交配の適応は哺乳類細胞プロテオミクスのクロマチン関連タンパク質の捕捉します。

この方法は、非コード領域の疾患関連配列変異がタンパク質結合を変化させることによって遺伝子発現と制御にどのように影響するかなど、ゲノム制御を理解する上で重要な質問に答えるのに役立ち、それらのタンパク質を特定するのに役立ちます。この技術の主な利点は、細胞や組織の遺伝子操作や抗体を必要とせず、その遺伝子座でDNAと相互作用する可能性のあるDNA結合タンパク質の事前知識がないことです。この手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるDanu Perumallaです。

テキストプロトコールに従ってオリゴヌクレオチドを設計した後、6ミリリットルのRPMI 1640培地を含むT25フラスコで、第5リンパ芽球様細胞または他の細胞株を2〜5回10回プレートし、1%Pen連鎖球菌、2ミル以上のL-グルタミン、および5%FBSを補充します。細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%でインキュベートします。血球計算盤または自動セルカウンターを使用して、細胞密度を測定します。

細胞が10の10倍から6ミリリットルの細胞に達する前に、Gの100倍で5分間スピンダウンし、このビデオで前述したRPMI 1640培地25ミリリットルのT75フラスコに移します。細胞密度が10の1倍から1ミリリットルあたり6細胞に達するまで細胞を増殖させ、次いで細胞を同じ培地の38ミリリットルのT150フラスコに移し、さらに2日間増殖させる。次に、細胞をGの100倍で5分間スピンダウンし、10ミリリットルのRPMI 1640培地に再懸濁します。

次に、懸濁液を500ミリリットルの培地を含む1850平方センチメートルのローラーボトルに注ぎ、一定の回転を除いて、以前と同じ条件下で細胞をインキュベートします。所望の細胞数に達したら、培養物をGの100倍で5分間スピンダウンし、細胞を36ミリリットルのRPMI 1640培地に再懸濁します。次に、細胞懸濁液を50ミリリットルの円錐管に移し、細胞計数とDNA抽出のための小さなアリコートを取り除きます。

細胞を架橋するには、1ミリリットルの37%ホルムアルデヒドを加えて最終濃度を1%にし、その後、室温で10〜30RPMで細胞を10分間インキュベートします。2.5モルのグリシン溶液を2ミリリットル加えて、最終濃度を125ミリモルにすることにより、架橋反応を急冷します。次に、細胞を回転させて5分間インキュベートします。

遠心分離により細胞をペレット化した後、氷冷した1X PBSを使用して細胞を2回洗浄します。細胞の溶解とシアーリングを続けるか、ペレットを5ミリリットルの細胞溶解バッファーに再懸濁し、懸濁液を液体窒素で一滴ずつ急速凍結します。次に、サンプルを摂氏マイナス80度で保存します。

溶解およびシアリングを行うには、ペレットを20ミリリットルの細胞溶解緩衝液に再懸濁します。細胞をGの400倍、摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を捨て、プロテアーゼ阻害剤を含む6ミリリットルの核溶解バッファーに細胞を再懸濁します。

超音波処理の準備として、サンプルを6〜8本のマイクロフュージチューブに均等に分割します。サンプルを氷上またはコールドラックに置き、マイクロチップ付きのソニケーターを使用して、5回の20秒コンスタントバーストで65%の振幅でソニケーションし、懸濁液をパルス間で少なくとも40秒間冷却します。細胞をGの12,000倍、摂氏4度で10分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移し、ペレットを廃棄します。

蛍光測定法を使用して総回収率を推定した後、サンプルをスナップフリーズします。テキストプロトコルに従ってハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液を調製した後、1, 200マイクロリットルの1Xハイブリダイゼーション緩衝液を使用して、600マイクロリットルのビーズを3回洗浄します。次に、1, 200マイクロリットルの2Xハイブリダイゼーションバッファーを使用してビーズを再懸濁します。

1.5ミリリットルの微量遠心チューブに、600マイクロリットルのサンプル、120マイクロリットルの2Xハイブリダイゼーションバッファーに懸濁した洗浄ビーズ、480マイクロリットルの2Xハイブリダイゼーションバッファーを加えます。チューブを摂氏31度、30〜60RPMで10分間インキュベートします。次に、ビーズが固定されるまでチューブを磁石に置き、サンプルを新しいチューブに移してからビーズを廃棄します。

捕捉オリゴヌクレオチドを1マイクロリットルあたり10ピコモルの作業溶液に再懸濁し、この溶液を各チューブに4マイクロリットル加えます。チューブを摂氏42度、30〜60 RPMで40分間インキュベートします。インキュベーション中は、必要なビーズを脇に置き、前回と同様にビーズを3回洗浄しますが、今回は1Xハイブリダイゼーションバッファーを使用してビーズを再懸濁します。

洗浄したビーズをチューブに加え、サンプルを室温で30〜60RPMで30分間インキュベートします。チューブを磁石に置き、ビーズが固定されたら上清を取り除きます。ビーズを洗浄した後、40マイクロリットルの分子グレードの水を加えてサンプルを溶出し、チューブを摂氏94度で5分間インキュベートします。

チューブを磁石の上に置き、溶液が透明になるまで数分待ってから、上清を新しいチューブに移し、ビーズを捨てます。サンプルを摂氏マイナス80度で保存するか、テキストプロトコルに従ってプロテオミクス分析に進みます。捕捉収率を評価するには、分子グレードの水を使用して溶出液のアリコートを1〜10に希釈します。

ビデオの前半で撮影したアリコートからDNAを抽出した後、DNAサンプルと分子グレードの水を使用して、1〜10回の希釈を5回連続して行う標準曲線を調製します。プライマーとプローブを添加したqPCRマスターミックスを調製し、反応の各ウェルに適切な量を分注します。各ウェルに、希釈したサンプル、標準曲線、または分子グレードの水のいずれかを5マイクロリットル加えて、テンプレートコントロールなしとして機能します。

プレートを密封し、Gの100倍で1分間回転させます。次に、テキストプロトコルにあるパラメーターを使用して、qPCRシステムでサンプルを実行します。最後に、標準曲線を使用して収量を評価し、スクランブル捕獲を使用して捕獲特異性を評価します。

ここに示されているのは、オリゴヌクレオチドの滴定を使用したハイブリダイゼーションキャプチャです。オリゴヌクレオチドの数は徐々に増加しますが、総濃度は一定に保たれます。この実験は、最適なハイブリダイゼーション効率を達成するために必要なオリゴヌクレオチドの数を決定するのに役立ちます。

また、特定のオリゴヌクレオチドセット間の明らかな有害なハイブリダイゼーション相互作用、および特異性の低いオリゴが存在するかどうか、その結果、バックグラウンドが高くなります。架橋クロマチン中のフラグメントの大部分は、ハイブリダイゼーション捕捉に適していません。ハイブリダイゼーションキャプチャーが正常に実行された場合、同じクロマチン材料のその後のキャプチャ実験で、異なるキャプチャーオリゴヌクレオチドのセットを使用すると、新鮮なクロマチンを使用した場合と同等の収量が得られます。

しかし、最初の実験で得られた元のオリゴと残ったクロマチンを用いた2回目の捕捉実験では、ハイブリダイゼーションに適した物質のほとんどが最初の実験で捕捉されていた場合、収率は約90%減少します。この図は、異なる染色体標的領域のハイブリダイゼーションキャプチャを示しており、各領域は他の領域のネガティブコントロールとして機能します。スクランブルされたシーケンスは、真のネガティブコントロールとしても機能します。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば、2日で完了できます。この手順を試行する際は、まず捕捉オリゴヌクレオチドを試験し、目的の領域がハイブリダイゼーション捕捉に適していることを確認することを忘れないでください。この手順に続いて、クロマチン免疫沈降などの他の方法を実行して、同定されたDNA相互作用タンパク質がゲノムの他のどこに結合するかなど、追加の質問に答えることができます。

このビデオを見れば、局所的なタンパク質相互作用のde novo同定を目的として、関心のあるゲノム領域を濃縮するためのHyCCAPPの実行方法について十分に理解できるはずです。