Name: 孤立した塊茎プロトプ ラストのフローサイトメトリーによる表現を測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 学ぶ ジャガイモ塊茎のプロトプラスト抽出とフローサイトメトリーによるエンドレデュプリケーション測定法。Solanum tuberosumを用いたこの手法は、塊茎組織の発育段階におけるDNA複製レベルを正確に評価し、従来法より明確な結果を提供します。

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本研究「ヘテロ接合性、対立の構図とジャガイモのコピー数変化を解明」の国立科学財団賞数 1237969 によって資金を供給された、米国農務省特別助成 2014年-34141-22266 大学 (メイン州) を撮って

注: それは通常実験サンプルとして同じ倍数性の葉組織のフォームに適切なコントロールを含めることが重要です。塊茎のサンプルの 2 C ピークは小さいと識別することは困難かもしれないためにです。
1. 準備
注: ここに記載されてソリューションは早めに準備、4 ° C で保存される可能性があります、後続のステップの説明は当日使用の新鮮ななされなければなりません。
<ol><li>適切なボリュームの原形質分離培養ソリューション (PI) を作る (15 mL/サンプル): 0.55 M のマンニトール 2 mM CaCl2、1 mM KH2PO4、1 mM MgCl2、50 mM Tris バッファー pH 7.5 (HCl で調整)。</li>
	<li>原形質分離洗浄ソリューション (PWS) の適切なボリュームを作る (15 mL/サンプル) 小僧に 0.71 M のマンニトールの付加を除いて同一であります。</li>
	<li>変更したガルブレイスの流れ Cytometry バッファー11 (FCB) の 250 mL を作る: 13.6 mM クエン酸ナトリウム (ナトリウム)、8 mM モップ、18 mM MgCl20.4 %v/v トリトン X-100。トリトン X-100 を配布する、少なくとも 30 分間かき混ぜます。</li>
	<li>フィルターは、0.22 μ m フィルターを非対称ポリエーテルサルホン (猿) 小僧と PWS のソリューションを滅菌します。真空駆動ろ過ユニットを使用します。</li>
	<li>
106 μ m メッシュ フィルター分離プロトプ ラストを準備します。しかし懸濁液の 106 μ m フィルターを通過法を使用可能性がありますコレクション チューブに直接入れ子にすることができる遠心管 1.5 mL を準備します。 注: これらは滅菌する必要はありません。<ol>
<li>1.5 mL 遠心管を使用している場合は、先端から 1 cm 各微量遠心チューブをカットします。ホット プレートまたは他の熱の熱源を使用して、1 cm2作品 106 μ m 鋼は、アルミ箔の部分にメッシュします。メッシュに、管の切断端に押してに癒合しました。</li>
	</ol>
</li>
	<li>すべての土および残骸の取り外し、サンプリングされるジャガイモを洗います。 注: 塊茎の大きさおよび年齢実験の目的に適したする必要がありますが、結果の質に影響を与えるしていないましょう。正常に 8 ヶ月を冷蔵 (4 ° C、相対湿度 95%) にされている塊茎にこのプロトコルを行った.欠陥 (例えば塊茎の端の腐敗、中空の中心、黒い壊死部分) と塊茎は敏感かもしれないが、彼らは避けてください、可能であれば。</li>
</ol>2. 1 日目: Plasmolyze 塊茎組織
注: コントロールの葉のサンプルをここで記載してプロトプ ラストの生成または粗野な準備が好ましい場合は 5.2 でステップすることができます。これは、層流フードなどの無菌環境で無菌のツールで行う必要があります。
<ol><li>表面には、少なくとも 5 分 75% エタノールに浸漬によるジャガイモ塊茎が殺菌します。</li>
	<li>エタノールから塊茎を外し、エアーで乾燥させます。通常、塊茎が 100 g を超える場合 〜 5 分、長くかかります。</li>
	<li>準備し、各サンプルのフィルターの分注 15 mL ラベル滅菌 50 mL の円錐管にそれぞれ小僧を滅菌します。</li>
	<li>
滅菌メスまたはコルクの穴あけ器を使用して滅菌の塊茎から目的の組織の約 1 cm3 をサンプルします。 注: サンプリングされる組織によって 1 つがまたはを使用して滅菌コルクボーラー ナイフ/メス。例えば、力強さが必要な場合コルクの穴あけ器を使用して、塊茎の遠位端に頂端からコアをコアの中心部の一部をサンプリングする場合があります。ただし、ジャガイモ塊茎の非対称の内部形態によるは、サンプルの実質により正確な可能性がありますまたは皮質塊茎を半減し、目的の組織を切除します。内部塊茎形態の描写は、図 1を参照してください。<ol>
<li>約 3 mm の3ピース、PI を含む円錐管に転送組織に滅菌メスを使用して組織を粗く切る。4 ° C で一晩インキュベートします。 注: これは表面積を最大化するためには、PI、後酵素液が完全により完全な消化力、組織に浸透し、。</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig1.jpg"> 図 1: ジャガイモ塊茎組織の内部形態。(P) の力強さとー柔組織 (PM) 間の分離は、黒い線で示されています。(C) 皮質から実質を隔てる血管リングは黒の矢印で示されます。ストロン終わり (S) と塊茎の目 (E) も付いています。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57134/57134fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
3. 2 日目: かんしょプロトプ ラストを生成します。
注: これは層流フードなどの無菌環境で無菌のツールで実行する必要があります。
<ol><li>準備し、フィルター (0.45 μ m 猿フィルター) 適切な量の酵素ソリューション (ES) (10 mL/サンプル): 0.71 M のマンニトール、3 mM CaCl2、1 mM KH2PO4、1 mM MgCl2, 4% 小野塚 R 10 セルラーゼ, 0.8% macerozyme R-10 1% hemicululase 10pH 5.8 mM MES バッファーこの手順で適切なフィルターを使用することを確認します。フィルター孔 0.45 μ m、猿などの低蛋白結合膜濾過における酵素の損失を最小限に抑えるに対し目詰まりを起こしよりも小さいサイズです。</li>
	<li>血清学的滅菌ピペットを使用して円錐管のサンプルから PI を離れて吸い出しなさい。</li>
	<li>各サンプルし、反転する ES の 10 mL を追加し 2-3 回。</li>
	<li>180 rpm 水平加振 29 ° C で一晩サンプルをインキュベートします。少なくとも 16 h のためのサンプルをインキュベートします。</li>
</ol>4 3 日目: 収穫プロトプ ラストとプロトプ ラスト洗浄
注: 無菌条件がない長い必要なこの時点で。
<ol><li>シェーカーからサンプルを削除し、〜 10 分のために解決できるようにします。</li>
	<li>
できるだけ ES ソリューションの多くを離れて吸い出しなさい。
	<ol>
<li>血清ピペット、消化組織を削除することを避けるために世話を可能な限り ES ソリューションの多くを削除します。</li>
		<li>マイクロ ピペットを使用、残りの ES ソリューションは、再び消化組織を回避します。角度でチューブを押しながら ES ソリューションが、消化の組織のまま下部に蓋の方に流れるので、これは最も簡単です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>各サンプルに PWS の 15 の mL を追加し、軽く反転 2-3 回。プロトプ ラスト 10 分のために解決を許可します。</li>
	<li>血清ピペットで PWS を削除します。マイクロ ピペットを使用して、残りの液体を削除します。 注: この手順は cytometry 流れの中にサンプルの核の整合性の確保に不可欠です。トラブルシューティングでは、この手順はサンプルのエラーの最も可能性の高いソースをことが判明しました。</li>
</ol>5. 3 日目: フローサイトメトリー用のサンプルを準備します。
注意: サンプル保管すべきここから氷の上明記されていない限り。
<ol><li>Propidium ヨウ化 (0.4 mg propidium ヨウ化/mL FCB) と RNase ソリューションを準備 (RNase A 0.8 mg/mL FCB) FCB のそれぞれを溶解することにより。 注意: Propidium ヨウ化は非常に有毒です。皮膚や目に接触を避けます。適切な PPE を着用します。</li>
	<li>
氷の 1.5 mL を追加各サンプルに冷たい FCB。簡単に手ふれや渦を分割する各サンプル集計組織。塊茎組織の塊を破る FCB が完全に細胞に浸透し、核を解放することが重要です。別のサンプルはもっとまたはより少なく組織および遺伝子型によって撹拌を必要があります。 注: FCB は核を解放、プロトプ ラストを溶かします。したがって維持の必要性の劣化を防ぐために氷の上サンプルします。<ol>
<li>制御流れ cytometry サンプルがプロトプ ラストの生成手順に含まれていない場合ここに含まれているかもしれない。氷の 1.5 mL の小葉 (2〜 3 cm) をみじんコントロールを追加する場合は、かみそりの刃を使用して冷たい FCB。コントロールのサンプルは、好ましくは、同じ遺伝子実験のサンプルとして同じ倍数性をする必要があります。培養幼植物体は、温室や圃場栽培した植物よりもクリーンなピークを与える傾向があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
FCB/組織懸濁液の 1 mL を 106 μ m のメッシュ フィルターを通過します。カットの先端と 1.5 mL 遠心チューブを使用し、1.5.1 の手順で説明するよう下部に金網が溶けています。この微量遠心チューブは、2 mL 遠心チューブに直接入れ子にすることし、サンプルを直接通過。ろ過の別のメソッドを使用すると、すると、その濾液が冷えたペトリ プレートで収集され 2 mL チューブに転送されます。 注: 時々 残りの集計および細胞残骸が詰まらせるメッシュ フィルター。この場合、数回タップ 2 つの入れ子になったマイクロ遠心チューブ用が単に破片を取り除くため。</li>
	<li>RNase ソリューションの 250 μ L を各サンプルに追加します。反転し、室温 (RT) で 30 分間インキュベートします。 注: この手順は、cytometry 流れの中に存在するノイズの少ないサンプルから RNA を削除するものです。但し、核は短命、研究者はインキュベーション時間を短縮したり、氷の上、サンプルの劣化が発生する場合それを実行するかもしれない。</li>
	<li>Propidium ヨウ化ソリューションの 125 μ L を各サンプルに追加します。反転し、氷上で 30 分間インキュベートします。 注: サンプルは、劣化を氷の上にも、2 時間以内に感じ取ることが、できるだけ早くフローサイトメトリー用使用必要があります。</li>
</ol>6 ジャガイモ塊茎の核の 3 日目: フローサイトメトリー
注: 流れの cytometer 操作およびソフトウェアは機器やメーカーによって異なります。流れの cytometer の特定の操作の詳細については、計測器のユーザー ガイドで提供されます。
<ol><li>対側方散乱と propidium ヨウ化 (PI) 対側方散乱前方散乱の対数目盛を使用して 2 つのドット プロットを作成します。また x 軸に PI とヒストグラムを作成します。対数スケールは、確実にすべてのイベントがスケール内に核は蛍光で大幅に異なる場合があります必要があります。</li>
	<li>
知られているコントロール サンプル チューブをロードし、すべてのイベントのスケールでは、電圧を調整します。サンプルの遺伝子型から体外葉のティッシュを使用します。異なるにともなってのサンプルを実行する場合は、各コントロールのサンプルが含まれてする必要があります。
	<ol>
<li>コントロールのサンプルで 2 C ピークのチャネルを確認します。実験サンプルの 2 C ピークは、同じ場所に落ちる必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>実験 (塊茎) サンプルをロードし、再度すべてのイベントがスケール上にあることを確認します。調整が必要な繰り返し手順 2 C のチャネルを識別する 6.2 がピークします。</li>
	<li>手動でゲート側対 PI 散布プロトプ ラストの核。</li>
	<li>PI ヒストグラムのみゲート プロトプ ラストの核の領域を表示するに設定します。</li>
	<li>各サンプルからのイベントの数を収集します。頻繁に研究者使用; フローサイトメトリー用 10,000 ゲート イベントただしより多くのサンプルと低濃度のサンプルに対応するのに塊茎プロトプ ラスト試料 2,000 イベントを使用します。</li>
	<li>次の数式を使用して PI のヒストグラムから各サンプルの EI を計算します。 EI =<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57134/57134eq1.jpg"> 4 C が 4 C (表現の単一の円形を表す) である核の割合は、8 C は 8 C との比率です。ピークの C 値のヒストグラムの例については図 4を参照してください。</li>
</ol>

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</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

ここに提示されたプロトコルは、研究者が変更した携帯コンテンツと増加したセル サイズ一見ジャガイモ塊茎内表現を評価する手段を妨げ他の流れの cytometry 準備を提供します。プロトコルは、核の整合性を維持しながらノイズや破片を削減する手段としてプロトプ ラストの生成に依存します。以前は、研究者は特に反抗的な流れの cytometry のサンプルと同様の準備を説明だけでなく、さまざまな病因19,20などのトピックを勉強する塊茎プロトプ ラストを利用が。しかし、私たちの知識表現を勉強するためのフローサイトメトリーによるこのような塊茎のプロトプ ラストの使用を組み合わせてなし。さらに、私たちは技術と同様、粗野な典型的な準備利用 2 つの塊茎表現6,7を評価するためにのみ他の研究よりもより信頼性の高いするプロトプ ラストの使用を発見しました。ここでのプロトコルは、その実行と試料の調製とそれを用いる典型的な実験結果に潜在的な落とし穴の欠点を議論します。
ユーティリティと塊茎の流れの cytometry のプロトコルの再現性、にもかかわらず議論すべきいくつかの弱点があります。まず、プロトコルは時間がかかり、2 つ夜通し孵化を必要とします。さらに、プロトコルには、いくつかの高価な試薬、特にセルラーゼと macerozyme が必要です。さらに、準備では、多くのイベントが必要な場合は特に、1 日の内でスループットが制限される場合、数時間以内、時間高感度、分解を使用しています。プロトコルを最後に、作成しながら信頼性の高い核と低品質の結果に結果の損傷に見えるすべての試料内のエラーに敏感です。たとえば、不適切な無菌技術による原形質分離と原形質体の生成手順 (1-3.4) 中に微生物汚染が発生します。サンプルについては、成功を常に排除しながら、サンプルの汚染は再び核への損傷をせいでしょう、得られたヒストグラムの品質を劇的に減少させるようです。
前述したように、プロトコルの主要な欠点は、コスト、時間、およびエラーの感度。研究者は、これらの各を軽減する手順を実行するがあります。費用、というは多くのサンプルをプロトコルを適用しようとする研究者がさまざまな組織として酵素濃度および/または消化ステップの期間を変更することを検討することし、応答性の遺伝子型が異なる場合があります。21がここに採用はない実証されて以前 ES をリサイクルし、フィルタ リングの可能性も含まれます。私たちの観測の時間それは最初の潜伏 (原形質分離のステップ) を省略し、まだプロトプ ラスト; を抽出することが可能ただし、整合性と豊かさが低下します、結果に悪影響を及ぼす影響を与えます。サンプルの劣化を低減するには、研究者は、いくつかの流れの cytometry アプローチが22サンプルの整合性を維持するために定着剤 (ホルムアルデヒドなど) の使用を含む検討すること。劣化を防ぐためし、の発表と同じ日に発生するサンプル プロトプ ラストよりもむしろ貯蔵強請とフローサイトメトリーを可能にする両方に便利な手段があります。ES や FBC; ヌクレアーゼ阻害剤を含むように核の離職を防止する別の手段があります。2-メルカプトエタノールは、開発中に顕著な変更を行なわれず、一方、他の阻害剤が本テストされていません。
私たちの観測の単一の最も重要なステップは流れの cytometry バッファー (FCB) を追加する前にすべての原形質分離洗浄ソリューションの手順 4.4、除去です。場合も少量 (< 10 μ L) のまま、サンプルがはるかに貧しいまたはも失敗例につながることができる低下する可能性があります。これは酵素液内不純物による可能性が高い(例えば核酸分解酵素、プロテアーゼ)23,24平均潜伏期と低濃度でも、サンプル実行の間の時間の間に核をすぐに低下します。もう一つの重要な考慮事項は、PI および RNase の潜伏ステップの期間です。前述のプロトコルでは、サンプル残っていない安定した低核から添加 FCB 研究者はサンプル以上の長いフローサイトメトリーに合わせて手順の期間を短縮する可能性がありますので実行される後よりも、数時間の濃度。これもサンプルあたりのイベント数と実行するまたは前述の定着剤の使用を検討するためのサンプルの合計数のトレードオフを検討する研究が必要です。
組織と遺伝子型の違い
プロトコルの結果代表を提供するために組織によって以前に報告された変化を確認し、倍数性と遺伝子多型の影響を検討の 2 つの簡単な実験を考案しました。組織実験の結果は、髄再び発見された最高の EI としてプロトコルが再現可能な結果を生成することを示します。いた以前評価されていない驚くべきこと実質の組織は、皮質組織に似ており力強さよりかなり低い EI 値を持っていた。柔細胞が成熟で少なくとも通常髄または皮質の細胞よりも大きいように、これは予想ではなかったです。1 つの可能な説明は、塊茎 (90-130 g) も完全に膨張し、その最大の C 値25に到達するため、満期時塊茎ボリュームの大部分を構成している柔細胞が成熟したです。これはまた理由を説明するかもしれない確認 (VT_SUP_19) と 2 倍の確認 (VT_SUP_19 4 x) 品種の優れた塊茎; よりも有意に大きい EI を実証ほぼ同じサイズの塊茎は、各遺伝子からサンプリングされた、VT_SUP_19 または同質四倍体の塊茎の最大サイズは、前駆細胞のそれよりもはるかに小さい。したがって、彼らが単に大きい EI を表示されることがあります彼らは、最大達成可能なサイズを基準にして大きかったので。また、違い VT_SUP_19 がその四倍体の前駆細胞から受け取った遺伝的補完の結果であるかもしれない。別の可能性は、確認の抽出、四倍体から発生したゲノムの削減が有害な対立遺伝子の高架の EI26に貢献するまた示されている植物全体の応力の結果をマスク可能性があります。それにもかかわらず、これは慎重に検討研究者が遺伝子型、特に間、EI 値の比較に使用する塊茎と組織を選択するときを施す必要があります示しています。
将来のアプリケーション
この資料に記載されているプロトコルは、ジャガイモの理解表現の研究者の重要なツールを提供します。塊茎組織全体で開発の経過と自然変動の評価研究、表現の遺伝と環境のコンポーネントに可能性があります。最終的には、表現はジャガイモ改善、評価の信頼性の高い手段を必要とする事業のための有望なターゲットをすることができます。

表現は、セルが典型的な細胞周期を好まれる場合、代わりに細胞分裂することがなく DNA 複製の繰り返しラウンドから成る開発の代替コースを受けるプロセス。結果セルが DNA を増加している量と核面積細胞制御、拡張、および専門の役割を果たすと考えられています。一般的に、表現 (、シロイナズナと呼ばれる) および DNA 量の増加に対応のラウンドはより大きいセルのボリュームに関連付けられている、DNA 量を増加した「karyoplasmic 説」の原因となった観測必要です適切大きく、おそらくより複雑なセル1に調節します。この現象は、高等植物、構造/防御 (毛)23,,を含め組織の範囲で観察された一般的な飼料 (トウモロコシの胚乳)4、5、およびシンク/ストレージ (トマト果皮;ジャガイモ塊茎)6,7,8関数。果実、その表現は否定的な表現と果実発育期間9関係によって証明されるように果皮の急速な拡大を促進する役割を果たしているが示唆されています。例えば細胞核 DNA 量トマト果皮8で最大 512 C (半数体のゲノムの 512 倍) が観察されています。さらにシュヴァリエら (2014 年) を示した細胞周期遺伝子の発現の変化が大きいフルーツ10で、結果果皮内の表現のレベルの増加につながることができます。したがって、表現を促進する遺伝子の変化は、バイオマスや植物の繁殖や遺伝的な操作で収量の改善の潜在的なターゲットを提供します。しかし、このような改善は偶発の原因のより深い理解と表現の結果です。
表現よく propidium ヨウ化12 (PI) などの DNA 結合 fluorophore と粗組織準備11, にリリースされた核を培養するというフローサイトメトリーによって測定します。フィルターが適用されたサンプルは、蛍光体に固有の発光波長を観測できる流れの cytometer のレーザーによって渡されます。各イベント (すなわち核) の蛍光強度の直接粒子の DNA 量と相関しています。したがって、既知の標準に比較すると、指定されたサンプル内のセルの相対と絶対の DNA 量を計算することがあります。表現インデックス (EI) は、細胞の DNA の内容 (C 値) 1 C が半数体細胞 (プロトコルの手順 6.7 で提示される式) の DNA の内容を観察することによって発生: サンプル内のセルあたりの平均数を確立することによって決定されます。例えば、二倍体生物の体細胞の DNA の基本内容は 2 c. です。表現の単一の円形に対応する以上、0; に近い EI 必要があるサンプルに 4 C でいくつかのセルがある場合しかしほぼすべての細胞が 4 C EI は約 1 になります。しかし、表現の複数のラウンドはより高い植物観察 EI 値で共通がはるかに大きいかもしれません。表現の指標を計算しながら比較的簡単ですが、それは核の相対的な存在量 C 値が確実に必要とする確認する、特定の種や組織 (ジャガイモ塊茎を含む) には排除します。それは細胞の解剖学、化学または細胞壁組成13の違いが一般的に使用される適切なバッファーに直接核を解放するかみそりの刃を使用して典型的な準備に反抗するこれらのサンプルを引き起こす可能性が高いトマト果皮など組織は、表現のためのモデルは8を研究します。
ジャガイモ, 塊茎内表現の検討は、前述の粗野な準備に一貫性のない結果が得られるよう信頼性の高いプロトコルの欠如の一部でおそらくためだけのカップルの研究に限られています。一方、このようなアプローチは、塊茎サンプル体験劣化や異なる C 値はほぼ不可能の核の構成のピークの分化を作る破片状のノイズの豊富な葉に適しています。これはおそらく、細胞構成と塊茎細胞内細胞の残骸の豊富さの違い (e.g。 デンプン蓄積アミロプ)。このハードルを克服するために我々 は最近ジャガイモ塊茎のフローサイトメトリーの区別可能なピークを取得するためのより信頼性の高いプロトコルを開発しました。各ピーク内細胞の頻度は、異なる遺伝子型または塊茎を構成するさまざまな組織の正確な表現レベルを計算するため使用できます。プロトコルは、変更したプロトプ ラスト抽出法の14,15先行詞を採用して前述の流れ cytometry11、ジャガイモ親戚, 品種および組織16内ではかなりの変動を示した.ここで倍数性、組織、および塊茎の大きさのコンテキストで EI を評価することによって詳細にプロトコルを紹介します。

<table><tbody><tr><td>血清学ピペット</td><td>Fisher</td><td>13-676-10k</td><td>(滅菌)</td></tr><tr><td>Pipet Aid XP (オートピペット)</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>コニカルチューブ (50 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td>(滅菌)</td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ (1.5 mL)</td><td>Globe Scientific</td><td>111558</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ (2 mL)</td><td>Globe Scientific</td><td></td><td></td>111552</tr><tr><td>真空ろ過ユニット(0.22 &micro;m)(aPES)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>564-0020</td><td>(sterile)</td></tr><tr><td>真空ろ過ユニット(0.45 & micro;m)(aPES)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>168-0045</td><td>(滅菌)</td></tr><tr><td>セルラーゼ "オノヅカR-10"</td><td>ヤクルト</td><td></td><td>コンタクトカンパニー</td></tr><tr><td>マセロチーム "オノヅカR-10"</td><td>ヤクルト</td><td></td><td>コンタクトカンパニー</td></tr><tr><td>ヘミセルラーゼ</td><td>Σ</td><td>H2125</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>MESバッファー</td><td>アクロスオーガニック</td><td>172590250</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>MP バイオケミカル</td>ズ <td>194854</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム(六水和物)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>M35-500</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム(二水和物)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>D-マンニトール</td><td>アクロスオーガニックス</td><td>423922500</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>アクロスオーガニックス</td><td>17263-0250</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム(一塩基性、無水)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>フローサイトメトリー調製物用</td></tr><tr><td>リボヌクレアーゼA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5000</td><td>フローサイトメトリー調製物用</td></tr><tr><td>パンチ付きコルクボーラー</td><td>American Scientific</td><td>2093-02</td><td>所望の組織</td></tr><tr>をサンプリングするため<td>鉗子</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>16-31</td><td>目的の組織をスマップリングするために</td></tr><tr><td>メス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-920B</td><td>目的の組織をスマップリングするため</td></tr><tr><td>106 &micro;メートルのステンレス鋼の網か同じ毛穴のサイズ</td><td>のニュージャージーの金網Co.</td>の他のseive<td></td><td>お問い合わせ会社</td></tr></tbody></table>

孤立した塊茎プロトプ ラストのフローサイトメトリーによる表現を測定

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

表現、以降分裂することがなく、細胞の核ゲノムの複製 DNA 量の増加と細胞を生成、細胞サイズの特殊化、開発および増加と関連付けられる。植物では、表現は特定の組織や器官の拡大を容易にしましょう。その中で炭水化物ストレージの機能を果たす上でかなり細胞拡張を経るポテト (ジャガイモ) の塊茎です。したがって、表現は、塊茎がこの豊富な炭素を収容することができる方法で重要な役割を果たす可能性があります。ただし、塊茎の粗核分離メソッドから生じる細胞の残骸、葉を効果的に使用することができる方法は、塊茎表現インデックス (EI) の推定をできなくなります。この記事では、異なった遺伝子型から得られる代表的な結果を実証して、塊茎組織を区分化プロトプ ラストの分離により塊茎表現を評価するための手法を示します。プロトコルの主要な制限は、プロトプ ラストの溶解後試料とサンプルの比較的短い寿命のために必要な時間と試薬コストです。プロトコルは技術の変化に敏感ですが、これらの大規模な特殊化した細胞から核分離の従来の方法で改善を表します。酵素、定着剤の使用、等のリサイクルなどのプロトコルへの改善のための可能性を提案します。

プロトプ ラストの生産
プロトプ ラストの生成は、ジャガイモの塊茎、一般的な形態は、図 1に表示されますから繰り返し流れ cytometry 結果を達成するために必要です。研究者は、特にイベントでトラブルシューティングが必要な高品質のプロトプ ラストは、FCP の添加する前に生産されていることを確認するがあります。プロトプ ラストの大半は最低限突起 (図 2) 球形、EI の相違の反射は、おそらくサイズが大きく異なる場合があります。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig2.jpg"> 図 2: 代表的な葉と塊茎プロトプ ラストで取得ステップ プロトコルの 4.4 。プロトプ ラストの分離が球対称プラズマ膜そのまま必要があります。(A ~ C) の葉と塊茎 (D, E) プロトプ ラストと表現のさまざまなレベルを示す可能性のある組織内でサイズの違いの大きさの違いに注意してください。葉プロトプ ラストには葉緑体が含まれている対しアミロプは塊茎プロトプ ラスト内で表示されます。スケール バー = 1,000 μ m.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57134/57134fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
流れの cytometry の結果の評価
実験の成否は、ピークと流れの cytometry ヒストグラムでの分離の幅から正確に測ることがあります。測定の表現、各ピークの核の相対的な豊かさの計算に必要なピークの単なる存在の有無は不十分であるそれらの間の有意義な境界を描画するあまりにも多くのノイズがある場合。図 3は、流れ cytometry 散布とヒストグラムの両方で発生する可能性の研究者の結果の変化を表示します。失敗したサンプルの潜在的な原因は、議論の中で掲載されています。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig3.jpg"> 図 3: 代表の結果そのままのプロトプ ラストの核のフローサイトメトリーから得られ、髄のサンプルが低下します。そのまま核 (A) 表示各劣化サンプル (B) のピーク表示シフト、幅広く、重なり合って拠点に対し適切なソフトウェアを用いた細胞の相対的な豊かさを定量化するピークの間を明確に分離します。そのまま (C) と劣化 (D) サンプルの散布図、ブラック ボックスはヒストグラムのピークの幅ヒストグラムとイベントのクラスタ リングのゲーティング原子力事象を反映することを示します。門の外のイベントは、破片、荒廃の核、またはその他の集計を示します。PI-H は、任意の単位で測定される蛍光の強度に対応します。テキスト内でサンプル劣化を防ぐためのトラブルシューティング方法を説明します。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57134/57134fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
組織の違いを表現
以前塊茎髄組織ある皮質組織16より表現の非常に高いレベルであることを報告した.確認し、我々 は優れた品種で 3 つの異なったティッシュの表現レベルを見たこの展開: 髄、ー実質、皮質、サンプルごとの 2,000 のゲート イベントで 3 通でレプリケートされます。我々 の結果確認髄組織が 1.79 と 1.12 の発生: の手段で大脳皮質組織よりも有意に大きい EI、セル当たりそれぞれ私たちの以前の観測 (p = 0.018;スチューデントの t 検定)。幾分意外にも、実質組織皮質と同様のプロファイルを実証され、また髄と大幅に異なる (意味 = 1.14; p = 0.013;スチューデントの t 検定)。図 4は、これらの結果をまとめたものです。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig4.jpg"> 図 4: 3 体内における優れた表現します。葉 (A)、塊茎皮質 (B)、(C) の実質と髄 (D) 組織のヒストグラムは、それらのヒストグラムから計算された EI 値と共に表示されます。各ピークを構成する核の相対的な豊かさの違いは容易に明らかに、特に間葉と塊茎の組織です。各ピークの C 値も表示されます。PI-H は、任意の単位で測定される蛍光の強度に対応します。電子印は有意差に塊茎組織の EI の比較が表示されることを意味 (p &lt; 0.05) とエラーバーは標準偏差を示します。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57134/57134fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
塊茎の大きさおよび倍数性の影響
我々 は、特定の遺伝子型の異なるサイズが似たような成熟塊茎が表示されませんでした EI16に対応する違いを報告しました。この結果を確認するだけでなく、倍数性と表現との関係を評価する目的とします。この実験では、3 つの異なる遺伝子型から実質組織の 3 つの複製を使用しました: 品種スーペリアー (4 x)、VT_SUP_19 (2 x) 4 x 2 倍確認である棘受粉17、および VT_SUP_19 によって優れたから抽出されます、確認18 VT_SUP_19 に同質。大きい (90-130 g) と小さいのための複製のセットを含めました (&lt; 35 g) 塊茎収量優れた他の 2 つの品種の塊茎が 90-130 g。塊茎がすべて温室効果すなわち完全な成熟で育てられた植物から採取した植物のトップは senesced。VT_SUP_19 とその前駆スーペリアーの大きな違いを見ました (p = 0.04);しかし、VT_SUP_19 と VT_SUP_19 の間に有意差はありませんでした 4 x (p = 0.69)。これは、ゲノムの低減によるマスクとして表現する可能性が高い遺伝の部品がある間ないによって決まるです倍数、少なくともこの背景を示します。最後に、もう一度は認められなかった大小さまざまな品種間に有意差優れた塊茎図 5に示されているように。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig5.jpg"> 図 5: 品種の優れた (VT_Sup_19) 二倍体と四倍体の塊茎の 2 つのサイズで表現 (VT_Sup_19 4 x) デリバティブ。バーチャートは小型の意味 (&lt; 35 g) 確認 VT_SUP_19 と同質の 2 倍確認 VT_SUP_19 の大きい (90-130 g) 塊茎と同様、大きい (90-130 g) 品種の優れた塊茎および 4 x。有意差 (p &lt; 0.05) 接続の手紙レポートで示されます。エラーバーは標準偏差を表しています。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57134/57134fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

記載プロトコルは、じゃがいも (ジャガイモ) の塊茎内の表現を測定するための方法です。ノイズや下流フローサイトメトリーによる解析の残骸を減らすため原形質分離と原形質体の抽出手順が含まれています。

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

この実験の全体的な目標は、ジャガイモ塊茎内の内重複のレベルを評価することです。この方法は、塊茎組織が内重複を受ける発達段階など、ジャガイモ塊茎の形態に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、一般的なフローサイトメトリー調製物と比較して、はるかに明確な結果が得られることです。手順を実演するのはパーカー・レインビアです。研究室の大学院生です。テキストプロトコルに従って溶液と緩衝液を調製した後、ジャガイモ塊茎を71%エタノールに少なくとも5分間浸して表面滅菌します。エタノールから植物材料を取り除き、風乾させます。各サンプルに滅菌済みの50ミリリットルのコニカルチューブを準備してラベル付けし、15ミリリットルのフィルター滅菌プラズマ分解インキュベーション溶液またはPISをそれぞれに分注します。滅菌されたメスまたはコルク穴サンプルを使用して、組織を滅菌したいという願望の約1立方センチメートル。滅菌メスを使用して、組織を約3立方ミリメートルの小片に粗く切り刻みます。そして、組織をPISを含む円錐形のチューブに移します。次に、組織を摂氏4度で一晩インキュベートします。ジャガイモのプロトプラストを生成するには、まず、0.71モルのマンニトール、3ミリモルの塩化カルシウム、1ミリモルのリン酸一カリウムを含む適切な量の酵素溶液またはESを調製し、ろ過することから始めます。塩化マグネシウム1ミリモル、4%オノヅカR-10セルラーゼ、0.8%マセロチームR-10、1%ヘミセルラーゼ、10ミリモルMES緩衝液、pH5.8。血清ピペットを使用して、チューブ内のサンプルからPISを吸引します。各サンプルに10ミリリットルのESを加え、チューブを2〜3回反転させます。その後、サンプルを摂氏29%、180RPMで一晩インキュベートします。3日目に、プロトプラストを採取して洗浄するために、シェーカーからサンプルを取り出し、約10分間沈殿させます。血清ピペットを使用して、消化された組織を避けながら、できるだけ多くのES溶液を吸引します。次に、マイクロピペットを使用し、チューブを斜めに保持しながら、消化された組織を避けて、残っているES溶液を再度取り除きます。核への損傷を避けるために、プロトプラスト洗浄液をできるだけ多く除去することが重要です。チューブを斜めに保持すると、プロトプラストを残しながら溶液を除去するのに役立つ場合があります。各サンプルに15ミリリットルのPWSを追加します。そして、チューブを2〜3回静かに反転させます。プロトプラストが10分間落ち着くのを待ちます。次に、血清学的ピペットを使用してPWSを取り外します。そして、残っている液体を取り除くためのマイクロピペット。サンプルを氷上に保持しながら、各チューブに1.5ミリリットルの氷冷FCBを追加します。各サンプルを短時間振とうまたはボルテックスして、凝集した組織を分解します。FCBが細胞に完全に浸透して核を放出できるように、塊茎組織の塊を分解することが重要です。このステップからコントロールを追加する場合は、かみそりの刃を使用して、1.5ミリリットルの氷冷FCBで小さな葉を細かく刻みます。対照サンプルは、実験サンプルと同じploityであるべきであり、できれば同じ遺伝子型であるべきです。先端を切り落とし、106マイクロメートルの金属メッシュを底まで溶かした1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブを2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに挿入します。次に、1ミリリットルのFCB組織懸濁液をフィルターに通します。各サンプルに250マイクロリットルのRNA溶液を加えます。次に、チューブを反転させ、室温で30分間インキュベートします。各サンプルに、事前に調製したヨウ化プロピジウムまたはPI溶液125マイクロリットルを加えます。チューブを反転させ、氷上で30分間インキュベートします。できるだけ早くサンプルを使用し、2時間以内に2つの劣化を避けてください。前方散乱光と側面散乱光、およびPI対側面散乱の対数スケールを使用して、2つのドットプロットを作成します。また、PIをx軸にしたヒストグラムを作成します。対数スケールは、核の蛍光が大きく異なる可能性があるため、すべてのイベントがスケール内にあることを確認するために必要です。サンプルの遺伝子型からin vitro葉組織などの既知のコントロールサンプルのチューブをロードします。また、すべてのイベントがスケールどおりになるように電圧を調整します。コントロールサンプルの2Cピークのチャンネルをメモします。実験サンプルの2Cピークは同じ場所にあるはずです。実験用の塊茎サンプルをロードし、すべてのイベントがスケールに沿っていることを再度確認します。調整が必要な場合は、制御サンプルの電圧調整を繰り返して、2Cピークのチャンネルを特定します。側方散乱光対PIプロットを使用して、プロトプラスト核を手動でゲートします。次に、PI ヒストグラムをゲート型プロトプラスト核領域のみを表示するように設定します。各サンプルから必要な数のイベントを収集します。研究者は、フローサイトメトリーに10, 000のゲートイベントを使用することがよくあります。ただし、ここでは塊茎プロトプラストサンプルに2000イベントが使用され、より多くのサンプルと低濃度のサンプルに対応します。プロトプラストの作製は、ジャガイモ塊茎から再現性のあるフローサイトメトリーの結果を得るために必要です。その一般的な形態がここに表示されます。髄と髄質周囲実質の分離は、黒い線で示されています。実質を皮質から分離する血管輪は、黒い矢印で示されています。単離されたプロトプラストは、原形質膜が損なわれていない球形で対称的である必要があります。葉と塊茎のプロトプラストのサイズの違い、および組織内のサイズの違いは、重複の異なるレベルを示している可能性があることに注意してください。この図は、フローサイトメトリーの散布図とヒストグラムの両方で発生する可能性のある結果のばらつきを示しています。インタクトな核は、細胞の相対的な存在量を定量するためにピーク間がきれいに分離されていますが、ピークに統合されたサンプルは、幅が広く重なり合っている塩基がシフトしています。対応する散布図では、ブラックボックスはヒストグラムの核イベントゲーティングを示し、イベントのクラスタリングはヒストグラムのピークの幅に反映されます。この実験では、重複内濃度(EI)を分析し、髄組織が皮質組織よりも高いEIを示すという以前の結果を確認しています。驚くべきことに、実質組織のプロファイルは皮質に似ており、髄組織とも大きく異なっていました。この手順を試行する際には、最初の2回のインキュベーションでサンプルの無菌性を維持すること、およびプロトプラストが溶解された後もサンプルをできるだけ氷上に保持することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、どの遺伝子が塊茎の重複内重複レベルに影響を与えるかなどの追加の質問に答えるために、遺伝子操作などの他の方法を実行できます。このビデオを見れば、ジャガイモ塊茎からプロトプラストを抽出し、フローサイトメトリーでエンドリデュープレベルを調査するための準備方法について十分に理解できるはずです。ヨウ化プロピジウムの取り扱いは非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には常に適切なPPEなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。

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JoVE Journal

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孤立した塊茎プロトプラストのフローサイトメトリーによる表現を測定

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