Name: 交配の適応は哺乳類細胞プロテオミクスのクロマチン関連タンパク質の捕捉します。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 学ぶHyCCAPP法で哺乳類細胞のクロマチン関連タンパク質を捕捉し、ゲノム制御と疾患関連変異体の影響を解明します。遺伝子操作や抗体を必要としない革新的プロテオミクス手法です。

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この作品は、NIH の助成金 P50HG004952 とミズーリ州に R01GM109099 によって支持されました。

1. キャプチャ オリゴヌクレオチド設計
<ol><li>
対象地域/s の交配キャプチャ中に使用するオリゴヌクレオチドのパネルをデザインします。
	<ol>
<li>最低ではなく対象地域ごとに 4-8 オリゴヌクレオチドをデザイン、ターゲットにターゲット領域の各終わりに少なくとも 1 つのオリゴヌクレオチドのデザインを目指してください。</li>
		<li>ターゲット シーケンスが長い場合 (> 500 塩基対)、対象の地域全体にわたって効果的な濃縮クロマチンを保証するためにできるだけ広げてとしてオリゴヌクレオチドをデザインします。 注: 我々 は 4-8 オリゴヌクレオチドと最適なキャプチャを観察しました。詳細オリゴヌクレオチドでうまく処理することができます、にもかかわらずあまりにも多くのオリゴヌクレオチドを使用する場合、濃縮収量の減少を観察することも珍しくはないです。</li>
	</ol>
</li>
	<li>同様の溶融温度とオリゴヌクレオチドを設計し、彼らはありません強力なヘアピンを形作るまた (交配は 42 ᵒC で実施される考慮して) 強い相互作用があるかどうかを確認します。 注: 足掛かり溶出 (4.12.3) を選択する場合追加外部 8 塩基は、オリゴヌクレオチドに追加する必要があり、溶出17時 'リリース' の相補的なオリゴヌクレオチドが必要になります。オリゴヌクレオチドを分析し、いくつかの商用ソフトウェア ツールを使用できます。25 mers は良い結果を示しているが、ゲノムサイズとシーケンスによってキャプチャ オリゴヌクレオチドは 20-80 拠点間どこか含めることができます。通常は、キャプチャ オリゴヌクレオチドは 62 ᵒC に近い融点がの長さによって変わることができます。一貫性のある溶融温度および/またはキャプチャ ミックス全体のオリゴヌクレオチドの長さは、濃縮で不要な先入観を避けるため助けることができます。</li>
	<li>3' 末端をビオチン基 (できればキャプチャ シーケンスからスペーサーで区切られた) キャプチャ オリゴヌクレオチドをデザインします。</li>
</ol>2. 細胞培養
<ol><li>
37 ᵒC で 5% CO2(ここに示す GM12878) などヒトリンパ芽球細胞または 1% ペニシリン-ストレプトマイシン、2 mM L グルタミン 5% ウシ胎児血清 (FBS) と添加 RPMI 1640 メディアの他の細胞株に成長します。
	<ol>
<li>Seed 初期 RPMI 1640 メディアの 2.1 での 6 mL で T-25 フラスコの因数 (2-5 x 10 の5セル) を凍結します。</li>
		<li>細胞の密度と生存率を監視します。<ol>
<li>代表的な細胞の分注とトリパンなど適切な染料で青、それらを染色します。</li>
			<li>診断または自動化された細胞カウンターを使用して細胞密度を測定します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>セル 1 x 106セル/ml の濃度に達すると、前に 5 分の 100 x g でセルをスピンダウンし、セルを RPMI 1640 メディアの 2.1 での 25 ml T-75 フラスコに転送します。細胞密度に近づく 1 x 106セル/mL までセルを育てなさい。</li>
		<li>RPMI 1640 メディア (2.1) の 38 ml T-150 フラスコにセルを転送し、さらに 2 日間のセルの成長します。 注: ヒトリンパ芽球様細胞は懸濁液で育ちます。ヒトリンパ芽球様細胞の成長のための一般的なガイドラインでは、0.2-1 x 106セル/mL の間保たれる細胞密度をお勧めします。この技術に必要な材料の大きい量のため議定書意図的ものが一般的に使用されるを超えて細胞密度に細胞を成長に書き込まれます。細胞成長のプロトコルを修正し、使用する細胞の種類によってリーダーが適応できます。</li>
		<li>5 分間 100 x g でセルをスピンダウン、RPMI 1640 メディア (2.1) の 10 mL の細胞を再懸濁します、メディアの 500 mL を含む 850 cm2ローラー ボトルに懸濁液を注ぐ。前に、と同じ条件の下のセルを孵化させなさいが、この時点で一定回転 (~0.5 rpm) の使用を開始します。</li>
		<li>細胞の成長を監視し、(通常 3-4 日おき) を必要に応じてメディアを変更します。2 x 106セル/mL (合計 1 x 10 の9セル) に可能な限り近い密度に成長する細胞をしましょう。</li>
		<li>目的のセル数に達すると、100 × g で 5 分でダウン セルを回してセルを収穫し、RPMI 1640 メディア (2.1) の 36 mL の細胞を再懸濁します。細胞懸濁液を 50 mL の円錐管に転送します。細胞数および DNA の抽出のための小さい因数を取る。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
最終濃度 1% に到達する 37% ホルムアルデヒドの 1 mL を追加することによって架橋。 注意: ホルムアルデヒドは、発がん性物質発煙のフードで処理する必要があります。<ol>
<li>回転セルを孵化させなさい (~ 30-60 rpm) 室温 (RT) で 10 分。</li>
		<li>125 mM の最終的な集中のための 2.5 M グリシン溶液 2 mL を追加することによって架橋反応を抑制します。</li>
		<li>回転セルを孵化させなさい (~ 30-60 rpm) ルートで 5 分間 5 分間 100 × g で遠心分離によって細胞をペレットし、氷冷 1x PBS で 2 回細胞を洗浄します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>次のステップまたはセル換散バッファー (5 mM Hepes、85 mM KCl、0.5 %igepal, プロテアーゼ阻害薬 (PI)) 5 mL にペレットを再懸濁しますスナップ-凍結懸濁液液体窒素で一滴ずつを継続します。-80 ᵒC でサンプルを格納します。 注: 準備 > Igepal と PI なしセル換散バッファーの 25 mL を使用する準備ができたら、これらの試薬の新鮮なを追加。Igepal と PI を追加したら、セル換散バッファーの長期保管を避けてください。4 ᵒC で 3 ヵ月のセル換散バッファーを格納します。Igepal は、非イオン性、非変化の洗剤です。NP 40 は潜在的代わりに Igepal を使用できますが、我々 はこのコンテキストでそれを使用していないサンプルを最終的に DNA 結合蛋白質を特徴付けるための質量分析法で分析するとき、NP 40 は推奨されていませんように。</li>
</ol>3. 溶解とせん断
<ol><li>準備 > 15 mL の核溶解バッファー (10 mM EDTA、50 mM Tris pH 8.0、1 %sds、PI)。 注: 追加 PI 新鮮なただ金額が使用されます。PI を追加したら核の換散バッファーの長期保管を避けてください。核の換散バッファーは、1 ヶ月常温保存できます。</li>
	<li>セル換散バッファー (Igepal と PI を含む) 20 mL にペレットを再懸濁します。一度融解したものを氷の上に解凍し、ミックスのペレットにしましょう。サンプルを氷の上にさらに 10 分間座ってみましょう。400 の x g で 5 分の 4 の ᵒC で細胞を遠心します。</li>
	<li>上澄みを廃棄し、PI と核換散バッファーの 6 mL の細胞を再懸濁します (細胞懸濁液を形成しない場合ボリュームが増加することができます)。</li>
	<li>
超音波処理の準備で、~ 6-8 で均等にサンプルを分割 (各チューブの 600 に 1,000 μ L) の microfuge の管。
	<ol>
<li>氷や冷たいラック上サンプルを配置し、陰極と、超音波発生装置を使用してサンプルを超音波照射します。5 x 20 s 一定バースト、サスペンションが少なくとも 40 の冷却を許可すると 65% 振幅を使用するパルス間の s。 注: ボリュームを増やす場合 > 10 mL のサンプルでは、セルを冷却ガラスあたりを代わりに使用することができます。ますます長いバーストが必要になりますし。Sonicators は大きく異なります。条件は、リーダーによって最適化する必要があります。他の超音波処理の選択肢を同様に使用できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>4 ᵒC で 10 分間 12,000 × g で細胞を遠心、上清を新しいチューブに転送し、ペレットを破棄します。</li>
	<li>蛍光法を用いた総復旧時を推定します。</li>
	<li>次のステップまたはスナップ凍結し-80 ᵒC でサンプルを保存し続けます。</li>
	<li>オプション: 0.3 M の NaCl の 67 ᵒC の一夜インキュベーションそれで割り切れる、逆クロスを取る。DNA をきれいにしバイオアナライザー フラグメントの長さを決定するためにそれを実行します。フラグメントのバルクは、500、1,000 bp の間でなければなりません。 注: この時点で停止し、-80 ᵒC でサンプルを保存する [ok] です。</li>
</ol>4. 交配キャプチャ
<ol><li>交配 (Hyb) バッファー x 2 の 500 mL を準備 (200 mM MES の 2 M の NaCl、40 ミリメートルの EDTA、0.02% Tween 20) と 500 mL の洗浄バッファー (200 mM NaCl、0.2% SDS 50 mM Tris pH 8)。Hyb と保存の洗浄バッファー 4 ᵒC で室内の温度、それぞれ、3 ヶ月間。2 x Hyb バッファーの半分を使用して交配バッファー × 1 を準備します。また 4 ᵒC で 3 ヶ月間保管してください。 注: 前の手順で作成されたサンプルの体積の 2 倍になります交配キャプチャの総量 (前述のこれまでのところ、試料の量は約 6 mL になるし、こうして合計交配ボリューム 12 mL になる)。</li>
	<li>合計交配キャプチャ ボリューム (この場合は 600 μ L) の 5% と等しいビーズ置いておきます。次の手順でビーズを使用する適切な適当な磁石です。</li>
	<li>X Hyb バッファー 2 倍ビーズのボリューム (1200 μ L) を使用して 1 にビードを 3 回洗浄しなさい。Hyb バッファー x 2 の 1,200 μ L でビーズを再懸濁します。ソリューションを消去するまで、磁石にチューブを配置し、バッファーを削除します。</li>
	<li>最大 700 μ 管ごとにサンプルの 1.5 mL の microfuge の管の前清算反応を実行します。十分なビーズ (5%) と 2 倍 (600 μ L のサンプル、Hyb バッファー x 2 で再停止される洗浄ビーズの 120 μ L 480 μ Hyb バッファー x 2 と 10 の管) x 1 Hyb バッファーをうすめる Hyb バッファーを追加します。最後の回転端 31 ᵒC で 10 分間インキュベートそれら (~ 30-60 rpm)。</li>
	<li>ビーズに固定化し、新しいチューブにサンプルを転送するまで、磁石にチューブを置きます。ビーズを破棄します。 注: このポイントから低バインド チューブが推奨されます。</li>
	<li>10 pmol/μ L の実用的なソリューションをキャプチャ オリゴヌクレオチドを再懸濁します、各チューブにこのソリューションの 4 μ L を追加します。 注: さまざまな地域はお互いのためコントロールとして機能することができますが、真陰性対照としてスクランブルそのシーケンスでキャプチャ オリゴヌクレオチドを含めることをお勧めです。</li>
	<li>最後の回転で終わりと 42 ᵒC で 40 分間チューブを孵化させなさい (~ 30-60 rpm)。</li>
	<li>、インキュベーション中に必要なビーズ (0.3 μ L/キャプチャ オリゴヌクレオチドの pmol) 置いておきます。4.3、手順の説明に従って、ビーズを 3 回洗浄が、Hyb バッファー x 1 の細胞を再懸濁します。</li>
	<li>サンプルに洗浄のビーズを追加し、最後の回転で終わりと RT で 30 分のサンプルをインキュベート (~ 30-60 rpm)。磁石にチューブを置き、ビーズが固定化されて後、上清を削除します。</li>
	<li>
ビーズを洗浄
	<ol>
<li>1.2 mL の洗浄バッファーを追加し、最後の回転で終了 5 分のサンプルをインキュベート (~ 30-60 rpm) 磁石と待機した場所管でソリューションまでの分のカップルをクリアします。バッファーを削除し、この手順を繰り返します。</li>
		<li>1.2 mL の洗浄バッファーを追加し、最後の回転で終わりで 1 h インキュベート (30 ~ 60 rpm) 室温磁石に管を配置し、ソリューション クリアまで分のカップルを待ちます。バッファーを削除し、2 回目から 30 分インキュベーション時間を短縮この手順を繰り返します。</li>
		<li>洗浄バッファーの 200 μ L を追加し、最後の回転で終わり 15 分インキュベート (~ 30-60 rpm) 31 ᵒC で。磁石のチューブ、ソリューション クリアまで幾つかの分を待ちます。バッファーを削除します。</li>
		<li>200 μ L の PBS を追加し、最後の回転で終了 5 分インキュベート (~ 30-60 rpm) 室温磁石に管を配置し、ソリューション クリアまで分のカップルを待ちます。バッファーを削除し、この手順を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
単純な溶出
	<ol>
<li>ビーズに分子グレードの水の 40 μ L を追加し、5 分の 94 の ᵒC でそれを孵化させなさい。</li>
		<li>磁石のチューブ、ソリューションをクリアするまでに数分を待ちます。</li>
		<li>新しいチューブに上清を移します。ビーズを破棄します。</li>
		<li>プロテオーム解析に進むか-80 ᵒC でサンプルを格納します。 注: この種類の溶出作品後 qPCR の分析といくつかのプロテオミクスの測定は、他のインスタンスでは収量「クリーナー」波は以下 2 つの代替アプローチ。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DNase 溶出します。
	<ol>
<li>各チューブに DNase バッファー x 1 と DNase の 2 U の 40 μ L を追加します。</li>
		<li>37 ᵒC で 15 分間チューブを孵化させなさい。</li>
		<li>磁石にチューブを置き、ソリューションをクリアするまでの分のカップルを待ちます。</li>
		<li>ビーズから溶出サンプルを削除し、新しい低バインド チューブのサンプルを配置します。</li>
		<li>酵素を不活性化し、プロテオーム解析に進む 7 分 94 ᵒC でチューブを孵化させなさい。 注: プロテオーム解析との干渉が発生した場合は、濃度 DNase を使用できます。DNase 処理は完全にサンプルの DNA の材料を破壊するので、この溶出メソッドを使用する場合、qPCR によるキャプチャ濃縮を計算することはできません。</li>
		<li>プロテオーム解析に進むか-80 ᵒC でサンプルを格納します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
足掛かり溶出17。 注: この方法は長いオリゴヌクレオチドのため推奨されません (> 40 拠点)。このメソッドは、ゲノム配列と重複しない追加の 8 拠点を含むキャプチャ オリゴヌクレオチドおよびキャプチャ オリゴヌクレオチドからターゲットを転置するために相補的なリリース オリゴヌクレオチドの必要があります。<ol>
<li>SSC バッファーの 40 μ L でリリース オリゴヌクレオチドの 2 nanomoles を希釈します。</li>
		<li>室温に 20 分間インキュベートします。</li>
		<li>磁石のチューブ、ソリューションをクリアするまでに数分を待ちます。</li>
		<li>ビーズからソリューションを削除します。</li>
		<li>プロテオーム解析に進むか-80 ᵒC でサンプルを格納します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5 興味のターゲットをキャプチャ領域のためのプライマーと qPCR による降伏をキャプチャの評価
<ol><li>プライマーとプローブ ターゲット領域の設計、適切なソフトウェアまたはオンラインのツールを使用します。 注意: この実験では、 DUSP3とDUSP5のプロモーター領域が対象だった。プライマーとプローブは、次のとおりです。DUSP3: プライマー 1 - GTG TTT AGG TTC CCT GAT CC、プライマー 2 - CGG AAT GTC TGC CTT CG、FAM ラベル プローブ - TCC ATG CCC GAA TTG TGA CGT CGG;DUSP5: プライマー 1 - TGA GAA AGC CCT GAT GTG TC、プライマー 2 - GCC TTC AGA AAC CCC AAA AG、FAM ラベル プローブ TGC ATT タグ AGC AGC CAG ATG AGG TT。</li>
	<li>(以上 10 μ L)、溶出液の因数を取り出して希釈 1:10 分子グレード H2o.</li>
	<li>2.1.7 の手順で撮影した因数の 1 つの DNA を抽出し、その DNA のサンプルを使用して、5 つシリアル 1:10 分子の希釈グレード H2o. により標準曲線を作る</li>
	<li>QPCR マスター ミックス (さまざまな商業代わり) を準備のプライマーとプローブを追加して、適切な量 (15 μ L の 20 μ L 反応を実行している場合) を各ウェルに分配します。</li>
	<li>いずれかの追加 5 μ L:) 希釈サンプル、b) の標準カーブまたは c) 分子グレード H2O (テンプレートなしのコントロールとなる) を各ウェルに。</li>
	<li>プレート シールし、1 分 100 × g で遠心分離します。</li>
	<li>次のパラメーターと qPCR システムで実行: 95 ᵒC で 5 分は続いて 40 サイクル 95 ᵒC の 20 s、20 59 ᵒC s と 25 の 72 ᵒC s。</li>
	<li>キャプチャの特異性を評価するためにロバの利回りとスクランブルのキャプチャに標準曲線を使用します。</li>
</ol>

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</ol>

明らかに利害の対立がないです。

ここで説明した HyCCAPP メソッドには、とらえどころのないまま、ある DNA 相互作用を明らかにする強力なアプローチは、多くのユニークな機能があります。プロセスの性質は、HyCCAPP に異なった有機体とゲノムの領域で動作する柔軟性を与えます。メソッドは、しかし、いくつかの制限があると見なす。
HyCCAPP は、適用される初代培養細胞、細胞培養システム、またはも組織サンプルの場合は、任意のセルの変更を回避する方法です。そのため、ただし、それは架橋、プロテオーム解析の感度を低減、したがって大量入力を必要とするサンプルを必要です。CRISPR と周囲の架橋反応12,13,14,18なしで機能することができます蛋白質のビオチン化に依存するアプローチが浮上しています。プラスミッド挿入制約を表さないが、細胞培養システムでのみ使用で...

過去 10 年間に、シーケンス技術、大量のサンプルと驚異的な解像度にゲノムの広い範囲の研究の劇的な改善を見ています。百科事典の DNA 要素 (エンコード) コンソーシアムは、大規模な多施設共同努力、国立ヒトゲノム研究所国立衛生研究の主導がどのように個々 の転写因子に洞察力を提供しています。その他の規制の蛋白質にバインドし、ゲノムとの対話します。初期の努力は、100 以上知られている DNA 結合蛋白質1のクロマチン免疫沈降 (チップ) により評価した特定の DNA 蛋白質の相互作用を特徴付けられます。DNase フット プリント2ホルムアルデヒド規制要素 (放任)3のアシストの分離は、タンパク質ではなく、明白な制限を操作するゲノムの特定の領域を検索する使用されているなどの代替方法をこれらの実験的アプローチは、相互作用の蛋白質を識別しません。過去年にわたって広範な努力にもかかわらず技術浮上しているない、クロマチンと同定蛋白質 DNA 相互作用の包括的な評価とクロマチン関連タンパク質の定量が効率的にできます。
この必要性に対処するため、我々 は Hybridization Capture of Chromatin-Associated タンパク質のプロテオミクス (HyCCAPP) と呼ばれる手法を開発しました。5,6、アプローチ酵母4,開発当初シーケンス固有の交配のキャプチャを使用して (バインドされたタンパク質) と利子の架橋クロマチン領域を分離します。タンパク質-DNA 複合体の分離後、興味のシーケンスにバインドされている蛋白質のセットを特徴付ける質量分析法などの方法を使用できます。したがって、その抗体に依存しない意味での新規 DNA 蛋白質の相互作用を明らかにする非バイアス アプローチは見つけられるかもしれない蛋白質について完全に依存しないものとしては、HyCCAPP を検討できます。明らかに小説 DNA と相互作用するタンパク質の7、しかし、最もチップのようなメソッド8,9,10, プラスミッド挿入11,12に依存することができる他の方法があります。 13,14、または高いコピー番号15の地域。対照的に、HyCCAPP はマルチとシングル コピー領域に適用できる、地域の蛋白質についての事前情報は必要ありません。さらに、上記が貴重な機能、特に DNA とタンパク質の架橋反応、HyCCAPP の独特の機能はシングル コピー領域に適用できることの必要性を回避変更セル、前述のメソッドのいくつかとせず推定結合蛋白質、または入手可能な抗体に関する知識。
この時点で、HyCCAPP 酵母4,5,6、様々 なゲノム領域の解析に主に適用されている、アルファ衛星 DNA、リピート領域の蛋白質 DNA 相互作用の分析に使用された最近人間のゲノムの16。私たちの継続的な作業の一環として、我々 は酵母クロマチンひと細胞の分析を適用する、シングル コピー対象を選択的に捕獲を可能にする変更されたプロトコルを紹介するために開発の交配キャプチャ方法を適応しています。酵母における私たちの初期の研究に類似した効率と人間のゲノムにある地域。この新しい最適化されたプロトコルは今、適応および質量分析などの分析手法を用いたヒトゲノム全体蛋白質 DNA の相互作用を調査するテクノロジーの活用をことができます。
HyCCAPP メソッドの特定のターゲット領域の解析のためのものはまだゲノム解析に最適ではないことを強調することが重要です。技術は、相互作用の蛋白質の不足について地域を扱うとき、または特定ゲノム遺伝子座での相互作用の蛋白質のより包括的な詳細な解析が必要な場合に便利です。HyCCAPP は、明らかに DNA 結合蛋白質が genomic DNA の特定の蛋白質の結合サイトを正確に特徴づけるものです。現在の実装では、方法論は DNA 結合シーケンスまたは個々 の蛋白質のためのモチーフに関する情報を行いません。したがって、素敵なフェアなどの既存技術を補完する、初期の FAIRE 分析によって識別されるゲノム領域の新規結合蛋白質の同定ができます。

<table><tbody><tr><td>PrimerQuestツール</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OligoAnalyzer 3.1</td><td>IDT</td><td></td><td>Analyze、キャプチャ、オリゴヌクレオチド</td></tr><tr><td>、PairFold</td>、<td>UBC</td><td></td>、<td>相互作用の分析</td></tr>、<tr><td>RPMI 1640培地</td><td>、Thermo</td><td>Fisher 11875093</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>サーモフィッシャー</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>カウンテス自動セルカウンター</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>850 cm2ローラーボトル&nbsp;</td><td>Greiner Bio-one</td><td>680058</td><td></td></tr><tr><td>ローラー システム</td><td>ウィートン</td><td>22-288-525</td><td></td></tr><tr><td>37 % ホルムアルデヒド&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3021</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4380</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>ブランソン デジタルソニファイア SFX 150</td><td>エマーソン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0蛍光光度計</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR assay kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000 kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1504</td><td></td></tr><tr><td>MES ナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3885</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 5M</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 マグネット</td><td>サーモフィッシャー</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>ダイナマグ-15 マグネット</td><td>サーモフィッシャー</td><td>12301D</td><td></td></tr><tr><td>ダイナビーズ M-280 アトレプトアビジン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>60210</td><td></td></tr><tr><td>低結合チューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションオーブン</td><td>SciGene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>チューブシェーカーおよびローテーター</td><td>Thermo Fisher</td><td>415110Q</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (RNase-free)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0303</td><td></td></tr><tr><td>SSC buffer 20&times; concentrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639</td><td></td></tr></tbody></table>

交配の適応は哺乳類細胞プロテオミクスのクロマチン関連タンパク質の捕捉します。

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

プロテオミクス (HyCCAPP) の技術のクロマチン蛋白の交配のキャプチャは、酵母の新規 DNA 蛋白質の相互作用を明らかにするために開発されました。対象地域にバインドされている可能性が高いタンパク質についての事前知識を必要とせず興味のターゲット領域の解析をことができます。これは、理論では、関心の任意のゲノム領域を分析に使用する HyCCAPP ができ、異なる電池で動作するように十分な柔軟性を提供します。このメソッドは、クロマチン免疫沈降 (チップ) とチップのようなメソッドに適しているタスク、知られている転写因子の結合部位を研究するためのものではありません。HyCCAPP の強みは、その能力のある限られた DNA 領域を探索するのにバインドされて蛋白質についての知識。それは、抗体を用いたタンパク質ベース クロマチンの濃縮によって導入されたバイアス (チップのようなメソッドに存在) を避けるために便利な方法ことができます。潜在的に、HyCCAPP は本当に新規 DNA 蛋白質の相互作用を明らかにする強力なツールをすることができます。これまでで、酵母、哺乳類細胞の系列を繰り返す高コピー技術は主に適用されています。我々 が思い描く強力なツールになる、HyCCAPP アプローチ哺乳類細胞における単一コピーの遺伝子座を効率的にキャプチャするように最適化する必要があります。HyCCAPP はひと細胞ラインにプロトコルをキャプチャし、シングル コピー クロマチン領域はこの修正されたプロトコルを効率的に分離することができますを表示最初の酵母の我々 の適応を紹介します。

クロマチンの入力量が多い HyCCAPP を成功させるために必要な細胞は密度の比較的高いレベルに成長してください。トリパン ブルー染色の細胞死亡率が中程度であることが確認される (&lt; 10%)。シングル コピー実験、クロマチン コンテンツ交配キャプチャ フェムトモルの範囲である必要する前に少なくとも 10 の9セル開始材料として通常必要とします。実物大実験の前に、もっと小さいバッチでキャプチャ オリゴヌクレオチドのパフォーマンスをテストすることをお勧めします。滴定のオリゴヌクレオチドを使用して交配キャプチャは、図 1のとおりです。中濃度が一定、キャプチャ オリゴヌクレオチドの数が増加徐々 に。この実験は、明らかに 3 つの主要な側面を示しています。最初に、それはどのように多くのオリゴヌクレオチドは最適な (と最大) ハイブリダイゼーション効率に達するに必要な特定の地域の決定に役立ちます。第二に、それは特定のオリゴヌクレオチドのセットの任意の明白な有害な相互作用があるか明らかにします。最...

これ以降のプロテオーム解析の架橋クロマチンのシーケンス固有のキャプチャに依存する特定のターゲット遺伝子の新規 DNA と相互作用する蛋白質を識別する方法です。潜在的な結合蛋白質、またセル変更についての事前知識も必要ありません。技術は、当初は酵母の開発、哺乳類細胞に対して適応を今されています。

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

この方法は、非コード領域の疾患関連配列変異がタンパク質結合を変化させることによって遺伝子発現と制御にどのように影響するかなど、ゲノム制御を理解する上で重要な質問に答えるのに役立ち、それらのタンパク質を特定するのに役立ちます。この技術の主な利点は、細胞や組織の遺伝子操作や抗体を必要とせず、その遺伝子座でDNAと相互作用する可能性のあるDNA結合タンパク質の事前知識がないことです。この手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるDanu Perumallaです。テキストプロトコールに従ってオリゴヌクレオチドを設計した後、6ミリリットルのRPMI 1640培地を含むT25フラスコで、第5リンパ芽球様細胞または他の細胞株を2〜5回10回プレートし、1%Pen連鎖球菌、2ミル以上のL-グルタミン、および5%FBSを補充します。細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%でインキュベートします。血球計算盤または自動セルカウンターを使用して、細胞密度を測定します。細胞が10の10倍から6ミリリットルの細胞に達する前に、Gの100倍で5分間スピンダウンし、このビデオで前述したRPMI 1640培地25ミリリットルのT75フラスコに移します。細胞密度が10の1倍から1ミリリットルあたり6細胞に達するまで細胞を増殖させ、次いで細胞を同じ培地の38ミリリットルのT150フラスコに移し、さらに2日間増殖させる。次に、細胞をGの100倍で5分間スピンダウンし、10ミリリットルのRPMI 1640培地に再懸濁します。次に、懸濁液を500ミリリットルの培地を含む1850平方センチメートルのローラーボトルに注ぎ、一定の回転を除いて、以前と同じ条件下で細胞をインキュベートします。所望の細胞数に達したら、培養物をGの100倍で5分間スピンダウンし、細胞を36ミリリットルのRPMI 1640培地に再懸濁します。次に、細胞懸濁液を50ミリリットルの円錐管に移し、細胞計数とDNA抽出のための小さなアリコートを取り除きます。細胞を架橋するには、1ミリリットルの37%ホルムアルデヒドを加えて最終濃度を1%にし、その後、室温で10〜30RPMで細胞を10分間インキュベートします。2.5モルのグリシン溶液を2ミリリットル加えて、最終濃度を125ミリモルにすることにより、架橋反応を急冷します。次に、細胞を回転させて5分間インキュベートします。遠心分離により細胞をペレット化した後、氷冷した1X PBSを使用して細胞を2回洗浄します。細胞の溶解とシアーリングを続けるか、ペレットを5ミリリットルの細胞溶解バッファーに再懸濁し、懸濁液を液体窒素で一滴ずつ急速凍結します。次に、サンプルを摂氏マイナス80度で保存します。溶解およびシアリングを行うには、ペレットを20ミリリットルの細胞溶解緩衝液に再懸濁します。細胞をGの400倍、摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を捨て、プロテアーゼ阻害剤を含む6ミリリットルの核溶解バッファーに細胞を再懸濁します。超音波処理の準備として、サンプルを6〜8本のマイクロフュージチューブに均等に分割します。サンプルを氷上またはコールドラックに置き、マイクロチップ付きのソニケーターを使用して、5回の20秒コンスタントバーストで65%の振幅でソニケーションし、懸濁液をパルス間で少なくとも40秒間冷却します。細胞をGの12,000倍、摂氏4度で10分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移し、ペレットを廃棄します。蛍光測定法を使用して総回収率を推定した後、サンプルをスナップフリーズします。テキストプロトコルに従ってハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液を調製した後、1, 200マイクロリットルの1Xハイブリダイゼーション緩衝液を使用して、600マイクロリットルのビーズを3回洗浄します。次に、1, 200マイクロリットルの2Xハイブリダイゼーションバッファーを使用してビーズを再懸濁します。1.5ミリリットルの微量遠心チューブに、600マイクロリットルのサンプル、120マイクロリットルの2Xハイブリダイゼーションバッファーに懸濁した洗浄ビーズ、480マイクロリットルの2Xハイブリダイゼーションバッファーを加えます。チューブを摂氏31度、30〜60RPMで10分間インキュベートします。次に、ビーズが固定されるまでチューブを磁石に置き、サンプルを新しいチューブに移してからビーズを廃棄します。捕捉オリゴヌクレオチドを1マイクロリットルあたり10ピコモルの作業溶液に再懸濁し、この溶液を各チューブに4マイクロリットル加えます。チューブを摂氏42度、30〜60 RPMで40分間インキュベートします。インキュベーション中は、必要なビーズを脇に置き、前回と同様にビーズを3回洗浄しますが、今回は1Xハイブリダイゼーションバッファーを使用してビーズを再懸濁します。洗浄したビーズをチューブに加え、サンプルを室温で30〜60RPMで30分間インキュベートします。チューブを磁石に置き、ビーズが固定されたら上清を取り除きます。ビーズを洗浄した後、40マイクロリットルの分子グレードの水を加えてサンプルを溶出し、チューブを摂氏94度で5分間インキュベートします。チューブを磁石の上に置き、溶液が透明になるまで数分待ってから、上清を新しいチューブに移し、ビーズを捨てます。サンプルを摂氏マイナス80度で保存するか、テキストプロトコルに従ってプロテオミクス分析に進みます。捕捉収率を評価するには、分子グレードの水を使用して溶出液のアリコートを1〜10に希釈します。ビデオの前半で撮影したアリコートからDNAを抽出した後、DNAサンプルと分子グレードの水を使用して、1〜10回の希釈を5回連続して行う標準曲線を調製します。プライマーとプローブを添加したqPCRマスターミックスを調製し、反応の各ウェルに適切な量を分注します。各ウェルに、希釈したサンプル、標準曲線、または分子グレードの水のいずれかを5マイクロリットル加えて、テンプレートコントロールなしとして機能します。プレートを密封し、Gの100倍で1分間回転させます。次に、テキストプロトコルにあるパラメーターを使用して、qPCRシステムでサンプルを実行します。最後に、標準曲線を使用して収量を評価し、スクランブル捕獲を使用して捕獲特異性を評価します。ここに示されているのは、オリゴヌクレオチドの滴定を使用したハイブリダイゼーションキャプチャです。オリゴヌクレオチドの数は徐々に増加しますが、総濃度は一定に保たれます。この実験は、最適なハイブリダイゼーション効率を達成するために必要なオリゴヌクレオチドの数を決定するのに役立ちます。また、特定のオリゴヌクレオチドセット間の明らかな有害なハイブリダイゼーション相互作用、および特異性の低いオリゴが存在するかどうか、その結果、バックグラウンドが高くなります。架橋クロマチン中のフラグメントの大部分は、ハイブリダイゼーション捕捉に適していません。ハイブリダイゼーションキャプチャーが正常に実行された場合、同じクロマチン材料のその後のキャプチャ実験で、異なるキャプチャーオリゴヌクレオチドのセットを使用すると、新鮮なクロマチンを使用した場合と同等の収量が得られます。しかし、最初の実験で得られた元のオリゴと残ったクロマチンを用いた2回目の捕捉実験では、ハイブリダイゼーションに適した物質のほとんどが最初の実験で捕捉されていた場合、収率は約90%減少します。この図は、異なる染色体標的領域のハイブリダイゼーションキャプチャを示しており、各領域は他の領域のネガティブコントロールとして機能します。スクランブルされたシーケンスは、真のネガティブコントロールとしても機能します。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば、2日で完了できます。この手順を試行する際は、まず捕捉オリゴヌクレオチドを試験し、目的の領域がハイブリダイゼーション捕捉に適していることを確認することを忘れないでください。この手順に続いて、クロマチン免疫沈降などの他の方法を実行して、同定されたDNA相互作用タンパク質がゲノムの他のどこに結合するかなど、追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、局所的なタンパク質相互作用のde novo同定を目的として、関心のあるゲノム領域を濃縮するためのHyCCAPPの実行方法について十分に理解できるはずです。

adaptation-hybridization-capture-chromatin-associated-proteins-for

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

キャプチャ化合物は、光架橋および精製に続いて​​機能的な可逆小分子 -...

メチルトランスフェラーゼのプロファイリングおよびその他の S -アデノシル- L</subキャプチャの複合質量分析法（CCMS）別> -ホモシステイン結合タンパク質

質量分析法の進歩により、組織の宿主におけるタンパク質発現および変更のハイスループット解析を可能にした。細胞下分画と疾患モデルと組み合わせることで、定量的質量分析法とバイオインフォマティクス、生物学的システムに新しい特性を明らかにすることができます。本明細書に記載される方法は、心臓病の設定でクロマチン関連タンパク質を解析し、他に容易に適用可能である...

病におけるクロマチンプロテオームの定量的解析

ネイティブ組み合わせると高解像度質量分析とクロマチン免疫沈降を架橋することにより、ChroPアプローチはヒストン修飾、変異体及び機能的に異なるクロマチンドメインで相乗非histonicタンパク質の複合プロテオミクスアーキテクチャを分析することができます。...

ChroPアプローチは、クロマチンの遺伝子座特異的プロテオームの風景を分析するために、チップと質量分析を組み合わせ

タンパク質相互作用：SILACの免疫沈降実験は、新規タンパク質を発見するための強力な手段を表す。対照および試験試料の両方におけるタンパク質存在量の正確な相対的定量を可能にすることによって、真の相互作用は、実験的な汚染物質から容易に区別することができ、低親和性相互作用は、あまりストリンジェントな緩衝液条件を使用することによって保存した。...

SILAC免疫沈降定量的プロテオミクスを用いて哺乳動物細胞におけるタンパク質相互作用パートナーの同定

ここでは、極低温固体ミリングによって、哺乳動物細胞を破壊し、得られた細胞粉末から細胞抽出物を生成し、そして抗体結合ミクロンスケールの常磁性ビーズ上にアフィニティー捕捉により、目的のタンパク質複合体を単離するためのプロトコルを説明します。...

Cryomilled哺乳動物細胞からのタンパク質複合体の親和性のキャプチャ

クロマチン結合タンパク質のシーケンシャル塩抽出は大きい蛋白質の複合体の結合特性を決定するための便利なツールです。このメソッドは、個々...

クロマチン複合体を変更するのプロパティをバインド一括クロマチンの分析の逐次塩抽出

ここの褐色脂肪組織 (BAT) マウスから分離した高スループット DNA シーケンス (チップ seq) 続いて効率的なクロマチン免疫沈降 (チップ)...

マウスの褐色脂肪組織のクロマチン免疫沈降

クロマチン免疫沈殿(ChIP)は、遺伝子調節の分子機構を理解するための強力なツールです。しかしながら、この方法は、機械的せん断による再現性クロマチン断片化を得ることに困難を伴う。ここでは、酵素消化を用いたChIPアッセイの改良されたプロトコルを提供する。...

哺乳類細胞における微小コッカルヌクレアーゼを用いてクロマチン免疫沈殿アッセイ

ゲノム全体のタンパク質結合位置の正確な決定は、遺伝子調節を理解するために重要です。ここでは、クロマチン免疫沈降DNAをエキソヌクレアーゼ消化(ChIP-exo)に続けてハイスループットシーケンシングで処理するゲノムマッピング方法について説明します。この方法は、哺乳類ニューロンにおける近接塩基対マッピング分解能および高いシグナル対雑音比を用いてタンパク質とDNAの相互作用を検出する。...

クロマチン免疫沈降-エキソヌクレアーゼ(ChIP-Exo)を用いたマウス幹細胞由来ニューロンにおけるタンパク質-DNA相互作用の高分解能マッピング

このプロトコルは、スナップ凍結組織からのクロマチン調製に焦点を当てており、架橋クロマチン免疫沈降(X-ChIP)とそれに続く定量的PCR分析(X-ChIP-qPCR)または次世代シーケンシングアプローチ(X-ChIP-seq)のいずれかに適しています。...

クロマチン免疫沈降分析のための凍結キメラ肝臓組織からのクロマチン抽出

ここでは、同位体2重ラベリング戦略とArgC消化を用いて、単細胞ヒストンの翻訳後修飾解析を自動化するプロトコルを紹介します。このワークフローにより、クロマチンの異質性およびエピジェネティック応答の定量的かつ再現性が高く高感度なプロファイリングが単一細胞分解能で実現します。...

単細胞ヒストーンの翻訳後修飾(sc-hPTM2)の多重解析のための自動サンプル調製

学ぶHyCCAPP法で哺乳類細胞のクロマチン関連タンパク質を捕捉し、ゲノム制御と疾患関連変異体の影響を解明します。遺伝子操作や抗体を必要としない革新的プロテオミクス手法です。

交配の適応は哺乳類細胞プロテオミクスのクロマチン関連タンパク質の捕捉します。

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