スープ希釈の in Vitroスクリーニング: 新しい抗真菌化合物を検出するための簡単かつ高速メソッド

この方法の全体的な目標は、臨床検査室で使用されるブロス微量希釈感受性試験の修正を使用して、潜在的な抗真菌化合物の活性を評価することです。この方法は、抗真菌療法の開発における最初のテストの1つである、天然または合成化合物の真菌活性を評価するために使用されます。特に、実験が自動化されて行われる場合、少量で短時間で新しい抗真菌剤の初期スクリーニングの指示を提供します。

その手順を実演するのは、私の研究室の博士研究員であるDaniel Zamith-Mirandaです。この手順は、テキストプロトコルに記載されているように、アッセイ用の真菌株を増殖させることから始めます。翌日、コニカルチューブを1200 Gで遠心分離し、室温で5分間細胞を回収します。

上清を捨て、各チューブに10ミリリットルのPBSを加え、細胞を再懸濁します。再び1200Gで室温で5分間遠心分離します。PBS洗浄と遠心分離をさらに2回繰り返します。

3回目の洗浄後、細胞を5ミリリットルの2倍強度RPMI 1640培地に再懸濁します。細胞懸濁液の濁度に応じて、各菌株の希釈液1〜1000、または1〜1000の1ミリリットルを微量遠心チューブに調製します。この希釈液の10マイクロリットルを分量し、血球計算盤チャンバーに入れ、顕微鏡下の4つの隅の象限の細胞の総数を数えます。

各細胞懸濁液の密度を計算した後、ストック細胞懸濁液を2倍の強度のRPMI 1640培地で調製します。C.albicans株の場合はミリリットルあたり4, 000個の細胞を、C.neoformans株の場合はミリリットルあたり20, 000個の細胞を調製します。リポール化ペプチドは、マイナス20°Cで1回の使用のためにアリコートに保存され、各実験の前に脱イオン水にのみ溶解されます。

ペプチド濃度は、アッセイで試験した最高最終濃度の2倍にする必要があります。参照用抗真菌剤も用意されています。抗真菌アッセイは、トリプリケートおよび96ウェルポリスチレンマイクロプレートで実施されます。

各ペプチドとコントロール抗真菌剤の2倍段階希釈、およびウェルあたり50マイクロリットルの最終容量を使用します。プロトコールの最も重要なステップは段階希釈であるため、次の数ステップでは、分析全体を損なうエラーを避けるために細心の注意を払ってください。ピペットを使用して、100マイクロリットルの抗真菌ペプチドを、列Aの列1から3に、所望の最高濃度の2倍の強度濃度で加えます。マルチチャンネルピペットを使用して、列BからHの他のウェルに50マイクロリットルの滅菌水を加えます。最高濃度のウェルを50マイクロリットル取り除きます。

次の濃度の対応するウェルに移し、数回ピペッティングして均質化します。最も低い濃度の井戸に達するまで段階希釈を繰り返し、これらの井戸から50マイクロリットルを廃棄します。行 A、B、および C の列 11 と 12 には、空白のコントロールまたは負の成長コントロール用の水のみを残します。

RPMI 1640培地中の2倍強度調整接種物50マイクロリットルを、カラム1〜3の各ウェルに加えてカラム11に加えます。C.albicansの最終的な濃度は、ミリリットルあたり2, 000細胞になります。C.neoformansの最終的な濃度は、ミリリットルあたり10, 000細胞になります。

抗真菌剤を使用せずに、50マイクロリットルの水と50マイクロリットルの調整された接種材料を混合することにより、ネガティブ成長コントロールを準備します。50マイクロリットルの水と50マイクロリットルの細胞なしの培地を組み合わせて、ブランクコントロールを準備します。コントロールを適切なウェルにロードします。

倒立光学顕微鏡ですべてのウェルを観察し、200rpmで振とうしながらプレートを37°Cでインキュベートします。インキュベーション期間終了後、すべてのウェルを再度観察して、形態の変化を確認するとともに、汚染の兆候がないか確認します。デジタルカメラを使用して各プレートの画像を取得します。

この代表的なアッセイでは、100マイクロモルからポイント78マイクロモルの範囲の濃度の3つの抗菌ペプチド(AMP)について、C.neoformansに対する抗真菌活性について評価しました。成長制御とブランクが含まれていました。ブランクウェルに類似した透明な媒体を持つウェルは陽性の結果と見なされますが、ネガティブな成長制御ウェルに類似した濁度を持つウェルはネガティブな結果と見なされます。

最小阻害濃度(MIC)は、インキュベーション期間の終了時に目に見える真菌の増殖を完全に阻害する最も低い抗菌化合物濃度として定義されているため、25マイクロモルがAMP1のMICと見なされます。そして、12ポイント5マイクロモル、AMP2用のMIC。AMP3は、テストされたすべての濃度で真菌が成長したため、再評価する必要があります。

同様に、C.albicansに対して試験された3つの異なるペプチドは、50マイクロモルがAMP1のMICであると示されました。6マイクロモルはAMP2のMICであり、25マイクロモルはAMP3のMICです。希釈ステップ中の不適切なピペッティングによると思われる不良な結果の例は、このプレートの行Cの5列目から7列目に示されており、反復間でC.neoformansの成長に違いが見られます。

このテクニックを習得すると、約2時間で完了し、適切に実行されれば、真菌の増殖時間も加わって完了します。これらの試験された分子の物理的化学的特徴に注意することを忘れないでください。次に、必要な場合に備えて適切な溶媒をコントロールとして使用し、常に同じ成長段階の細胞を使用するようにします。

この手順に続いて、タイムキルアッセイ、生存率色素の使用、ST60アッセイなどの他の方法を実行して、化合物が殺菌効果または静真菌効果を持つかどうかなどの追加の質問に答えることができます。開発後、この技術は、医学微生物学の分野の研究者が抗真菌化合物を探すために天然または合成化合物のいくつかの供給源を探索する道を開きました。このビデオを見れば、真菌培養の開始方法、アッセイ用の細胞の調製方法、段階希釈の実施方法、および試験済みの化合物と真菌株をインキュベートした後の結果の読み取り方法について十分に理解できるはずです。

真菌性病原体を扱うことは非常に危険であることを忘れないでください。また、この手順を実行しながら、個人用保護具の着用、生物学的安全フード内での作業、適切な安全対策の使用などの準備を行う必要があります。