孤立した塊茎プロトプ ラストのフローサイトメトリーによる表現を測定

この実験の全体的な目標は、ジャガイモ塊茎内の内重複のレベルを評価することです。この方法は、塊茎組織が内重複を受ける発達段階など、ジャガイモ塊茎の形態に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、一般的なフローサイトメトリー調製物と比較して、はるかに明確な結果が得られることです。

手順を実演するのはパーカー・レインビアです。研究室の大学院生です。テキストプロトコルに従って溶液と緩衝液を調製した後、ジャガイモ塊茎を71%エタノールに少なくとも5分間浸して表面滅菌します。

エタノールから植物材料を取り除き、風乾させます。各サンプルに滅菌済みの50ミリリットルのコニカルチューブを準備してラベル付けし、15ミリリットルのフィルター滅菌プラズマ分解インキュベーション溶液またはPISをそれぞれに分注します。滅菌されたメスまたはコルク穴サンプルを使用して、組織を滅菌したいという願望の約1立方センチメートル

滅菌メスを使用して、組織を約3立方ミリメートルの小片に粗く切り刻みます。そして、組織をPISを含む円錐形のチューブに移します。次に、組織を摂氏4度で一晩インキュベートします。

ジャガイモのプロトプラストを生成するには、まず、0.71モルのマンニトール、3ミリモルの塩化カルシウム、1ミリモルのリン酸一カリウムを含む適切な量の酵素溶液またはESを調製し、ろ過することから始めます。塩化マグネシウム1ミリモル、4%オノヅカR-10セルラーゼ、0.8%マセロチームR-10、1%ヘミセルラーゼ、10ミリモルMES緩衝液、pH5.8。血清ピペットを使用して、チューブ内のサンプルからPISを吸引します。

各サンプルに10ミリリットルのESを加え、チューブを2〜3回反転させます。その後、サンプルを摂氏29%、180RPMで一晩インキュベートします。3日目に、プロトプラストを採取して洗浄するために、シェーカーからサンプルを取り出し、約10分間沈殿させます。

血清ピペットを使用して、消化された組織を避けながら、できるだけ多くのES溶液を吸引します。次に、マイクロピペットを使用し、チューブを斜めに保持しながら、消化された組織を避けて、残っているES溶液を再度取り除きます。核への損傷を避けるために、プロトプラスト洗浄液をできるだけ多く除去することが重要です。

チューブを斜めに保持すると、プロトプラストを残しながら溶液を除去するのに役立つ場合があります。各サンプルに15ミリリットルのPWSを追加します。そして、チューブを2〜3回静かに反転させます。

プロトプラストが10分間落ち着くのを待ちます。次に、血清学的ピペットを使用してPWSを取り外します。そして、残っている液体を取り除くためのマイクロピペット。

サンプルを氷上に保持しながら、各チューブに1.5ミリリットルの氷冷FCBを追加します。各サンプルを短時間振とうまたはボルテックスして、凝集した組織を分解します。FCBが細胞に完全に浸透して核を放出できるように、塊茎組織の塊を分解することが重要です。

このステップからコントロールを追加する場合は、かみそりの刃を使用して、1.5ミリリットルの氷冷FCBで小さな葉を細かく刻みます。対照サンプルは、実験サンプルと同じploityであるべきであり、できれば同じ遺伝子型であるべきです。先端を切り落とし、106マイクロメートルの金属メッシュを底まで溶かした1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブを2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに挿入します。

次に、1ミリリットルのFCB組織懸濁液をフィルターに通します。各サンプルに250マイクロリットルのRNA溶液を加えます。次に、チューブを反転させ、室温で30分間インキュベートします。

各サンプルに、事前に調製したヨウ化プロピジウムまたはPI溶液125マイクロリットルを加えます。チューブを反転させ、氷上で30分間インキュベートします。できるだけ早くサンプルを使用し、2時間以内に2つの劣化を避けてください。

前方散乱光と側面散乱光、およびPI対側面散乱の対数スケールを使用して、2つのドットプロットを作成します。また、PIをx軸にしたヒストグラムを作成します。対数スケールは、核の蛍光が大きく異なる可能性があるため、すべてのイベントがスケール内にあることを確認するために必要です。

サンプルの遺伝子型からin vitro葉組織などの既知のコントロールサンプルのチューブをロードします。また、すべてのイベントがスケールどおりになるように電圧を調整します。コントロールサンプルの2Cピークのチャンネルをメモします。

実験サンプルの2Cピークは同じ場所にあるはずです。実験用の塊茎サンプルをロードし、すべてのイベントがスケールに沿っていることを再度確認します。調整が必要な場合は、制御サンプルの電圧調整を繰り返して、2Cピークのチャンネルを特定します。

側方散乱光対PIプロットを使用して、プロトプラスト核を手動でゲートします。次に、PI ヒストグラムをゲート型プロトプラスト核領域のみを表示するように設定します。各サンプルから必要な数のイベントを収集します。

研究者は、フローサイトメトリーに10, 000のゲートイベントを使用することがよくあります。ただし、ここでは塊茎プロトプラストサンプルに2000イベントが使用され、より多くのサンプルと低濃度のサンプルに対応します。プロトプラストの作製は、ジャガイモ塊茎から再現性のあるフローサイトメトリーの結果を得るために必要です。

その一般的な形態がここに表示されます。髄と髄質周囲実質の分離は、黒い線で示されています。実質を皮質から分離する血管輪は、黒い矢印で示されています。

単離されたプロトプラストは、原形質膜が損なわれていない球形で対称的である必要があります。葉と塊茎のプロトプラストのサイズの違い、および組織内のサイズの違いは、重複の異なるレベルを示している可能性があることに注意してください。この図は、フローサイトメトリーの散布図とヒストグラムの両方で発生する可能性のある結果のばらつきを示しています。

インタクトな核は、細胞の相対的な存在量を定量するためにピーク間がきれいに分離されていますが、ピークに統合されたサンプルは、幅が広く重なり合っている塩基がシフトしています。対応する散布図では、ブラックボックスはヒストグラムの核イベントゲーティングを示し、イベントのクラスタリングはヒストグラムのピークの幅に反映されます。この実験では、重複内濃度(EI)を分析し、髄組織が皮質組織よりも高いEIを示すという以前の結果を確認しています。

驚くべきことに、実質組織のプロファイルは皮質に似ており、髄組織とも大きく異なっていました。この手順を試行する際には、最初の2回のインキュベーションでサンプルの無菌性を維持すること、およびプロトプラストが溶解された後もサンプルをできるだけ氷上に保持することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、どの遺伝子が塊茎の重複内重複レベルに影響を与えるかなどの追加の質問に答えるために、遺伝子操作などの他の方法を実行できます。

このビデオを見れば、ジャガイモ塊茎からプロトプラストを抽出し、フローサイトメトリーでエンドリデュープレベルを調査するための準備方法について十分に理解できるはずです。ヨウ化プロピジウムの取り扱いは非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には常に適切なPPEなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。