DNA 染色、シアニン色素が消化される制限の酵素とかどうかを決定します。

この実験の全体的な目標は、蛍光標識されたDNA分子をメチル化および非メチル化感受性制限酵素で消化し、実験の消化速度を決定することです。この方法は、ゲノミクスなどの化学または生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法の利点は、科学者が事前に染色されたDNAを酵素で消化し、別の実験の完了後にDNAが完全長であるかどうかを判断できることです。

この手順を実演するのは、私の研究室の学部生であるDrew Thompsonです。0.7%アガロースゲルを作るには、三角フラスコで1.4gの高ゲル化温度アガロースを秤量します。次に、200ミリリットルの1x TAEバッファーを追加し、フラスコの上に逆ビーカーを置きます。

フラスコの底に気泡が形成され始め、上部に浮くまで、ホットプレート上で溶液を加熱します。ホットプレートから溶液を取り出し、フラスコが素手で触れられるまで冷まします。次に、ゲルを24.5センチメートル×21.8センチメートルのゲル型にゲルコームで注ぎ、ウェルを作成します。

ピペットチップを使用して、コームの近くまたはゲルの表面に気泡をポップし、ゲルを少なくとも15分間固化させます。ラムダDNAを6つの異なる濃度の色素で染色するには、まず1x TEを使用して、ラムダDNAのマイクロリットルあたり100ナノグラムの300マイクロリットルを調製します。溶液を摂氏4度で保管します。

制限消化物で予想される各バンドについて、以下の色素濃度のそれぞれについてサンプルを調製しながら、75〜100ナノグラムの非メチル化ラムダDNAを染色します。サンプルを摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、制限酵素が染色されたDNAを消化できるかどうかを判断するために、20単位の制限酵素、最も切断効率の高い適切な緩衝液3マイクロリットル、およびオートクレーブおよびろ過した蒸留水を加えて30マイクロリットルの反応を行います。

反応を最適な酵素活性で水浴に置き、2〜4時間インキュベートします。次に、0.5モルのEDTA pH 8.0の2マイクロリットルを追加して反応を停止します。事前に準備したゲル型から側面を取り外し、ゲルをゲル電気泳動ボックスに入れます。

2.5リットルの1x TAEバッファーをボックスに注ぎます。次に、ゲルコームをゲルから慎重に取り外して、ウェルにアクセスできるようにします。制限酵素反応をプラスチックフィルムにピペットで移し、反応溶液ごとに、DNA溶液5〜6マイクロリットルあたり6倍ローディング色素を1マイクロリットル加えます。

次に、反応をウェルにピペットで入れます。1 マイクロリットルの 1 キロベース ラダー、9 マイクロリットルの 1x TE、2 マイクロリットルの 6x ローディング染料を混合します。次に、他の溶液に隣接するウェルに溶液をロードします。

ジェルボックスを紺色または黒の紙または布で覆い、ジェルボックスを電源に接続します。電源を30ボルトに設定し、一晩運転します。ゲルが作動している間は、標識されたDNAの光切断を防ぐために照明を消してください。

翌朝、トレイ内のゲルを45マイクロリットルの臭化エチジウムと1リットルの1x TAEバッファーを入れた容器に移します。容器は室温で暗所に保管するか、光が当たらないようにホイルで覆ってください。ゲルを室温で少なくとも45分間放置します。

ゲルを画像化するには、400〜500ナノメートルの最大光出力を放出する青色光トランスイルミネーターの上にゲルを置きます。駅に取り付けたカメラで撮影します。テキストプロトコルに従って、実験の消化速度を決定します。

酵素効率は、予想されるバンドの総数を目に見えるバンドの数で割ることによって決定されます。さらに、バンドのおおよそのサイズを決定するためには、染色されたDNAと比較してネイティブDNA分子がどこにあると予想されるかを知るためのコントロールが必要です。レーン 3 と 4 のバンドの移動性が低下し、バンドが井戸に近づ

これらのレーンでは、染料の量が移動性に目立って影響しないため、バンドはコントロールと一致します。レーン5とレーン6は、コントロールよりも多くのバンドを示しており、これは部分的な消化を示しており、色素が認識部位での切断に影響を与えたことを示唆しています。この実験では、すべての色素濃度で予想されるすべてのバンドが見られるため、サイコロはDNAの消化を妨げませんでした。

YOYO-1色素の濃度が増加するにつれて移動度がどのように変化するかを確認するために、各バンドの隣に色付きのアスタリスクを挿入しました。たとえば、3.5 キロベース バンドには、各 YOYO-1 濃度で横に赤いアスタリスクが付いています。レーン 5 と 6 の予期しないバンドには、バンドの横にアスタリスクがありません。

この手順を試みるときは、ゲルを暗い紙で覆い、暗い部屋でゲルのランニングを完了することを忘れないでください。また、反応には必ず暗いチューブを使用してください。このビデオを見れば、蛍光染色されたDNA分子を制限酵素で消化する方法と、反応の消化速度を決定する方法について十分に理解できるはずです。

エチジウムブロマイドでの作業は非常に危険である可能性があるため、手順を実行するときは手袋や安全メガネを着用するなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。また、トランスイルミネーターを使用するときは、適切な安全メガネを着用してください。