Name: スープ希釈の in Vitroスクリーニング: 新しい抗真菌化合物を検出するための簡単かつ高速メソッド (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 学ぶスープ希釈法による抗真菌化合物のスクリーニング手法。CandidaやCryptococcusなどの真菌株を用いて、少量・短時間で新規抗真菌薬の活性評価を行う効率的な実験手順を解説します。

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岬-ブラジル、研究集会-ブラジル、FAP/DF の金融支援に感謝いたします。原稿の校正のため博士ヒューゴ コスタ ・ パエスに感謝しております。

1. ソリューションとメディア
<ol><li>2 X ロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 1640 媒体、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、サブロー ・ デキスト ロース ・ スープ、表 1に従ってサブロー デキスト ロース寒天培地を準備します。</li>
</ol>2. 真菌の菌の成長条件
<ol><li>必要になるまで、-80 ° c、35% のグリセロールで凍結する在庫としてすべての真菌系統を格納します。</li>
	<li>各実験の前に次の手順を実行します。<ol>
<li>カンジダ ・ アルビカンス系統。<ol>
<li>ストックのバイアルを解凍し、200 μ L をキャップと撹拌 (200 rpm) 30 ° C で一晩文化滅菌 50 mL ポリプロピレン チューブにサブロー ブドウ糖液 10 mL に転送します。チューブを傾斜し、文化のよりよい通気を少し開いてキャップを残すしてください。</li>
		</ol>
</li>
		<li>クリプトコッカス ・ ネオフォルマンス系統。<ol>
<li>冷凍ストック バイアル表面をこすり。サブロー ・ ブドウ糖寒天培地プレート上に細胞をプレートし、30 ° C で 48 時間インキュベート隔離されたコロニーの目に見える成長は後に、、最大 15 日間のパラフィン フィルムで封冷蔵庫 (4 ° C) でプレートを維持します。</li>
			<li>生殖不能のつまようじまたは滅菌接種ループを用いた平板から中型の隔離されたコロニーを収集し、滅菌 50 mL の円錐管にサブロー ブドウ糖液 10 mL に接種します。撹拌 (200 rpm) 30 ° C で約 24 時間インキュベートします。</li>
			<li>24 時間培養を超えないようにします。チューブを傾斜し、よい通気を少し開いてキャップを残すしてください。常に、これは抗菌薬耐性に影響を与える重要な要因ですので、各テストの前に細胞の生育を標準化することをお勧めします。 注: 両方の菌が急速な伝播実験では、30 ° C で栽培されたが、温度を研究、たとえば臨床治療 (37 ° C) の目的を反映するように変更できます。最も重要なは、この最初の孵化時間の各真菌の分離の事前確立・再現性を確保するためのすべてのテスト全体で維持する必要があります。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>菌の増殖後室温で 5 分間 1,200 x g で円錐管を遠心分離によって細胞を収集します。上澄みを廃棄し、PBS の 10 mL を加えます。</li>
	<li>再懸濁します細胞と遠心分離機再び室温で 5 分間 1,200 x g で。</li>
	<li>PBS 洗浄と遠心分離をさらに 2 回繰り返します。第 3 洗浄後 2 X RPMI 1640 媒体 (ペレットのサイズ) によると 5 mL の細胞を再懸濁します。</li>
	<li>1: 100 または縮尺希釈 (細胞懸濁液の濁度) に応じて遠心管に 1 mL を準備します。</li>
	<li>この希釈 10 μ L 分注検定商工会議所に配置し、顕微鏡下での 4 つのコーナー領域内のセルの合計数をカウントします。計算式で濃度: (総細胞数/4) × 希釈係数 x 104 (商工会議所希釈定数)。<ol>
<li>生存数と成長条件が検討されている分離の体系的に関連付けられた場合は、100% の生存率を検討してください。 注: 標準化と生存率のカウントの品質管理することができる抗菌感受性試験 (EUCAST) 抗真菌酵母10 最小阻止濃度 (MIC) 法に関する欧州委員会に従ってバック メッキ.</li>
		<li>場合は調査の下で分離の成長/生存率の相関関係が確立されていない、フロキシン B11、トリパン ブルーなどの死んだ細胞を選択的に色の染料の援助と検定で生きているセルをカウントすることによって菌の生存率を測定します。12、ヤヌス グリーン13か。場合にのみ、この時点の人口の生存率は 90% 以上は、このプロトコルの真菌細胞を使用します。 注: デッド/生きている染料が選択の菌とも限りません。使用する前にそれらをテストしてください。たとえば、トリパン ブルー色素はクリプトコッカスとうまく働きません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>その後、2 X RPMI 1640 培地で細胞懸濁液を準備 (2 X 調整 RPMI 1640 培地で接種)。96 ウェルのプレートは、各プレートの 5 mL の量を検討してください。<ol>
<li>C. アルビカンス株すべての 4 x 103セル/mL のストックの細胞懸濁液を準備します。この濃度は各ウェル (2 x 103セル/mL) の最終的な細胞濃度の 2 X です。</li>
		<li>クリプトコッカス菌 2 x 10 のセル4セル/mL のストック文化を準備します。この濃度 (1 × 104セル/mL) 各ウェルで最後のセル濃度 2 倍であります。</li>
		<li>他の菌濃度、培養時間に関連して特定の研究にとって理想的である知られている抗真菌剤でテストします。菌の代謝と複製の時間を考慮します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ペプチド (不明なエージェント)
<ol><li>-20 ° C で凍結乾燥させたペプチドを格納し、それらを各実験の前に脱イオン水に溶解します。一度水に溶解したストレージの最大時間は、各ペプチドの性質によって異なります。</li>
	<li>試金 (2 X) でテスト最高の最終濃度 2 倍の因数を準備します。理想的には、凍結融解サイクルを避けるために 1 つの時間の使用のための十分なペプチドの因数の数が少ないを準備します。 注: 濃度の選択は、文学とペプチドの性質に基づく必要があります。約 100 μ m、ペプチドのシリアル希薄を開始し減少するか、または得られた結果によってこの濃度範囲を増加させることをお勧めします。</li>
</ol>4. 参照抗真菌薬 (ポジティブ コントロール)
<ol><li>水で希釈したそれらのため: 分析の最高濃度の 2 X ソリューションの準備 (セクション 5 を参照してください: ステップの希釈の抗真菌の試金)。<ol>
<li>C. アルビカンス菌のフルコナゾールの 128 μ G/ml またはキャスポファンギンの 128 μ g/mL の溶液を準備します。両方のプレート濃度 64 μ g/mL になります。</li>
		<li>クリプトコッカス菌のアムホテリシン b (水溶性溶液) 32 μ g/mL の溶液を準備します。プレート濃度 16 μ G/ml になります。 注: 通常アムホテリシン B 希釈ジメチルスルホキシド (DMSO) でこの抗真菌剤は水には溶けにくいので。ただし、市販水溶性アムホテリシン B 製剤があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>有機溶剤で希釈した抗真菌薬のため: X、DMSO に原液 100 を用意し、その使用のための水で 10 倍に希釈します。 注: したがって、井戸に DMSO の最終濃度が 1% を超えてください。制御が必要ないくつかの菌類を容認しないもこの濃度、溶媒のことを考えると 1 %dmso を含んでいる媒体で菌をなるも。DMSO は感光性を覚えて、だから箔プレート カバーまたは潜伏期間の持続期間のための暗い部屋に配置。</li>
</ol>5. 抗真菌アッセイ
注: In vitro抗真菌アッセイがいくつかの変更と臨床と研究室の標準研究所 (CLSI) M27 A3 ガイドラインからスープの希釈感受性試験に基づいて実行されます。
<ol><li>各ペプチドが 2 倍連続希釈を準備し、50 μ L の最終巻にポリスチレン 96 ウェル マイクロ プレートで抗真菌薬を制御します。<ol>
<li>最高の 2 倍の濃度で抗真菌剤/ペプチドの 100 μ L 必要な列に最終濃度 1-3、行内 A. 追加ピペットを使用して</li>
		<li>マルチ チャンネル ピペットを使用して、行 B h で、他の井戸に 50 μ L の滅菌水を追加します。</li>
		<li>最高濃度 (行 A) と井戸の 50 μ L を削除、次の濃度 (B 列) の次に移し、均質化します。</li>
		<li>最低濃度で井戸まで上記の手順を繰り返して、この井戸 (列 H) の 50 μ L を廃棄します。水だけで空のコントロールまたは負/成長コントロールのいずれかを列 11、12 (行 A、B、C) を残します。</li>
		<li>(1-3 列と列 11 (負/成長制御)); 各ウェルに RPMI 1640 中調整接種 × 2 の 50 μ L を追加します。C. albicansの最終濃度になり 2 x 103セル/mL、最終濃度クリプトコッカス菌 104セル/mL になります。</li>
		<li>空白のコントロールを準備 (50 μ L の水 + 50 μ L 2 セルなし X RPMI 1640 媒体) 負/成長制御 (50 μ L 水 + 抗真菌薬なし 50 調整 μ L 接種 2 X RPMI 1640 媒体) と記載されている上記のウェル プレートに負荷。</li>
	</ol>
</li>
	<li>テストするそれぞれの化合物のプロシージャは、選択した抗真菌コントロール (4-10 列) を繰り返します。 注: シリアル希薄することができる垂直方向に、下の実験としてまたは水平方向 (すなわち、与えられた化合物/抽出テストする必要があるの希釈液の数が 8 個以上場合) のプレートに。<ol>
<li>化合物を参照する場合薬、またはそのコンポーネントのいずれかが感光性、削減された光でアッセイを行う、箔、板をカバーまたは孵化中に暗い部屋に配置。</li>
	</ol>
</li>
	<li>次のオプションの推奨事項を検討してください。<ol>
<li>蒸発を削減とガス交換を許可する明確なカバー プレートとプレートをシールします。</li>
		<li>プレートが、湿気のある商工会議所;それも蒸発を減らすのに役立ちます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>クリプトコッカスの揺れ 200 rpm 37 ° c 24 時間または 48 h 48 h、 c. アルビカンス株すべての版を孵化させなさい。最終的な音量 (100 μ L) により、波及効果が発生しません。 注: 有意差が認められなかった 24 h でマイク測定値とC. albicansの緊張のための 48 時間の間。それにもかかわらず、48 時間の測定値は、視覚化やすくなっています。</li>
	<li>潜伏期間前後倒立光学顕微鏡の援助と汚染の兆候を確認する同様の形態変化を確認するすべての井戸を観察します。 注: 読みすることができます視覚的に行うし、実験の終わりに撮影します。読む前にプレートを少しホモジナイズしてください。読み取りは、600 の外径を測定することによっても実行できます nm、細胞塊またはフィラメント現象は観察されていません。</li>
	<li>別の日に少なくとも 3 回の実験を実行します。</li>
</ol>

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

希釈テスト目標化合物、化合物の少量を使用して潜在的な抗真菌活性を解析したり、同時に濃度の範囲でそれをテストします。したがって、潜在的な新規抗真菌化合物のスクリーニングの最初のステップとしては、このプロトコルの使用をお勧めします。ここで提示されたプロトコルは、抗真菌療法診療所の選択を支援するために設計、M27 A3 プロトコルに基づいており、さまざまな新しい抗真菌化合物に適応することができます。全体的に、このプロトコルは、抽出物、化合物の物理化学的機能に集中できます。メディアの化合物がヒスタチン 514に及ぼす RPMI など真菌の細胞との相互作用をブロックして、たとえば、アッセイの潜在的な候補を効果が表示誤って。この場合、RPMI が干渉するときの代替メディアはモップ pH 715酵母窒素ベース (YNB) バッファーです。
参照抗真菌結果がガイドラインの範囲内である限り、プロトコルも変更前の成長条件、菌濃度、培養温度、光に敏感なコンポーネントをできます。参照抗真菌は、テスト菌種の現在の...

真菌感染症となっている重要な医学的関心最近数十年でがん治療と HIV/エイズとともに生きる人の受診者など免疫不全の個体数の増加を主因は増大したことや臓器1,2を移植しました。ただし、使用可能な抗真菌薬の非常に限られた配列とそれらにカビ抵抗性の報告数の増加が全身性真菌症3の治療法に関する主要な問題に貢献します。
新規抗真菌化合物の潜在的なソースは、抗菌ペプチド (アンペア)、感染4彼らの生得の免疫反応の一部として多くの生物によって生成される小さなカチオン性ペプチドです。それにもかかわらず、真菌病原体に対するこれらの化合物をテストするスクリーニング法は標準化されていません。異なったプロシージャは、時に同じモデル微生物5,6,7アンペアの抗真菌活性を評価するために使用されています。これらの相違点といくつかのプロトコルの細部の欠乏は、化合物とフラワーの再現性比較を複雑にします。
新しい薬剤の候補者の試験を標準化する方法の 1 つは、臨床などの臨床現場における抗真菌薬感受性を定義するために使用し、実験室標準研究所 (CLSI) M27 A3 のガイドラインに従うことです。ただし、これらの抗真菌薬感受性試験が厳しすぎると考慮しない代謝の変化を考察種類を渡って、彼らはのみいくつかの [エージェントの確立されました。たとえば、とることはありません考慮非発酵性酵母の代謝の必要な。
このプロトコルにより、将来の抗真菌活性物質の活動の評価と抗真菌ペプチドの検索ここに実装されています。それは、新しい化合物8,9のスクリーニングを最適化修正 CLSI M27 A3 ガイドラインからスープ希釈感受性テストに基づいています。これらの変更はコントロールとして参照を抗真菌薬の使用で結果を標準化しながら、最適の事前テスト成長少量化合物の温度や初期とさまざまなメディアでのバリエーションの使用を許可します。ウェル培養皿の使用で、このメソッドでは、画面多数の化合物の迅速かつ確実に可能です。
その固有の柔軟性のため化合物のいくつかの適応で、他の微生物に対する別の化学の授業でこのプロトコルを使用することができます。

<table><tbody><tr><td>培地および試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640培地、l-グルタミン、重炭酸ナトリウムなし</td><td>サーモフィッシャー</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>3-(N-モルフォリノ) プロパンスルホン酸<->モルフォリノ) (MOPS) (o que a gente usa tem um s&oacute;dio, completa o nome dele please)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>2X RPMI中程度</td></tr>の<tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>Din&acircを緩衝するために使用します。マイカ</td><td>1528-1</td><td>137 mM リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td></tr>塩化<tr><td>カリウム (KCl)</td><td>J.T.Baker</td><td>3040-01</td><td>2.7 mM リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td></tr>リン酸<tr><td>二塩基性ナトリウム (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V000129</td><td>10 mM リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td></tr>用)<tr><td>リン酸二水素カリウム (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60230</td><td>2 mM リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td></tr><tr><td>BD Difco Sabouraud デキストロース ブロス</td><td>BD</td><td>238230</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco Sabouraud デキストロース 寒天</td><td>BD</td><td>210950</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V000123</td><td>35% (solu&ccedil;&atilde;o de estoque?Criopreserva&ccedil;&atilde;あ?</td></tr><tr><td>滅菌水</td><td></td><td></td><td>Para dilui&ccedil;&atilde;o das drogas na dilui&ccedil;&atilde;o セリアーダ</td></tr><tr><td><ストロング>抗真菌薬</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アムホテリシン B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>フルコナゾール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8929</td><td></td></tr><tr><td>カスポファンギン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1160</td><td></td></tr><tr><td><ストロング>プラスチック</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mLコニカルチューブ</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr>皿<tr><td>ペトリ</td><td>J.Prolab</td><td>0304-5</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>滅菌溶液リザーバー</td><td>KASVI</td><td>K30-208</td> マルチチャンネルピペットEquipmentおよびその他の材料</強力><td></td></tr><tr><td>光学</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ニコンを使用して溶液をピペットにするために使用します</td><td>E200MV</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーMegaFuge 16R</td><td></td></tr><tr><td>インキュベータ</td><td>ーEthik Technology</td><td>403-3D</td><td>を37°Cに設定します。C</td></tr><tr><td>シェーカー</td><td>ニューブランズウィックサイエンティフィック</td><td>エクセラE25</td><td>を37°に設定。C、200 RPM</td></tr><tr><td>セル計数チャンバー、ノイバウアー</td><td>BOECO ドイツ</td><td>BOE 13</td><td></td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペット</td><td>HTL</td><td>5123</td><td></td></tr></tbody></table>

スープ希釈の in vitroスクリーニング: 新しい抗真菌化合物を検出するための簡単かつ高速メソッド

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

真菌感染症になっている最後の十年の重要な医療条件ですが使用可能な抗真菌薬の数は限られています。このシナリオでは、新しい抗真菌薬のサーチが必要です。ここで報告されるプロトコルは、抗真菌薬のプロパティの画面のペプチドにメソッドを詳しく説明します。それは潜在的な新しい抗真菌薬としての抗菌ペプチドの研究に合わせて変更と臨床と研究室の標準研究所 (CLSI) M27 A3 ガイドラインからスープの希釈感受性テストに基づいています。このプロトコルは、抗真菌化合物の活性を評価する機能の試金を記述および調査の下の分子の特定のクラスに合わせて簡単に変更可能性があります。法は、少量を使用して 96 ウェル プレートで実行される、大規模スクリーニングは、特に場合は、自動設定で実施時間の短時間で完了できます。この手順では、標準化された、調節可能な臨床プロトコルが真菌症の治療を改善するために新しい分子のベンチ作業の追求を助けることができる方法を示しています。

マイクは、潜伏期間の終わりに目に見えるカビを完全に阻害する最も低い抗菌化合物の濃度として定義されます。任意も濁度負/増殖制御井戸に似ていますが、明確なメディア空井戸のようで、よくは肯定的な結果を考慮この議定書の目的は画面の潜在的な抗真菌薬の高速メソッドを持っているため、否定的な考え。ただし、指定されたアンプは菌や殺菌するかどうかを知ることに興味がある場合肯定的な井戸からメディアもサブロー ・ デキスト ロース寒天培地の上にメッキしたり別の生存率テストでチェックします。
新規化合物の作用のメカニズムは知られている、したがって、菌分離 (チェック要領、テーブル、または文献データ) チェックする前に、予想される範囲内参照抗真菌にあるかどうかを確認する不可欠です、(この場合、アンプ; に化合物のテストのマイク図 1と図 2) 条件が理想的であ...

抗真菌化合物をスクリーニングするための簡単と適応のスープ微量液体希釈法。

スープ希釈の in Vitroスクリーニング: 新しい抗真菌化合物を検出するための簡単かつ高速メソッド

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...

この方法の全体的な目標は、臨床検査室で使用されるブロス微量希釈感受性試験の修正を使用して、潜在的な抗真菌化合物の活性を評価することです。この方法は、抗真菌療法の開発における最初のテストの1つである、天然または合成化合物の真菌活性を評価するために使用されます。特に、実験が自動化されて行われる場合、少量で短時間で新しい抗真菌剤の初期スクリーニングの指示を提供します。その手順を実演するのは、私の研究室の博士研究員であるDaniel Zamith-Mirandaです。この手順は、テキストプロトコルに記載されているように、アッセイ用の真菌株を増殖させることから始めます。翌日、コニカルチューブを1200 Gで遠心分離し、室温で5分間細胞を回収します。上清を捨て、各チューブに10ミリリットルのPBSを加え、細胞を再懸濁します。再び1200Gで室温で5分間遠心分離します。PBS洗浄と遠心分離をさらに2回繰り返します。3回目の洗浄後、細胞を5ミリリットルの2倍強度RPMI 1640培地に再懸濁します。細胞懸濁液の濁度に応じて、各菌株の希釈液1〜1000、または1〜1000の1ミリリットルを微量遠心チューブに調製します。この希釈液の10マイクロリットルを分量し、血球計算盤チャンバーに入れ、顕微鏡下の4つの隅の象限の細胞の総数を数えます。各細胞懸濁液の密度を計算した後、ストック細胞懸濁液を2倍の強度のRPMI 1640培地で調製します。C.albicans株の場合はミリリットルあたり4, 000個の細胞を、C.neoformans株の場合はミリリットルあたり20, 000個の細胞を調製します。リポール化ペプチドは、マイナス20°Cで1回の使用のためにアリコートに保存され、各実験の前に脱イオン水にのみ溶解されます。ペプチド濃度は、アッセイで試験した最高最終濃度の2倍にする必要があります。参照用抗真菌剤も用意されています。抗真菌アッセイは、トリプリケートおよび96ウェルポリスチレンマイクロプレートで実施されます。各ペプチドとコントロール抗真菌剤の2倍段階希釈、およびウェルあたり50マイクロリットルの最終容量を使用します。プロトコールの最も重要なステップは段階希釈であるため、次の数ステップでは、分析全体を損なうエラーを避けるために細心の注意を払ってください。ピペットを使用して、100マイクロリットルの抗真菌ペプチドを、列Aの列1から3に、所望の最高濃度の2倍の強度濃度で加えます。マルチチャンネルピペットを使用して、列BからHの他のウェルに50マイクロリットルの滅菌水を加えます。最高濃度のウェルを50マイクロリットル取り除きます。次の濃度の対応するウェルに移し、数回ピペッティングして均質化します。最も低い濃度の井戸に達するまで段階希釈を繰り返し、これらの井戸から50マイクロリットルを廃棄します。行 A、B、および C の列 11 と 12 には、空白のコントロールまたは負の成長コントロール用の水のみを残します。RPMI 1640培地中の2倍強度調整接種物50マイクロリットルを、カラム1〜3の各ウェルに加えてカラム11に加えます。C.albicansの最終的な濃度は、ミリリットルあたり2, 000細胞になります。C.neoformansの最終的な濃度は、ミリリットルあたり10, 000細胞になります。抗真菌剤を使用せずに、50マイクロリットルの水と50マイクロリットルの調整された接種材料を混合することにより、ネガティブ成長コントロールを準備します。50マイクロリットルの水と50マイクロリットルの細胞なしの培地を組み合わせて、ブランクコントロールを準備します。コントロールを適切なウェルにロードします。倒立光学顕微鏡ですべてのウェルを観察し、200rpmで振とうしながらプレートを37°Cでインキュベートします。インキュベーション期間終了後、すべてのウェルを再度観察して、形態の変化を確認するとともに、汚染の兆候がないか確認します。デジタルカメラを使用して各プレートの画像を取得します。この代表的なアッセイでは、100マイクロモルからポイント78マイクロモルの範囲の濃度の3つの抗菌ペプチド(AMP)について、C.neoformansに対する抗真菌活性について評価しました。成長制御とブランクが含まれていました。ブランクウェルに類似した透明な媒体を持つウェルは陽性の結果と見なされますが、ネガティブな成長制御ウェルに類似した濁度を持つウェルはネガティブな結果と見なされます。最小阻害濃度(MIC)は、インキュベーション期間の終了時に目に見える真菌の増殖を完全に阻害する最も低い抗菌化合物濃度として定義されているため、25マイクロモルがAMP1のMICと見なされます。そして、12ポイント5マイクロモル、AMP2用のMIC。AMP3は、テストされたすべての濃度で真菌が成長したため、再評価する必要があります。同様に、C.albicansに対して試験された3つの異なるペプチドは、50マイクロモルがAMP1のMICであると示されました。6マイクロモルはAMP2のMICであり、25マイクロモルはAMP3のMICです。希釈ステップ中の不適切なピペッティングによると思われる不良な結果の例は、このプレートの行Cの5列目から7列目に示されており、反復間でC.neoformansの成長に違いが見られます。このテクニックを習得すると、約2時間で完了し、適切に実行されれば、真菌の増殖時間も加わって完了します。これらの試験された分子の物理的化学的特徴に注意することを忘れないでください。次に、必要な場合に備えて適切な溶媒をコントロールとして使用し、常に同じ成長段階の細胞を使用するようにします。この手順に続いて、タイムキルアッセイ、生存率色素の使用、ST60アッセイなどの他の方法を実行して、化合物が殺菌効果または静真菌効果を持つかどうかなどの追加の質問に答えることができます。開発後、この技術は、医学微生物学の分野の研究者が抗真菌化合物を探すために天然または合成化合物のいくつかの供給源を探索する道を開きました。このビデオを見れば、真菌培養の開始方法、アッセイ用の細胞の調製方法、段階希釈の実施方法、および試験済みの化合物と真菌株をインキュベートした後の結果の読み取り方法について十分に理解できるはずです。真菌性病原体を扱うことは非常に危険であることを忘れないでください。また、この手順を実行しながら、個人用保護具の着用、生物学的安全フード内での作業、適切な安全対策の使用などの準備を行う必要があります。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々はの形成のための、シンプルで迅速かつ堅牢な方法を説明します...

監視形成との抗真菌薬感受性試験のための96ウェルマイクロタイタープレートベースの方法カンジダアルビカンスバイオフィルム

我々は3次元ナノバイオフィルムから成る高密度マイクロアレイプラットフォームを開発しました...

ハイスループット抗真菌薬スクリーニングのためのカンジダバイオチップ（ カルシウム BChip）

出典: Koeth, LM, et al., A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin in vitro 好気性増殖細菌の感受性試験。J. Vis.

グラム陽性菌の抗生物質感受性試験のためのブロス微量希釈法

このビデオは、ブロス微量希釈アッセイを使用して抗真菌化合物をスクリーニングするin...

抗真菌化合物のスクリーニングのためのIn vitroブロス微量希釈アッセイ

ここでは、小干渉合成RNA(siRNA)、化学化合物、および 結核 菌変異体ライブラリーのハイスループット/高含有スクリーンに適用可能な表現型アッセイについて述べている。この方法は、自動共焦点顕微鏡を用いた蛍光標識された宿主細胞内の蛍光標識型 結核...

高スループット/高含有スクリーニングに適応した細胞内マイコバクテリアの定量化のための顕微鏡表現型アッセイ

ここでは、ブロス微量希釈参照法を用いて、臨床的に関連するグラム陽性菌のダルババンシン感受性を決定するためのプロトコルを提示します。...

ダルババンシンの参照ブロス微量希釈法<em&gt;インビトロ</em好気的に成長する細菌の&gt;感受性試験

(1)細胞内細菌性病原体を標的とする真核生物の細胞浸透性抗菌薬を同時に同定し、(2)真核生物の細胞毒性を評価するために、ハイスループットのリアルタイムアッセイが開発されました。その後、同じ技術のバリエーションをデジタル分注技術と組み合わせて、簡便で高解像度の用量反応、および 2 次元および 3...

高スループット、リアルタイム、細胞内抗菌活性のデュアル読み出しテストおよび真核細胞の細胞毒性

我々は、細胞内および細胞内のブロス増殖する細菌、ならびに哺乳動物宿主細胞に対する細胞毒性を標的、 結核菌に対する新規化合物を発見するためのモジュラーハイスループットスクリーニングシステムを開発しました。...

細胞内の標的阻害剤の有効性及び細胞毒性スクリーニングのためのシステム<em&gt;結核菌</em

植物由来製品の抗真菌効果を定量化するために設計された修飾寒天ベースの方法について述べています。このプロトコルを通じて、抗真菌活性に対する揮発性および不揮発性の寄与の両方を評価することができる。さらに、真菌に対する有効性は、単一の実験セットアップの主要な発達段階で測定することができる。...

バイオコントロール製品の揮発性および不揮発性抗真菌活性の測定

C. tropicalisによって形成されるバイオフィルムに対する抗体の影響を研究するために、2,3-ビス(2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル)-5-カルボキシアニリド-2H-テトラゾリウム(XTT)還元アッセイを使用した96ウェルマイクロタイタープレートベースのプロトコルが本明細書に記載されています。このin...

カンジダ・トロピカリス・バイオフィルムに対する抗体の効果を評価するための可溶性テトラゾリウムベースの還元アッセイ

ここでは、4-アミノキノリン化合物の化学合成、結核菌に対する最小阻害濃度の決定、哺乳類細胞株における細胞毒性の評価を含む表現型スクリーニングを通じて潜在的な抗結核薬候補を特定するプロトコルを提示します。...

潜在的な抗結核候補の同定:哺乳類細胞における合成、MIC決定、細胞傷害評価のステップバイステップガイド

学ぶスープ希釈法による抗真菌化合物のスクリーニング手法。CandidaやCryptococcusなどの真菌株を用いて、少量・短時間で新規抗真菌薬の活性評価を行う効率的な実験手順を解説します。

スープ希釈の in Vitroスクリーニング: 新しい抗真菌化合物を検出するための簡単かつ高速メソッド

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