Name: 成人ラットにおける脊髄横片切と非対称行動評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 学ぶ成人ラットの脊髄横片切手術と非対称行動評価法。Brown-Sequard症候群を模した信頼性の高い動物モデルと行動スケールを用いて、神経機能障害の回復パターンを評価する方法です。

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ジェフリー・レッキア・ライフ氏の優れた技術支援に感謝します。この研究は、チネスPLA 2016ZD03と2014ZX01(XJLとTBZ)の済仁軍事地域総病院のディレクターの財団によって部分的にサポートされました。Xu研究室の研究は、NIH 1R01 100531、1R01 NS103481、およびメリットレビューアワードI01 BX002356、I01 BX003705、I01 RX002687によって米国退役軍人省によってサポートされています。

すべての外科的および動物の取り扱い手順は、実験動物のケアと使用のためのガイド(国立研究評議会)およびインディアナ大学医学部の施設動物のケアと使用のガイドラインの下で承認されたとおりに行われました委員 会。
1. 一般的な考察
<ol><li>この研究には成人雌のスプレイグ・ドーリー(SD)ラット(体重200g、n=12)を使用する。すべての検査環境に動物を習慣化し、外科的処置の1週間前にすべての行動検査のためのベースラインデータを収集する。</li>
	<li>実験グループに目がくらんでいる2人の観察者による行動評価を行う。</li>
</ol>2. 動物の準備
<ol><li>70%エタノールで手術台を洗浄してください。手術台に温め込んだ暖房パッドを置きます。無菌の外科用ドレープで外科領域を覆う。手術用ドレープの表面に滅菌ガーゼ、綿棒、オートクレーブ手術用具を置きます。</li>
	<li>手術用具の手術間殺菌のためにマイクロビーズの殺菌器をオンにします。 注 : この実験で使用したツールの例を図 1に示します。</li>
	<li>ケタミン(87.7 mg/kg)およびキシラジン(12.3mg/kg)の腹腔内注射(i.p.)でラットを麻酔します。つま先ピンチ刺激に反応しないで、麻酔の適切な平面に到達することを確認してください。手術中の角膜乾燥を防ぐために、動物の目に獣医軟膏を適用します。</li>
	<li>シェービングによって胸椎の上にある毛髪を取り除く(図2A)。HEPAフィルターを装備した真空で剃った毛皮を取り外します。</li>
	<li>ヨウ素ベースのスクラブとエタノールの3つの交互のスクラブで外科領域をきれいにします。</li>
	<li>提案された切開部位の上にフェネレーションを持つ滅菌ドレープで動物を覆う(図2B)。注。ビデオでは、手術ドレープはデモンストレーション目的で省略されています。</li>
</ol>3. 脊髄片切
<ol><li>ラットの最も低いリブである13番目のリブと胸骨に接続しない浮遊リブをタッチします。13番目の肋骨を後回りにしてT13椎骨との接続を特定し、T10椎骨を識別するためにカウントアップします。</li>
	<li>メスの刃(#15、図1)を使用して、8-11番目の脊椎棘プロセスの上に背部に3〜4cmの中線皮膚切開を行います。</li>
	<li>外科顕微鏡の下で、同じメスの刃を使用して両側のT9およびT10椎骨の側面に向かって脊髄のプロセスから横方向に麻痺した筋肉を解剖し、分離する。 注:このアプローチは、出血を引き起こすことなく、組織をうまくいじめます。</li>
	<li>固定された安定化ホルダーを使用して、脊椎を安定させる。側面の椎骨の両側にスリットを作ります。露出した横方向のプロセスファセットの下にステンレス製のアームをスライドさせ、ネジを締めて安定性を確保します。</li>
	<li>リトラクターを使用して、外科領域から筋肉を退治し(図2B)、T8-11椎骨層層および棘プロセスを暴露する(図2C)。Figure 2B 注: T8 と T9 のスピンプロセスの間には大きなギャップがあり、これは T9 を識別するためのランドマークです (図 2C、後視)。側面から見ると、T9椎骨点の棘の過程、T10のスピンプロセスはドーサリーにポイントし、T11の棘プロセスはロストラリーに向かう。したがって、3つのスピンプロセスがピラミッドを形成し、T10のスピンプロセスがピークを形成します(図2D、横表示)。</li>
	<li>回転器を使用してT9椎骨の後筋切膜切欠術を行う。T9の棘プロセスを切り取り、中間線(図3A、破線)に左の層の小さな部分(図3A、破線)を取り除き、ラミネの右側部分全体をできるだけ横に取り除きます(図3A、破線)。ラミネ切除術の場合、ラミネクトミーの所望の領域が完了するまで、ロンガを薄層の下にそっと挿入し、一度に小さな骨片を切り取ります(図3Bおよび図3C)。</li>
	<li>手術用顕微鏡下で、脊髄の後心中線を特定する(図3C)。正中線を通って針(30G)を脊髄に垂直に挿入し、ベバ面を右側に向けた(図4A)。 注:針は脊髄全体を貫通して、脊柱管の腹壁に到達する必要があります。</li>
	<li>滅菌ゲルフォームの小片で任意の出血を停止します。</li>
	<li>正線の針のトラックを通して、虹色1次切除/微小外科用ハサミの一方の先端を挿入し、右のヘミコードの側面に沿ってもう一方の先端を挿入し、ハサミで右のヘミコードを完全に切り取ります(図4B)。 注:切削中の脊髄への圧迫を最小限に抑えるために、脊髄カットには鋭利なマイクロハサミを使用してください。</li>
	<li>ナイフと同じ針の横端を使用して、病変隙を切断して完全な右のヘミセクションを確認します。外科顕微鏡で椎骨管の底を視覚化することによって右の半離の完全性を確認する(図4C、断面図;図4D、横表示;図4E、後方ビュー)。</li>
	<li>ゼラチンスポンジの小片を病変部位の上に置く(図4F)。セメント混合物を使用して、スポンジとT8とT10のスピナスプロセスに架かる狭い橋を構築します(図4G、H)。 注:セメントブリッジを使用する目的は2倍です:1)それは損傷部位で発達した瘢痕を組織の残りの部分から分離し、2)動物の犠牲の後に脊髄セグメントを解剖することが容易になります。</li>
	<li>4-0シルク糸で筋肉と皮膚層を別々に縫合する。</li>
	<li>0.9%の無菌生理食塩水を皮下に注入して、水和を維持します。鎮痛剤ブプレノルフィン(0.05-2.0mg/kg S)8-12時間/日皮下2日間注射する。最初の週は毎日2〜3回、自発的な膀胱空隙が戻るまで次の週に1〜2回尿膀胱を押してください。</li>
</ol>4. 術後動物のケア
<ol><li>動物を一戸舎の家のケージに戻します。動物の食べ物/水分補給能力を助けるためにケージの底に湿ったげっ歯類のチャウまたはゲルを提供します。手術後の回復時にケージの下に加熱パッドを置きます。過熱を避けるために、加熱パッドがケージの底の半分のみを覆っていることを確認してください。</li>
	<li>0.9%の無菌生理食塩水を皮下に注入して、水和を維持します。鎮痛剤ブプレノルフィン(0.05-2.0mg/kg S)8-12時間/日皮下2日間注射する。最初の週は毎日2〜3回、自発的な膀胱空隙が戻るまで次の週に1〜2回尿膀胱を押してください。</li>
</ol>5. 一方的なヘミセクションステッピング(UHS)を評価する
注:一方的なヘミセクションステッピング(UHS)テストは、SCI動物がオープンフィールドで彼らのipsilesional後肢を利用する能力の直接的な尺度です。1.1で述べたように、動物は1日2回、7日間、オープンフィールド環境(直径42インチ)15に順応した。動物群に目がくらんだ2人の観察者がテストを行う。UHSスコアは、両方のベースライン(T9 HXの7日前)と負傷後のポイントが収集されます。評価の手順は、以下のとおり説明します。
<ol><li>動物を野原環境に入れ、動物の移動を4分間調べます。 注:テスト中に、動物が積極的に動くように励ましを与える場合があります。</li>
	<li>表 1に示すフォームでは、動作カテゴリごとに Yes に 1、動作カテゴリごとに 0 の値を割り当て、合計値を合計して、最終的な UHS スコアを 0 ~ 8 に設定します。 注:表1 0によると:後肢の観察可能な動きはありません。1 – 4: 3後肢関節の孤立した動き (股関節, 膝, 足首);5:重量サポートなしで掃引。6:重量サポートなしで配置。7:重量サポートで配置。8:体重サポートでステップ。</li>
	<li>UHS スコアは、両方のベースライン (T9 HX の 7 日前) と負傷後のタイム ポイントで収集します。 注:スコアは、T9 HXの後に様々な時点で評価されます。</li>
</ol>6. カップリング
<ol><li>狭い滑走路装置または単純なオープンフィールドで歩いている動物を記録するビデオでCPL(歩行結合)を分析します。</li>
	<li>表 1の結合セクションで、"No" に 0、"不規則/不器用" に 1、CPL カテゴリごとに "標準" に 2 のスコアを割り当てます。 注: カップリング (CPL) テストは、相同性 CPL (前部/後部四肢、図 5A)、対角線 CPL (左後または右前の右後方の前肢、図 5B)、および同辺 CPL (同じ側面の前部後肢、図 5C)を含む、四肢の交互の動きの調整を評価することです。T9 HXに続いて、二分側の後肢の欠損が可視となり、相同CPL(図5D)、斜めCPL(図5E)、および同種CPL(図5F)の交交代が生じる。</li>
</ol>7. 接点の配置
注:後肢接触配置試験は、プロプリオセプチブ刺激に対する後肢応答のモーター統合を評価するために使用される。後肢が表面の下に引き下げられた後、動物が後肢を表面に上げてステップアップした場合、下肢はそのままであると考えられる。
<ol><li>両方の後肢が配置応答に使用できるように、動物を垂直位置に保持します。</li>
	<li>後肢の後ろ面を表面の端に向かって軽く前方にブラッシングします(例えば、動物の作業ベンチ)。</li>
	<li>サーフェス上に足の配置を観察し、後肢接触配置スコアを割り当てます。0:配置なし。1:配置する。 注意:後面は刺激を受け、反射がそのままの場合、足は後で伸び、表面に足を置きます。評価フォームも表 1にあります。</li>
</ol>8. グリッドウォーキング
注:グリッドウォーキングテストは、正確なステップ、調整、および正確な足の配置に関与する自発的な運動障害と四肢の動きを評価します。
<ol><li>高いプラスチックコーティングされた金網グリッド(36×38 cm、3cm2の開口部)にラットを置き、30ステップのためにプラットフォームを自由に歩くことができます。</li>
	<li>各四肢の足跡の総数と足のミスステップ数をカウントします。カウントを確認するためにビデオ録画が行われます。 注:2人の盲目の観察者は、動物が歩く際に前肢と後肢の足の配置を評価します。</li>
	<li>次のように、各後肢のグリッドウォーキングスコアを割り当てます - 0: 15より大きいミスステップ;1: 15 以下の誤り;2: 10 以下の誤り;3: 5 以下の誤り。 注: スコア評価は表 1に基づいています。カットオフスコアは、モータの欠陥の重症度の尺度として使用されます。</li>
</ol>9. 灌流と組織処理
<ol><li>ステップ2.3で同様の適切な麻酔の後、経心心面透析プロトコル17に従って動物を注意深く浸透させる。</li>
	<li>脊髄サンプルを解剖して収集し、一晩で4%PFAで後固定します。</li>
	<li>サンプルは、その後、30%スクロース溶液に移すことができる。</li>
	<li>脊髄を断面で切断し、標準的な手順18に従って軸索マーカーSMI-31およびアストロサイズマーカーグリア性フィブリリン酸性タンパク質(GFAP)で選択したセクションを染色する。</li>
</ol>

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</ol>

開示するものは何もありません。

本研究では、ヒトにおけるブラウン・セカール症候群を模倣した成体ラットにおける、シンプルで一貫性のある再現性のT9脊髄HXを産生するためのステップバイステップの手順を報告する。我々はさらに、一方的な後肢ステップ(UHS)、カップリング(CPL)の組み合わせによって測定される非対称神経障害および回復の進行を評価するために敏感であるヘミセクション(CBS-HX)の組み合わせ行動スコアシステムを導入する。接触を配置し、グリッドウォーキング。我々はT9レベルでの傷害を実証するが、この手順は、単純かつ要求の厳しい方法で頸部および腰部のコードを含む脊髄の他の領域に適用することができる。このモデルが、一方的な行動評価と共に、そのようなSCIの傷害メカニズムおよび治療効果を調べるのに役立つことを願っています。
横側HXモデルは、コードのイプシテラショナル半分の病変のみであるため、コードの対側側側は主に保存されており、内部制御として使用することができます。多くの下降経路と昇順経路が一方的に投影され、多くの状況で横方向の片方が軸索管に損傷を与え、反対側の同じ区域を維持し、再編成と再編成の比較を可能にする同じ動物のこれらの区域の機能的な結果。さらに、より局所的な病変を産生すると、特定の経路の標的化を可能にし得る。例えば、腹側および腹側病変は、網状脊髄および前庭脊髄経路に影響を与える可能性がある。後側または側側病変は、コルチコ脊髄およびルブロ脊髄経路に影響を与える可能性があります。また、ヘミセクションまたは部分的損傷モデルは、解剖学および他の経路の機能を研究するためにも使用することができる。したがって、ヘミセクションモデルは、感覚的なアフェレント、下降経路、および固有の脊髄回路による補償を研究するためにユニークに採用することができる。このモデルは、HX後の運動運動回復のメカニズムの調査にも適しています。
横HXは、明らかな行動障害を引き起こし、自動歩行分析19のための運動タスク(例えば、トレッドカンまたはトレッドミル)パラダイムの下で評価可能である。また、逆側側側の側側の軸索管の導電率を電気生理学的記録を用いて測定することができ、この評価は種々の治療に続いて機能的再編成を確立する可能性を提供する。さらに、解剖トレーサーを特定の経路のニューロンに一方的に注射すると、正数標識された正線交差繊維の可視化と、逆順に標識されたニューロン20、21、22、23、24、25との接続が可能となる。20,21,22,23,24,25
典型的な脊髄HX手術は終了するのに20分未満かかりますが、正確で一貫したHXを達成するにはいくつかの練習が必要です。まず、脊髄HXレベルが動物から動物まで一貫していることが重要です。したがって、ラミレンクトミーに適した椎体セグメントが同定されるのが重要です。次に、HX が完全であることを確認します。完全なHXを作るために、1つはマイクロシザーを使用して切断を導くために正中線を通して垂直に挿入された30ゲージの針を使用することができます。針の挿入はまた病変の上の後部脊柱かコードへの損傷を避ける。30ゲージ針の第2の機能は、病変のあいまいさがないことを確認するためにカットをトレースするナイフとして役立つことができるということです。第三に、ゼラチンを病変部位に置くことは、脳脊髄液漏れを最小限に抑えることができ、ゼラチンの上にセメントを置き、椎骨層の層をつなぎ、病変部位における脊椎の安定性を強化し、創傷治癒を促進することができる。電気生理学的記録の適用による信号干渉を避けるために、筋肉、筋膜、および皮膚は4-0シルク糸の層で縫合されるべきである。最後に、対側脊髄の損傷を最小限に抑えるためにあらゆる努力をすべきである。組織学的検証は、一方の側の完全な側半切断と他方の側のコードの残りの半分の保存を確認するために確立されるべきである(図6Eに示すように)。
SCI後の移動を改善するために、これまでの研究では、細胞移植、軸索再生8、18、26、27、18,26,27および活動ベースのリハビリテーション828、29、30を含28,29む幅広い戦略を30利用してきた。一方、機能評価とSCIに続く最良の治療法をスクリーニングするために、いくつかの行動テストが確立されています。BBB運動運動評価尺度は、両側後肢14、31,31に影響を与える正中線の不調または横断損傷などの脊髄対称傷害の運動運動評価のために設計された。BBBの特定のパラメータは、協調およびつま先クリアランスなど、両方の後肢を観察することによって記録される。一方の後肢が無傷で、もう一方が非対称傷害に見られるように赤字を示す場合、無傷の後肢は影響を受けた後肢のスコアを混乱させる。BBBスコアリングは、一方的な怪我の後に他方から1つの後肢スコアを収容しないので、一方的な脊髄損傷を評価するのに理想的ではありません。ただし、各辺の関節の動きと体重サポートが個別に評価され、BBBの一部として計算されない場合、無傷の後肢(シャムコントロールに似ています)は、影響を受けた後肢のスコアを混乱させることはありません。さらに、無傷の後肢は関節の動き、体重サポート、またはステップに劇的な欠陥を持たないため、無傷の側は動物の全体的なスコアを偏らません。
ヘミセクションの組み合わせ行動スコアは、横方ヘミセクションのラットモデルにおける行動回復の敏感かつ容易な評価を行えるように設計されている。これは、復旧の初期段階と後期フェーズの両方の動作を評価するために使用できます。初期段階は、怪我後7〜10日以内です。HX後の最初の3〜5日間で、イプシラショナル後肢活性は着実に増加し、自発的または治療媒介性後肢運動回復を記録するために、より頻繁に評価されるべきである。HX後5〜7日までに、ラットは体重を支えずに後肢の動きを掃引し始めた。7〜10日までに、ラットは典型的に立ち歩き始めた。この段階では、ステッピングパターンに注意を払う必要があります。後期(14-28日)では、イプジラターの後肢活性は安定しており、正常に近かった。
また、カップリング(CPL)容量にも細心の注意を払う必要があります。CPLテスト(歩行結合)は、ビデオ(トレッドスキャン/キャットウォークなど)またはオープンフィールドテスト中の撮影ビデオのいずれかで実行できます。2番目のオプションは、研究者が歩行分析システムにアクセスできない場合に柔軟性を提供します。両方のビデオ録画セッションでは、このテストでは、足ごとに最低 2 回の連続したタッチダウンが必要です。解析には、相同、均一、対角結合の3つの結合パラメータがあります(ステップ6.2)。各カップリングは、基準足と与えられた足を含みます。相同結合(前方左前右、または後ろ位置左後ろ位置)を例えば取り、それは、基準足の1つの全体のストライド時間で割った、与えられた足の最初のタッチダウン時間である。左足と右足は位相がずれているため、完全なカップリングは0.5である必要があります。これは、同じ場合に同じ場合に同じ場合 (左前左の後ろ、または右前から右の後ろ) 。ただし、対角線カップリング(左前から右の後ろ、または右前左の後ろ)の場合、2フィートが位相になるため、完全結合は0または1でなければなりません。ステップ 6.4 では、各 CPL に 0 から 2 までのスコアを割り当てます。詳細では、スコア 0 は、指定された足がタッチダウンを完了するために移動できないことを表す必要があります。スコア1は、与えられた足がタッチダウンを終えるが、完璧なカップリングでは終わっていないので、不規則または不器用なCPLを表します。スコア2は0.5の完全なカップリングを意味します。3 つの結合パラメーターの概念は、前の資料32,,33で詳細に説明されています。CPLは接触の配置および格子の歩行の査定と結合することができる。組み合わせた行動スコアリングシステムの個々の成分は、SCIの異なるラットモデルにおいて多かれ少なかれ有効である。CPLの場合、欠損は交互の速度とシーケンスの完全性において明らかに目に見えるようになりました。一方的なHXの後に赤字を置く預言的な後肢は明らかにすることができる。我々の研究では、すべてのラットは、対側の後肢の配置が赤字を示さなかった間、赤字を置くイシリンジオン後肢を示した。グリッドウォーキングテストは、コルチコ脊柱管を含む接触配置が回復し始めるとき、考慮されるべきです。疲労の問題を排除するために、各テストで行動テストのシーケンスをランダム化することができます。
結論として、ヒトのブラウン・セカール症候群を模倣するT9脊髄HXの再現性のあるインビボラットモデルを作成するためのステップバイステップの手順を報告する。ヘミセクションの併用行動スコアリングシステムは、一方的なSCI後の傷害メカニズムおよび治療を評価するための個々の後肢行動結果のより差別的な尺度を提供する。我々は、胸部HXの外科的処置および行動評価の視覚的記述のみを提供するが、ここで説明する方法は、異なる傷害レベルの他の不完全なSCに適用することができる。

不完全な脊髄損傷(SCI)は、しばしば、重度かつ持続的な感覚運動機能障害を引き起こし、臨床的に最も頻繁なタイプのSCI1である。ヒトにおけるブラウン・セカール症候群は、脊髄の半分に対する病変によって引き起こされ、傷害と同じ(または両側)側の麻痺および下頭蓋の喪失、および反対側の痛みおよび温度感覚の喪失22、3、4。3,4脊髄横半球の動物モデルは、ヒトブラウン・セカール症候群を模倣するために広く使用され、ラット55、6、7、8、9、6,7,8,9オポッサム10、およびサル77、11、12、1311,12,13の様々な脊髄レベルの様々な実験室で報告されている。しかしながら、標準的な横方ヘミセクションを作り出す詳細な視覚化された手順は説明されていない。横半角断面のステップバイステップの手順を提供すると、モデルを最適化し、基礎研究および翻訳研究における実験結果の比較または複製を容易にする必要があります。
一方的なSCIは、対称傷害に対する従来の評価を使用して測定することが困難な非対称的で不均衡な行動の赤字を生み出します。一方的なSCIの神経障害を評価するための適切な方法論は、一方的なSCIモデルを開発する上で不可欠な要素です。一方的な脊髄損傷の極めて重要な役割にもかかわらず、そのような傷害を有する動物の感覚運動障害を評価するための標準化されたプロトコルは欠けている。バッソ・ビーティ・ブレスナハン(BBB)の運動運動評価尺度は、成体ラット14のSCI後に最も頻繁に使用される機能の測定であり、全体として移動の半定量的記述をもたらす。しかし、それは独立して各後肢を測定しません。
本研究では、9番目の胸部(T9)椎骨レベルでげっ歯類脊髄HXを産生するためのステップバイステップの手順を報告する。また、一方的な後肢ステッピング(UHS)、カップリング、接触の配置、および一方的なSCI後の神経障害と回復を評価するためのグリッド歩行評価を含む、ヘミセクション(CBS-HX)の組み合わせ行動尺度を導入する。このモデルが、一方的なSCIの傷害メカニズムと治療効果を調べるのに役立つモデルになることを願っています。

<table><tbody><tr><td>Baby-Mixter Hemostat</td><td>FST</td><td>13013-14</td><td>任意のブランドの選択にすることができます</td></tr><tr><td>高架プラスチックコーティングされた金網グリッド</td><td>任意の</td><td></td><td>36回;38 cm 3 cm2開口部付き</td></tr><tr><td>ジェルフォーム</td><td>ムーアメディカル</td><td>2928</td> 任意の<td>ブランドを選択できます。</td></tr><tr><td>グリップセメントキット、粉末および溶剤</td><td>Dentsply</td><td>675570</td><td>任意のブランドを選択できます。</td></tr><tr><td>マイクロビーズ滅菌器</td><td>FST</td><td>NA</td><td>任意のブランドを選択することができます</td></tr><tr><td>Pearson Rongeur</td><td>FST</td><td>16015-17</td><td>任意のブランドを選択できます。</td></tr><tr><td>リトラクター</td><td>Jinxie 手術用具</td><td>6810</td><td>任意のブランドを選択可能</td></tr><tr><td>メスハンドル</td><td>FST</td><td>10003-12</td><td>任意のブランドを選択可能</td></tr><tr><td>Simplex-P セメント</td><td>ストライカー</td><td></td><td>任意のブランドを選択できます。</td></tr><tr><td>TreadScan自動歩行分析</td><td>CleverSys Inc</td><td>NA</td><td>任意のブランドを選択することができます</td></tr></tbody></table>

成人ラットにおける脊髄横片切と非対称行動評価

Spinal Cord Lateral Hemisection and Asymmetric Behavioral Assessments in Adult Rats

不完全な脊髄損傷(SCI)は、しばしば感覚運動機能の障害を引き起こし、臨床的に最も頻繁なタイプのSCIである。 ヒトブラウン・セカール症候群は、脊髄の半分に対する病変によって引き起こされる一般的なタイプの不完全なSCIであり、傷害と同じ(またはイプシリシオナル)側の麻痺および下頭蓋の喪失、および反対側の痛みおよび温度感覚の喪失をもたらす。ブラウン・セカール症候群の信頼できる動物モデルを確立するには、脊髄横半形(HX)を産生し、神経障害を評価するための適切な方法論が不可欠である。横型のヘミセクションモデルは基礎的研究と翻訳研究において極めて重要な役割を果たすが、そのようなヘミセクションを作成し、一方的な機能を評価するための標準化されたプロトコルは欠けている。本研究の目的は、9番目の胸部(T9)椎体レベルでラット脊椎横HXを産生するためのステップバイステップの手順を説明することです。次に、一方的なSCIに対する非対称神経学的性能の単純で敏感な評価を提供するHX(CBS-HX)の組み合わせ行動尺度を記述する。0から18までの範囲のCBS-HXは一方的な後肢のステップ(UHS)、カップリング、接触の配置およびグリッドの歩行を含む4つの個々の評価から成っている。CBS-HXの場合、イプシテラショナルおよび対側後肢は別々に評価されます。T9 HXの後、イプシラテラヘルドリムは行動機能障害を示したのに対し、対側後肢は実質的な回復を示したことがわかった。CBS-HXは、イプシラショナル後肢と対側後肢の間の行動機能を効果的に識別し、イプセラテラヘルムの回復の時間的進行を検出した。CBS-HX コンポーネントは、必要に応じて別々に、または他のメジャーと組み合わせて分析できます。我々は、胸部HXの外科的処置および行動評価の視覚的記述のみを提供したが、この原則は、他の不完全なSCIおよび傷害の他のレベルに適用することができる。

上述の外科的処置はT9で一貫した、再生可能な横HXの生産を可能にする。灌流および皮膚除去後、T9の外科部位は、残りの縫合糸によって容易に同定することができた(図6A)。さらなる解剖により、層内のセメントブリッジ(図6B)とゼラチンスポンジ(図6C)の露光が可能になる。脊髄は開いた椎骨管に露出し、右側の横断片が確認される(図4D)。傷害のレベルは、露出した椎体および肋骨との関連によってさらに確認することができる(図6D)。傷害震源での断面の免疫蛍光染色は、右半血CORDの完全な喪失および傷害に反する左半血端の保存を示す。このセクションは、軸索マーカーSMI-31とアストロサイズマーカーグリアル線維性酸性タンパク質(GFAP)で染色された(図6E)。
神経行動的には、CBS-HXシステムは、T9 HXに続く時間の経過とともに非対称的な赤字を検出することができる。HXの後、イプシ側後肢は歩く能力を失ったのに対し、対側後肢は歩く能力を保持した。それぞれの行動測定について、3つの試験を実施し、3つの試験の平均を定量・分析に用いた。手術前の対策は、他のラットと比較して最も正確なコントロールと考えるベースラインとして使用しました。4つの個別のメジャー、すなわちUHS、CPL、接触配置、およびグリッドウォーキングのスコアは、別々に分析することができる(図7A-D)またはそれらを複合CBS-HX(図7E)に組み合わせることができる。双方向の分散分析は、UHS(F = 23.199、p &lt; 0.001)、カップリング(F = 8.376、p&lt;0.01)、接触配置(F = 17.672、p&lt;0.001)、グリッドウォーキング(F = 19.261、p&lt;0.001)、CBS-HX(F= 20.897、p&lt;0.001)図7Aは、T9 HX後のUHSの結果を示す。傷害後の最初の3日間で、ラットはステップする能力を失い、イプシリンジオン後肢に対して0-2のスコアを受けた。ステップのような動きは、ほとんどのステップが後ろ足で怪我の7〜10日後にイプシリソン側に現れ始めました。T9 HXの28日後までに、ラットは割り当てられたUHSスコア8で事実上正常な調整で足底ステップを踏むことができた。比較として、逆性後肢の中断が少なく、UHSスコアはT9 HX後の最初の5日以内に低下し、10日後にベースラインレベルに戻った。全CPL(同種、相同および対角結合を含む)試験に対して、T9 HX後の協調の安定性および適応性の両方が著しく低下した(図7B)。負傷後1〜5日で、HX動物はCPLの徴候を示さなかったが、時間の経過とともに、イプシテラショナル後肢のCPLが出現し、しばしば不器用で不安定で、速度、力、方向が不適切に変化した。イプシテラジショナル後肢の接触配置(図7C)およびグリッド歩行(図7D)も、特に傷害後の最初の5日以内にT9 HXの影響を受け、通常は動物が足底ステップを踏み始めたときに回復した。複合 CBS-HX システムには、UHS、CPL、接触配置、および最大スコア 18 のグリッドウォーキングテストが含まれています (図 7E)。イプシラショナル後肢の運動機能は、ヒトブラウン・セカール症候群に見られる赤字と一致するT9横HX後のCBS-HXスコアの低下を示した。イプシアラショナル後肢の運動機能は、対側後肢と比較して、T9側HXの後の1日から4週間後にCBS-HXスコアの減少を示した(図7E)。
このように、UHS、CPL、接触配置、およびグリッドウォーキングを組み合わせた複合CBS-HXシステムは、胸部脊髄の横損傷後のラットの行動機能を評価するために使用され、最大スコア18に対して可能である。
<img alt="手術器具の配置:メス、止血剤、はさみ、リトラクター。教育用。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57126/57126fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図 1.T9右側面の半側の半側の切除部を作り出す外科用具。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57126/57126fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="ラット脊椎手術のセットアップ;解剖されたビュー;脊髄損傷レベル T8-T11;解剖学的図。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57126/57126fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 図 2.外科用エクスポーシュア.A)外科領域の上に背の毛を剃ります。B)リトラクタを使用して外科領域から筋肉を引き込む。C) T8-11椎骨層を露出し、個々のスピンプロセス(矢印)を定義します。T8 と T9 の間には大きなギャップがあり、これは T9 を識別するためのランドマークです。D)スケマティック図面は、スピンプロセスの横のビューを示します。T9-11の棘プロセスは、T10棘プロセスがピークとなるピラミッドを形成します。繰り返しますが、T8とT9の間の大きなギャップは、ラミネンクトミーが行われるT9を同定するためのランドマークとして明確に見られます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57126/57126fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="脊髄露出を示す T9 椎骨椎弓切除図と術後画像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57126/57126fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 図 3.右の片糸のラミネクトミーと暴露.図は、図表にT9脊椎内の脊髄の断面を示しています。破線は、両側のラミネクトミーの程度を示します。B)図は、左側の層の小さな部分と右側の椎骨アーチ全体の除去を示しています。矢印は、コードの裏線の正中線を示します。C)露出した脊髄の後視。なお、背骨静脈は、左右のヘミコードを分ける脊髄の真ん中に位置していた。右のヘミコードは完全に露出していました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57126/57126fig3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="T9脊髄半切開プロセス;図と画像は、針、ゼラチンスポンジ、セメントの使用を示しています。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57126/57126fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 図 4.横片切り.A-D)模式図は、脊髄(A)に中線針を挿入し、T9ヘミセクション(B)、ゼラチンスポンジとセメント(C)の覆い、およびT9横半球(D)の横図を示す。Cの破線は、取り除かれたT9椎間層と右のヘミコードの輪郭を描きます。E)右脊髄片膜の後視。F)ヘミセクション部位の上にゼラチンスポンジの小片の配置。G-H)スポンジとT8とT10の棘プロセスの上に構築されたシンプレックス-Pセメントブリッジ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57126/57126fig4large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="ニューラル結合図;相同体、対角線、同側性;正常、半切開;CNS経路。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57126/57126fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 図 5.カップリング(CPL)テストの模式図。CPLテストは、A)相同CPL(前部/後部肢)、B)対角CPL(前左/前右後部左肢)、C)ホモラショナルCPL(同じ側の前部および後部肢)を含む四肢の交互運動の調整を評価することです。T9 HX(赤いボックス、D-F)の後、後肢の欠損は、イプシリソン側に見えるようになり、動物は同族(D)、対角(E)、および同一辺(F)CPLで協調性<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57126/57126fig5large.jpg" target="_blank">の欠如を示す。</a>
<img alt="脊髄解離段階、標識図、GFAP/SMI31 免疫染色、顕微鏡分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57126/57126fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> 図 6.組織解剖と組織学.灌流後、組織を解剖して脊髄を露出させた。クロスセクションは、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP、アストロサイトのマーカー)およびSMI31(軸索用マーカー)の二重免疫蛍光染色のために処理された。A)傷害部位のランドマークとしての縫合糸の露出(黄色の矢印)。B)歯科用セメント(黄色の矢印)の露出。C)ゼラチンスポンジ(黄色の矢印)の露出。D)右側の脊柱の片方切り(黄色の矢印)を特定する。E)GFAP(緑色)およびSMI31(赤色)で免疫染色された傷害震源での脊髄断面。これは、右脊髄のヘミコードが完全に切断され、左の片調が十分に保存されたことを示しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57126/57126fig6large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="脊椎半切開後の行動スコアグラフ。対側対同側;数日かけて回復します。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57126/57126fig7.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 7"> 図 7.神経行動スコアの結果.グラフは5つの尺度のスコアを示す:A、一方的なヘミセクションスコア(UHS)。B、カップリング(CPL);C、接触配置;D、グリッドウォーキング、およびEは、T9 HX後のイプシラショナルおよび対側後肢の動作スコア(CBS)を組み合わせた。データは平均±s.e.m. *: p &lt; 0.05, **: p &lt; 0.01, ***: p &lt; 0.001 イプシラテラと対角的な後肢の間 (双方向 ANOVA, Tukeyの多重比較テスト, n = 12 ラット/グループ).<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57126/57126fig7large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>サブスコア名/範囲</td>
			<td>説明</td>
			<td colspan="2">スコア</td>
		</tr>
<tr>
<td>一方的な後肢のステップ</td>
			<td rowspan="2">観察可能なわずかな後肢の動き</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>(UHS)</td>
			<td>はい</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>(0-8)</td>
			<td rowspan="2">足首の動き</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>はい</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td rowspan="2">膝の動き</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>はい</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td rowspan="2">股関節の運動</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>はい</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td rowspan="2">スイープ(重量サポートなし)</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>はい</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td rowspan="2">配置(重量サポートなし)</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>はい</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>配置(重量サポート付き)</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>はい</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td rowspan="2">ステップ</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>はい</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>結合</td>
			<td rowspan="3">ホモターショナル</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>(0-6)</td>
			<td>不規則/不器用</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>通常</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td rowspan="3">相同</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>不規則/不器用</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>通常</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td rowspan="3">斜め</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>不規則/不器用</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>通常</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>接点配置</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td>いいえ</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>(0-1)</td>
			<td>はい</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>グリッドウォーキング</td>
			<td rowspan="4">ミスステップ</td>
			<td>&gt;15</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>(0-3)</td>
			<td>≤15</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>≤10</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>≤5</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>合計 CBS-HX</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td>(0-18)</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:ヘミセクションの挙動スコアの組み合わせ(CBS-HX)

ここでは、成人ラットにおける9番目の胸部レベルで信頼性の高い脊髄横片切り(HX)を産生するための外科的処置と、そのような一方的な傷害後の非対称的な欠損を検出するために設計された神経行動評価について説明する。

Incomplete spinal cord injury (SCI) often leads to impairments of sensorimotor functions and is clinically the most frequent type of SCI. Human ...

このプロトコルは、ヒトにおけるブラウン・セカール症候群を模倣する脊髄横半片の信頼性の高い動物モデルと、非対称行動の欠陥を評価するための新しい複合行動尺度を提供する。このマウスの半離層モデルは、ヒトのブラウン・スクアル症候群で起こる神経障害の理解をさらに深めることができる。あなたの言及された評価とは異なり、私たちの新しい組み合わせた行動スケールは、非対称、機関車および実験室内の赤字の評価を必要とする任意の金型に適用することができる。これを用いて、一貫した自然なヘミセクションモデルは、基礎研究と翻訳研究の間の実験結果の比較を容易にすることができる。このモデルで一貫した結果を使用すると、初心者にとっては難しい場合があります。重要なステップは、損傷を誘発するためのガイダンスとして、正中線に針を垂直に配置することです。このビデオを見た後、あなたは外科的処置と行動手順の両方を実行する方法をよく理解しているはずです。処置の日に、70%エタノールで外科テーブルをきれいにし、テーブルの上に温め込まれた暖房パッドを置く。手術領域を無菌の外科用ドレープで覆った後、麻酔下のラットのつまみへの応答の欠如を確認する。角膜乾燥を防ぐために動物の目に軟膏を塗布し、胸椎の上に髪を剃ります。次いで、ヨウ素系とエタノールスクラブを3回交互に使用して、露出した皮膚を洗浄します。動物の準備ができたら、13番目の肋骨を見つけ、肋骨を後回しにしてT-13椎骨との関係を特定します。T-9椎骨を識別するためにカウントし、数15のメスの刃を使用して、8〜11番目の椎体の脊椎棘プロセスにわたって3〜4センチメートルの中線皮膚切開を行います。ラットを手術用顕微鏡の下に移動し、両側のT-9およびT-10椎骨の面に向かって脊髄の筋肉を棘プロセスから横方向に解剖し、分離する。変更された安定化ホルダーで背骨を無効にし、側面椎骨の両側にスリットを作り、露出した横方向プロセスファセットの下でホルダーのステンレス製の腕をスライドさせます。ネジを締めてホルダーを固定し、分度器を使用してT-8~11椎体ラミネアと棘プロセスを露出させます。回転体を使用して、T-9棘プロセスを切り取り、ラミナの小さな部分を取り除き、正中線とラミネの右側部分全体をできるだけ横に取り除きます。次に、ラミナの下にロンゲルをそっと挿入し、一度に1つの小さな骨片を切り取り、必要な部分のラミネクトミーが完了するまで切り取ります。次に、脊髄の背骨の正中線を特定し、30ゲージの針を正線を通って垂直に脊髄に挿入し、脊椎管の腹壁まで、ベベルを右に向けます。滅菌ゲルフォームの小片で出血を停止し、針トラックの正中線を通して虹色のマイクロ手術ハサミのペアの1つの先端を挿入し、右のヘミコードの側面に沿ってもう一方の先端を挿入して、右のヘミコードを完全にカットします。ナイフと同じ針の横端を使用して、病変隙を切断して完全な右のヘミセクションを確認します。そして、正しいヘミセクションの完全性を検証するために、椎骨管の底を視覚化する。セメント混合物を使用して、スポンジに架かる細い橋を構築し、T-8とT-10の棘プロセスを構築します。次いで、4/0シルク糸で筋肉と皮膚層を別々に縫合し、0.9%無菌生理食塩水を皮下に注入して水和を維持する。最初の1週間は毎日2〜3回、次の週に1〜2回、自発的な膀胱空隙が戻るまで尿膀胱を押す。処置後の適切な実験時点で、成体ラットをオープンフィールド実験に入れ、動物の移動を4分間調べる。この表を使用して、動作カテゴリごとに yes''に 1、no'に 0 の値を割り当て、合計値を合計して最終的な片側ヘミセクションステップスコア 0~8 を指定します。ゲートカップリング解析では、狭い滑走路装置上を歩いている実験動物を記録し、各カップリングカテゴリに対して、通常の'および/または不器用'の場合はno'1のスコア0を割り当てます。接触配置評価では、動物を垂直位置に保持し、後肢の両方が配置応答に使用できるようにし、後肢1本の後肢の後ろ面を表面の端に向かって軽く前方にブラッシングします。表面に足の配置を観察し、配置のための0のスコアを配置する後肢の接触を割り当てる'と配置のための1'グリッドウォーキング評価のために、3cmの正方形の開口部を持つ高い36×38センチメートルのプラスチックコーティングされた金網グリッドにラットを置き、ビデオ録画ラットは、各肢の足の誤りの数を定量化できるように30ステップのプラットフォームを横切って自由に歩行します。傷害震源での断面のアミノ蛍光染色は、右のヘミコードの完全な損失を示す。そして、左の脊索の保存は、怪我に反します。個々のゲート評価測定のスコアは個別に分析することも、ヘミセクションスコアの後に複合複合複合的な動作に組み合わせることもできます。傷害後の最初の3日間で、ラットはステップする能力を失い、ステップのような動きは怪我の後7 10日でイプシリソン側に再び現れ始める。そして、ほとんどのステップは後ろ足です。T-9半離切後28日までに、ラットは事実上正常な調整で足底ステップを踏むことができる。対照的に、逆症の後肢は、傷害後の最初の5日以内に一方的な半離数スコアが低下し、10日目までにベースラインに戻り、怪我後にベースラインに戻ることで、中断が少ない。全ゲートカップリング試験では、ヘミセクション後の協調の安定性と適応性の両方が、傷害後の最初の5日間で著しく低下する。イピシテラショナル後肢の接触配置およびグリッドウォーキングも影響を受け、通常は動物が足底ステップを踏み始めると回復する。クリーンカットの怪我を生じるのは難しい場合があります。途中に針を置くことは、組織の完全な分離を保証するための有用なガイドラインであり得る。

spinal-cord-lateral-hemisection-asymmetric-behavioral-assessments

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Medicine

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