. ハイドロゲル モノマー注入およびラットおよびマウスの中枢神経系の重合
注意: アクリルアミド、SDS、α-チオグリセ、PFA の刺激は、こうしてヒューム フードと適切なおしっこを処理する必要があります。
<ol><li>
協定 (パッシブ手法をクリア)
	<ol>
<li>分離し、文化の全体中枢神経系 (脳と脊髄) 固定マウスおよびラットから 4 %pfa、4% アクリルアミドと 0.25% VA 044 パウダー、24 h. 組織が s に完全に没頭していることを確認のための 4 ° C でストアのチルド協定カクテル溶液 50 mL のチューブにソリューション。</li>
		<li>10 分のティッシュを使用してゲルの交配システム窒素タンクに接続されているために、窒素ガスのサンプルを埋め込む: システムを 37 ° C に設定新鮮な寒さ (4 ° C) 協定を含む 50 mL のチューブに組織を転送カクテル ソリューション チューブ キャップと接続し、真空をオンにします。</li>
		<li>ヒドロゲルを重合、3 h、または重合が完了するまで (150 rpm、37 ° C) 振動のインキュベーターでサンプルを格納筒を配置します。</li>
		<li>あぶらとり紙を使用して (材料の表を参照)、削除残りの重合ハイドロゲル周囲の組織。</li>
		<li>組織を含むクリア液 (0.1 M PBS、pH 8.0 で 8 %sds) 50 mL チューブに転送します。</li>
		<li>組織がクリアされるまで、37 ° C および 150 rpm に設定振動インキュベーターにサンプルを配置します。平均して、完全明快さを達成するためにマウスの中枢神経系の約 20 日かかります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
psPACT (プロセス別のパッシブ クリア技術)
	<ol>
<li>ボーン カッターと PFA 固定マウスおよびクリーン ベンチのラットからはさみ全体 CNS (脳や脊髄) を分離します。</li>
		<li>組織の転送 4% を含む 50 mL のチューブ PFA、および 24 時間のための 4 ° C でストアするには組織は固定液に完全に浸漬。</li>
		<li>0.1 M PBS で 1 時間固定ティッシュを洗うが、A4P0 溶液 (0.1 M PBS で 4% アクリルアミド) に譲渡。24 h の 37 ° C でストア。</li>
		<li>0.1 M PBS で 5 分のための組織を洗浄します。</li>
		<li>0.25% の組織を浸す 0.1 M PBS で VA 044。6-24 h、37 ° C で保存し、新鮮な 0.25 %va-044/PBS 溶液に転送します。</li>
		<li>10 分のティッシュを使用してゲルの交配のために窒素ガスのサンプルを埋め込む窒素タンクに接続されたシステム (材料の表を参照してください): 新鮮な寒さ (4 ° C) を含む 50 mL のチューブに組織を転送 0.25 %va-044/PBS 溶液、チューブ キャップと接続。真空をオンにします。</li>
		<li>組織に転送ソリューション (0.1 M PBS、pH 8.0 で 8 %sds) をクリアします。</li>
		<li>組織がクリアされるまで、37 ° C および 150 rpm に設定振動のインキュベーターでサンプルをインキュベートします。平均して、マウス中枢神経系における透明度を達成するため約 17 日かかります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
mPACT (変更された受動的なクリア法)
	<ol>
<li>ボーン カッターと PFA 固定マウスおよびクリーン ベンチのラットからはさみ全体 CNS (脳や脊髄) を分離します。</li>
		<li>4.2.2 - psPACT プロトコルの 4.2.8 の手順に従います。</li>
		<li>組織に転送ソリューションを消去します。条約と psPACT のプロトコルとは異なり mPACT は 0.1 M PBS、pH 8.0 で 8 %sds に加えて 0.5% α-チオグリセから成るクリア ソリューション必要がありますに注意してください。Α-チオグリセより迅速かつ効果的に組織を明確に役立ちます非褐変のエージェントです。組織はソリューションに完全に没頭することを確認します。</li>
		<li>組織がクリアされるまで、37 ° C および 150 rpm に設定振動インキュベーターにサンプルを配置します。平均では、マウスの中枢神経系における明快さを達成するために約 2 週間かかります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5 屈折率整合とクリアされた中枢神経系の免疫染色
注: nリム (Nycodenz ベース屈折率マッチング ソリューション) は、0.8 グラム/mL の Nycodenz パウダー 30 mL 基本バッファー (0.01% アジ化ナトリウムと pH 8.0 0.1 M PBS でトゥイーン 20) に溶解で構成されています。ソリューションが粉体の適切な溶媒ようにインキュベーターの振動、37 ° C で置かれることをお勧めします。
<ol><li>0.1% の組織を孵化させなさい 2 時間 0.1 M PBS でトリトン X-100 を 0.1 M PBS 6 時間で 2% ウシ血清アルブミン (BSA) をブロックします。</li>
	<li>3 回の pbst; セクションを洗う (0.1 %0.1 M PBS でトゥイーン 20) 2 のための 2 日間 (この場合は血管の汚れは、抗家兎の PECAM CD31 抗体) の一次抗体を持つセクションを染色します。</li>
	<li>2 日間の 2 %bsa で (この場合、ヤギ抗うさぎ IgG Cy3 蛍光共役) の二次抗体を使用してセクションを染色します。</li>
	<li>洗浄は 2-10 日間 pbst; 2 時間で 3 回組織と 15 mL のストアnリムをラベル付け。</li>
	<li>イメージング、前に 35 〜 60 ミリメートル ティッシュの培養皿上nリムの少量にラベル付けされた組織を移動します。お皿の下の縁のまわりでシリコーンで固定します。</li>
	<li>1.5-2 mL の新鮮なnリムを追加します。</li>
</ol>6. 画像処理
<ol><li>タイル走査共焦点レーザー スキャン microscopewith 10 倍の倍率を使用してクリアされた組織の画像を取得 (材料の表を参照してください)。Cy3 標識組織の 550-600 nm の波長を使用します。</li>
</ol>

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<li>Kim, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+differential+plaque+depositions+in+the+brains+of+Tg2576+and+Tg-APPswe%2FPS1dE9+transgenic+mouse+models+of+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease.</a> Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).</li>
<li>Kinameri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prdm+proto-oncogene+transcription+factor+family+expression+and+interaction+with+the+Notch-Hes+pathway+in+mouse+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis.</a> PLoS One. 3 (12), e3859(2008).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

大幅改善の前の組織をわかりやすく2,3,4、7等をクリアで達成一貫性協定受動的、非電気泳動抽出方法に勤めている間,8テクニックが最も急を要するが最大組織明確12を達成するために必要な時間の長さ、いくつかの欠点はいまだに。現在の研究では、組織の組織構造と整合性6,10を維持したままクリアに必要な時間を大幅に削減協定プロトコルの修正を提案します。さらに、最初の時間のため、清算プロトコル全体の中枢神経系組織と高次齧歯動物モデル、ラット10組織のアプリケーションを示します。
<p class="jove_...

科学的・臨床的調査の基本的な目的を含む器官の構造と機能の完全な理解を達成します。ただし、哺乳類の器官の非常に複雑な性質はしばしば完全に1この目的を達成するために障壁として機能します。透明度 (明確な脂質交換アクリルアミド ハイブリダイズ剛体イメージング互換かみしめハイドロゲル)2,3,4、そのまま組織からアクリルアミド ベース ハイドロゲル ハイブリッドを構築する関係を実現します。その構造的な整合性の5を維持しながら脳、肝臓、および脾臓を含む臓器の様々 な光のクリアランス。明快さは可視化だけでなく、複雑な携帯電話ネットワークとを区分することがなく組織形態を細かく分析する機会に従ってきました。
組織クリアランスを達成するために明快さは、手でサンプルの脂質含量を削除する電気泳動法を採用しています。電気泳動の組織の清算 (など) の方法を使用が褐変、エピトープ損傷を含む組織品質の面で様々 な結果を生成することを研究で示されている明快さは物理的に安定した組織ハイドロゲルのハイブリッド車を生産するために注目されている中、蛋白質の損失の5,6。これらの問題に対処するため、パッシブ、イオン洗剤ベース脱脂法など治療に置き換えます、協定 (受動的な明快さ技術) などのプロトコルの修正は先進7,8,9をされています。にもかかわらず、結果の一貫性を達成するため、ただし、協定は最大の認可を得るためのより多くの時間を必要です。さらに、これらの技術のどれもが、CNS フォーム全体またはラット、モルモットなど大きい齧歯動物モデルで適用まだされています。
本研究は、psPACT (別のプロセス協定) と mPACT (変更された協定)、全体の中枢神経系と内臓マウスとラットの両方のモデルのための10の高速のクリアランスを促進するための新規方法論を提案し、これらの制限に対処しようとします。具体的には、psPACT プロセス 0.25% と 4% アクリルアミド組織ハイドロゲル形成; 中に 2 つの別々 の手順で VA-044mPACT は基本的に同じ手順が含まれますが、0.5% α-チオグリセ キー試薬として、SDS 決済ソリューションのサプリメントします。両方の技術は、光クリアランスを生成するために必要な時間を大幅に削減する内因性の全身と脳脊髄液循環システムを活用します。原理の証拠として我々 はクリア組織10血管パターンを分析する共焦点顕微鏡の使用を示します。

<table><tbody><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)</td><td>Affymetrix, Inc.</td><td>75819</td><td>清算液</td></tr><tr><td>Nycodenz</td><td>Axia-Shield</td><td>1002424</td><td>nRIMS 溶液</td></tr><tr><td>40% アクリルアミド溶液</td><td>Bio Rad Laboratories, Inc.</td><td>161-0140</td><td>重合(A4P0)</td></tr><tr><td>2,2&acute;-アゾビス[2-(2-イミダゾリン-2-イル)プロパン]二塩酸塩</td><td>和光純薬工業(株)</td><td>017-19362</td><td>重合 (VA-044)</td></tr><tr><td>1-チオグリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1753-100ML</td><td>清算液 (mPACT)</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Georgiachem</td><td>9005-64-5</td><td>nRIMS solution</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td>免疫染色</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>ボヴォゲン</td><td>BSA100</td><td>免疫染色ヘ</td></tr><tr><td>パリン</td><td>メルクミリポア</td><td>375095</td><td>灌流(PBS)</td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td>nRIMS溶液</td></tr><tr><td>PECAM-CD31抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-28188</td><td>免疫染色</td></tr><tr><td>用ヤギ抗ウサギIgG Cy3蛍光標識</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td><td>111-165-003</td><td>免疫染色</td></tr><tr><td>4% パラホルムアルデヒド</td><td>Tech &イノベーション</td><td>BPP-9004</td><td>灌流、重合</td></tr><tr><td>20X リン酸緩衝生理食塩水 (pH 7.4)</td><td>Tech &イノベーション</td><td>BPB-9121</td><td>灌流、バッファー</td></tr><tr><td>10 mL ストリップ</td><td>コーター</td><td>4488</td><td>溶液移送</td></tr><tr><td>50 mL チューブ</td><td>ファルコン</td><td>352070</td><td>クリアリングチューブ</td></tr><tr><td>35 mm 細胞培養ディッシュ</td><td>SPL</td><td>20035</td><td>イメージング</td></tr><tr><td>共焦点ディッシュ</td><td>SPL</td><td>211350</td><td>イメージング</td></tr><tr><td>1 mL シリンジ</td><td>韓国ワクチン株式会社</td><td>26G 1/2</td><td>麻酔&nbsp;</td></tr><tr><td>50 mL シリンジ</td><td>Korea vaccine Co., Ltd</td><td>21G1 1/4</td><td>灌流</td></tr><tr><td>アクリルアミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553</td><td>重合 (A4P0)</td></tr><tr><td>Whatman 3MM paper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z270849</td><td>ブロッティングペーパー ゲル除去用</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>LSM780</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>ZEN lite Software</td><td>Zeiss</td><td>ZEN 2012</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>Longerpump</td><td>BT100-1F</td><td>Perfusion</td></tr><tr><td>EasyGel</td><td>Lifecanvas Technologies</td><td>EasyGel</td><td>Tissue gel hybridization system</td></tr></tbody></table>

新規パッシブ全体の中枢神経系組織における光透過性の急速な生産のための方法をクリア

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

明快さの開発以来らせんの技術をクリアできる透明な組織内三次元表現型写像立方 (明確な遮るもののない脳イメージングを含む新規クリア方法論の多数カクテルと解析) スイッチ (対話時間のシステム全体にわたるコントロール) および化学物質の体内動態、マップ (拡大、プロテオーム解析)、および協定 (受動的な明快さテクニック)、更なる拡大のため既存のツールキットに確立されています。生体組織の顕微解析。本研究の目的を改善し、全体の中枢神経系 (CNS)、腎臓、脾臓、および全体のマウス胚を含む無傷の齧歯動物組織の配列の元の協定の手順を最適化します。PsPACT (別のプロセス協定) と mPACT (変更された協定) と呼ばれる、これらの手法は、細胞回路をマッピングとそのまま正常および病的組織における細胞内の構造を視覚化する非常に有効な手段を提供します。次のプロトコルの psPACT と mPACT を介して構造完全性の最小の侵入と最大組織クリアランスを実現する方法について詳細なステップバイ ステップの概要を提供します。

最適化された受動的なクリアリングの技術を使用して全体の中枢神経系の透明なモデルの生成
マウスおよびラットの全中枢神経組織の光のクリアランスは、様々 な受動的なクリアリング テクニック (図 1) を使用して急速に達成されました。時間をかけてクリア組織の模式図を図 2 aに示します。元協定メソッドとは異なり psPACT (別のプロセス協定) ハイドロゲル ハイブリッドを形成するために 2 つの別々 の手順で 4% アクリルアミド (A4P0) と 0.25% VA 044 イニシエーター溶液サンプルを扱うことを含みます。mPACT (変更された協定) 0.5% α-チオグリセとソリューションをクリア 8 %sds を補うことで psPACT に更に改良します。協定、psPACT、14 日に mPACT...

MPACT 最大の光透過性とそのまま齧歯動物のティッシュ血管系の後続の顕微解析を実現するため、psPACT 2 つの新しい方法論を提案するここでは、全体の中枢神経系。

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

これらのpsPACTおよびmPACT法の全体的な目標は、電気泳動組織透明化システムを必要とせずに、CNS組織全体を迅速に透明化することです。この方法は、アルツハイマー病や傷害、変性、腫瘍形成など、ヒト疾患研究モデル分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、マウスの中枢神経系組織が電気泳動組織クリアリングによって損傷を受けず、修正パッシブクリアリングによって迅速にクリアされることです。この方法のアイデアは、オリジナルのPACTと過去の脳のクリアリングの方法を使用した後に最初に思いつきました。psPACT法とmPACT法は、サンプル調製の複数の段階があるため、実行が難しいため、この方法の視覚的なデモンストレーションは重要です。VA-044粉末を4%PFAと4%アクリルアミドの最終濃度0.25%の溶液に加えてPACTカクテル溶液を調製することから始めますPACT溶液で組織を灌流した後、冷やしたPACT溶液を含む50ミリリットルのチューブに脳全体と脊髄を完全に浸し、摂氏4度で24時間保存します。24時間後、組織を新鮮で冷たいPACT溶液を含む50ミリリットルのチューブに移し、チューブキャップを組織ゲルハイブリダイゼーションシステムに接続し、窒素タンクに接続して摂氏37度に設定します。その後、真空とガスを10分間オンにして、サンプルを窒素ガスに埋め込みます。ハイドロゲルを重合するには、サンプルの入ったチューブを150rpm、37°Cに設定した振とうインキュベーターに3時間、または重合が完了するまで置きます。インキュベーション後、あぶらとり紙を使用して、組織の周囲に残っている重合ヒドロゲルを除去します。次に、組織を透明化溶液の入った50ミリリットルのチューブに移します。37°C、150rpmに設定された振盪器にサンプルを、組織が透明になるまで置きます。マウスの中枢神経系が完全に透明になるまでには、平均して約20日かかります。4%PFAで灌流したマウスからCNSでpsPACTを開始し、4%PFAで摂氏4度で24時間後固定します。固定組織を0.1モルPBSで1時間洗浄します。洗浄後、組織をA4P0溶液に移し、摂氏37度で24時間インキュベートします。翌日、PBSで組織を5分間洗浄した後、PBSの0.25%VA-044に組織を浸漬し、37°Cで6〜24時間インキュベートします。アクリルアミドとその後のVA-044ステップを分離することで、PACTで透明性を達成した後に最終的な組織の完全性を損なう可能性のある、組織を囲む残りの未重合ヒドロゲルモノマーを除去する必要がなくなります。インキュベーション後、組織を新鮮で冷たいVA-044溶液に移します。その後、サンプルを窒素ガスに10分間埋め込みます。組織を清浄な溶液に移します。次に、摂氏37度、150rpmに設定された振とうインキュベーターで、組織が透明になるまでサンプルをインキュベートします。マウスの中枢神経系が完全に透明になるまでには、平均して約17日かかります。mPACTの場合は、クリアリングソリューションステップまでpsPACTのプロトコルに従います。次に、8%SDSに加えて、褐変剤である0.5%α-チオグリセロールを含む組織透明溶液を0.1モルPBSに完全に浸します。37°C、150rpmに設定された振盪器にサンプルを、組織が透明になるまで置きます。マウスの中枢神経系がmPACTを使用して完全な明瞭さを達成するのに、平均してわずか2週間しかかかりません。本研究では、mPACTプロトコルで処理したマウス脳サンプルは、PACTプロトコルとpsPACTプロトコルで処理したサンプルよりも先に、14日後に光透過性を達成しました。mPACTでクリアしたラット全CNSサンプルは、20日間で最大のクリアランスを達成しました。成体ラットの脳は、CNS全体とは対照的に、mPACTによってわずか5日間でクリアされました。この手法を習得すると、適切に実行すれば、マウスの全中枢神経系で2週間で行うことができます。その開発後、この技術は、神経科学と解剖学の分野の研究者が、哺乳類のCNSモデルにおける組織損傷、発達奇形、癌、神経変性疾患などの病態生理学的疾患を探求する道を開きました。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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吸収分子を用いたEx vivo および In vivo イメージングのためのトランジェント光学クリアリング

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新規パッシブ全体の中枢神経系組織における光透過性の急速な生産のための方法をクリア

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