乳房癌のアーカイブ材料を用いた多重 RNA に基づく発現アッセイの最適化

この方法は、乳がん患者を既知の治療群と知られていない治療群に分類するために最適化に成功しています。このアッセイの高感度により、レーザーマイクロダイセクションを使用してさらに研究できる不均一なサンプルを同定できます。RNAベースのマルチプレックスアッセイの主な利点は、ヘマトキシリンおよびエオシン染色されたホルマリン固定パラフィン包埋アーカイブ材料を使用した結果の再現性であり、高分解能の出力とバイオマーカーの検証を可能にします。

テキストプロトコルに記載されているように組織を調製します。解剖を開始するには、スライドの制限を設定し、顕微鏡のステージの動きを校正します。次に、4X対物レンズを使用して染色されたメンブレンスライドをスキャンします。

メンブレンスライド上のマイクロダイセクション用のターゲット領域を選択し、囲みます。総面積を追跡します。適切なダウンストリームRNA解析には、少なくとも42平方ミリメートルが必要です。

次に、定義されたパラメータでレーザー切断を開始します。次に、キャップリフト機構を使用して解剖された切片を取り出し、その切片を機械付属物に取り付けられたラベル付きチューブのディフューザーキャップにセットします。解剖された切片がキャップに取り出されない場合は、ターゲット領域の解剖を繰り返します。

マイクロダイセクションの精度は重要なステップであり、キャップ上に存在するマイクロダイセクションがマークされたスキャン画像と一致することを常に確認する必要があります。必要な数の組織切片をそれぞれ別々のチューブに集め、組織サンプルの溶解に進みます。溶解には、各サンプルに2.4マイクロリットルの均質化溶液をプレ平方ミリメートルの組織領域に適用し、次にサンプルを最大速度で10秒間ボルテックスします。

次に、サンプルを2, 500 gで5秒間スピンダウンします。次に、必要に応じてサンプルを1.5ミリリットルのチューブに移し、摂氏65度の振とうのある加熱ブロックに入れます。600rpmで12〜18時間振とうします。

次に、ライセートを室温で5分間21, 000gで遠心分離します。透明な上清を新しいラベル付きチューブに慎重に集めます。組織の破片を移さないでください。

上清液はマイナス80°Cで保存することができます。ハイブリダイゼーションベースのアッセイ用のすべての試薬を調製した後、磁気分離96ウェルプレートの最大90ウェルに25マイクロリットルの組織ホモジネートをロードします。25マイクロリットルのコントロールサンプルを3つの指定されたウェルにロードし、25マイクロリットルの均質化溶液をブランクとして3つのウェルにロードします。

次に、透明なプラスチック製の圧力シールを使用して磁気分離プレートを密封し、プレートを摂氏54度のインキュベーターに18〜22時間振とうします。翌日、プレートをハンドヘルド磁気プレートワッシャーに取り付けてロックし、圧力シールを取り外して、磁気ビーズが落ち着くまで1分間待ちます。次に、洗浄を行います。

プレートをシンクの上に置き、ティッシュペーパーを使用して静かに拭き取り、すべてのウェルに100マイクロリットルの1Xウォッシュバッファーをロードして15秒待ちます。このプロセスを3回繰り返して、洗浄ステップを完了します。最後の洗浄液を取り出した後、ウェルに50マイクロリットルのプリアンプ試薬をリロードし、アルミプレートシーラーでプレートをシールし、プレートを室温で800rpmで1分間振とうします。

次に、プレートを摂氏50度で1時間振とう続けます。これが完了したら、別の洗浄手順を実行します。次に、ウェルに50マイクロリットルの増幅試薬をリロードし、プレートをアルミニウムプレートシールでシールし、室温で1分間、50°Cで1時間

次に、ラベルプローブを最大速度で10秒間ボルテックスし、次に50マイクロリットルのラベルプローブを各ウェルに追加します。その後、プレートを再シールし、前と同じように振とうインキュベーションを繰り返し、続いて別の洗浄ステップを行います。次に、新たに混合したストレプトアビジンフィコエリスリン50マイクロリットルをウェルにロードし、室温600rpmで振とうインキュベーションを行い、続いてストレプトアビジン洗浄緩衝液を用いた洗浄ステップを行います。

洗浄ステップが完了したら、各ウェルに100マイクロリットルのストレプトアビジン洗浄バッファーをロードし、プレートをアルミニウムプレートシールでシールし、プレートを室温で800rpmで3分間振とうします。最後のインキュベーションステップでは、マグネティックビーズアナライザーを起動し、装置が校正され、バリデーションプロトコルが実施されていることを確認してください。ソフトウェアで、[バッチ]タブから[既存のプロトコルを使用してバッチを作成]を選択して、新しい分析を追加します。

次に、プレートレイアウトで、ウェルを不明またはブランクとして指定し、サンプルパネルでそれぞれにラベルを付けます。次に、リアクションプレートからアルミニウムシールを取り外し、プレートローダートレイを取り出して、プレートをアナライザーにロードします。次に、[リトラクト]をクリックし、[バッチの実行]をクリックしてアナライザーを開始します。

読み取り後、プレートを取り出し、メーカーが推奨する磁気ビーズアナライザーを清掃します。分析するには、[バッチ結果] タブに移動します。それぞれの分析ファイルを選択し、csvファイルとしてエクスポートするオプションを使用してから、スプレッドシートソフトウェアを使用して平均と生のスコアを作成します。

コントロールが予期される信号を表示していることを確認します。サンプルの生データを正規化し、データサイエンスプラットフォームを使用するか、定義されたアルゴリズムを使用してデータ分布を分析し、主成分分析を実行します。マルチプレックスビーズリーダーとアッセイの性能は非常に重要であり、貴重な患者サンプルの前に十分にアノテーションされたコントロールサンプルの段階希釈を実行することで、正しい結果が保証されます。

属性については、正規化された遺伝子データのサブセットと、乳がんのサブタイプなどの名義変数を選択します。トレーニング済みで検証済みの分類アルゴリズムを適用して、未知のサンプルを特徴付けます。記載された方法は、H&E染色、マイクロダイセクション、高度に分解されたFFPE材料中の40の転写産物の同時測定に適用されています。

この方法を使用すると、さまざまな受容体陽性および陰性サブタイプの腫瘍および適合対照組織と比較した場合に、間葉系マーカーFN1の受容体状態および差次的発現の正確な特性評価を示すことが可能である。腫瘍内の不均一性は、この方法を使用して特徴付けることができます。ER陽性腫瘍は、明確な腫瘍形態および有糸分裂活性を示す領域内でFN1の空間的差次的発現を示す。

このビデオを見れば、ターゲットRNAのビーズへのハイブリダイゼーション、シグナル増幅、定量後に、組織溶解物から複数の遺伝子を直接測定する方法について十分に理解できるはずです。アッセイ感度により、レーザーマイクロダイセクション材料の使用が可能です。この手順を試行する際には、各アッセイの前に装置を校正し、貴重な患者サンプルを流す前に品質管理材料を使用して感度範囲を決定することを忘れないでください。

アッセイワークフローは、臨床検査室に容易に適応できます。最大90サンプルのRNAプロファイリングを、2日間で12時間で実行できます。病理検査室での乳がん受容体の状態の測定には時間がかかり、経験豊富な病理医が必要です。

このデジタル化されたマルチプレックスビーズベースのアッセイを使用すると、RNA発現を正確に定量できます。一次診断における生検におけるフラクショナルバイオマーカーの分析は、腫瘍の提示です。この方法論を幅広いバイオマーカーパネルとともに使用し、セクション全体を利用することで、ヘテロジェニックサンプルを同定します。

この方法論を使用したアッセイの開発は汎用性が高く、サンプルのインプットが少なくて済みます。サンプルには、バイオマーカーの検証に重要な臨床注釈付きサンプルや、患者の監視や早期診断に重要なリキッドバイオプシーが含まれます。