Name: 乳房癌のアーカイブ材料を用いた多重 RNA に基づく発現アッセイの最適化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: 学ぶレーザー顕微鏡解剖と多重磁気ビーズアッセイを用いた乳房癌のRNA発現解析。FFPEアーカイブ材料から高感度にバイオマーカーを検出し、治療群分類と腫瘍異質性評価を実現する方法です。

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仕事は、(1) 乳房癌プロジェクト奨学金 (2014-2016) 乳がん財団、研究、技術革新と、マルタ大学医学部 (2) の開発の信頼 (RIDT) 生きている 2013 年のアクションによって資金を供給されるによって支えられました。・手術、マルタの大学、(3) プロジェクト科学技術融合によるマルタ協議会によって融資される行為: R & I 技術開発プログラム 2016。この原稿の発行はサポートされてゼウス Luminex 助成金を介して。

本研究では乳房組織材料の使用の倫理的な承認が得られたマルタの大学の大学研究倫理委員会 (UREC) から (Ref: 22/2012)。
1. ティッシュの準備
<ol><li>適切な H & E の手順14を使用して、ステンド グラス参照ティッシュ セクションの準備、レーザーマイクロダイ セクション中に参照用のスライドをデジタル スキャンします。</li>
	<li>40 ° C で RNAse フリーの水のお風呂に 20 μ m の組織のセクションをカット、ミクロトームを使用してきれいで、RNase 除染装置および材料を使用してレーザー顕微解剖用膜スライド セクションを収集します。</li>
	<li>乾燥のインキュベーターで 37 ° C で膜スライドを一晩乾かします。汚れ分子生物学グレード ソリューションで適切な H & E の手順15の使用および 6 分のヘマトキシリン染色時間時間を増やします。必要な場合は、適切な免疫組織化学的プロトコル16膜スライドを染色します。</li>
</ol>2. レーザー顕微解剖
<ol><li>スライドの制限を設定し、舞台上の動きを調整します。<ol>
<li>膜スライドの空の領域にレーザー ビューを移動します。膜を貫通するレーザーが開始されるまでフォーカス間隔 (5%) が長く撮影レーザーを発射することによってレーザーの焦点を調整します。ドローと microdissect 任意の形状と微調整レーザー解剖時にレーザーの効率を最大化するレーザーの焦点。</li>
		<li>レーザー解離効率が損なわれない点にステージの移動速度を上げます。選択した対物レンズにレーザーを調整し、4 X の目的を使用する場合 (1 – 15% でレーザー速度)、フォーカスには 70-75% と 90-100% で電力の目標を変更する場合を再調整。</li>
	</ol>
</li>
	<li>4 X 目的を使用して染色膜スライドをスキャンします。</li>
	<li>選択し、膜スライドの顕微解剖用ターゲット エリアを取り囲みます。レーザーは、42 mm2の最小面積を解剖します。レコードに使用するサンプルの均質化バッファーのボリュームを決定する地域を解剖しました。</li>
	<li>キャップのリフト機構を使用して、適切な付属物に接続されているラベル付きのチューブのディフューザー キャップに切り裂かれたセクションを取得します。切り裂かれたセクションはキャップに取得されない場合は、領域のレーザー解離を繰り返します。</li>
</ol>3. 組織溶解
注: いくつかのソリューションと材料は材料の表に記載されているキットと一緒に提供されます。
<ol><li>60: 1 の比率で均質化のソリューションと, プロテイナーゼ K を使用してサンプルの換散のため必要な均質混合物のボリュームを準備します。</li>
	<li>各チューブ各 1 mm2組織領域、10 の渦のためにソリューションを均質化の 2.4 μ L をピペット最大速度で室温で遠心する 5 s 2,500 x g で s。</li>
	<li>600 rpm で振とうしながら 12-18 h 65 ° C で加熱ブロックで孵化させなさい。</li>
	<li>室温で 5 分間 21,000 x g で溶解液を遠心します。</li>
	<li>ピペットを使用して、慎重にクリアの上清を吸引、ラベル付きの新鮮なチューブに分注します。これは結果の質を減らすことができるよう、組織/膜片を吸引を避けます。</li>
	<li>-80 ° C のフリーザーに明確な上清を保存します。</li>
</ol>4. 交配アッセイ
<ol><li>次の準備作業を実行します。<ol>
<li>前 30 分の 37 ° C でインキュベーターで試薬瓶を置くことによって溶解混合物を温かく、逆転で軽く混ぜます。</li>
		<li>組織ホモジネートが固定されている場合室温で解凍し、次の孵化最大速度でサンプル 37 ° C で 30 分間渦で孵化させなさい。</li>
		<li>54 ° C で動揺のインキュベーターを設定し、空も 96 ウェル プレートの温度検証キットのプローブを配置します。2 時間後デジタル温度計で温度を確認し、任意の温度差を補正するためのインキュベーターを揺れのデルタの温度を設定します。</li>
		<li>雪解けと渦を設定し、ブロック 10 用試薬プローブ s、室温で遠心する 5 g、および氷を続ける x 2,500 で s。</li>
		<li>使用中に氷にプロティナーゼ K バイアルを維持します。</li>
		<li>46 khz キャプチャ ビーズ 3 分、別の 3 分間の最大速度で、渦の超音波照射します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>次の試薬をそれに応じてスケール アップによってウェルあたり 25 μ L 作業ビーズ ミックスを準備: ヌクレアーゼ フリー水、換散混合物の 16.65 μ L、ブロッキング試薬、0.10 μ L プロティナーゼ K のキャプチャ ビーズの 0.50 μ L、プローブ セットの 2.50 μ L の 1.00 μ L の 4.25 μ L。</li>
	<li>渦作業ビーズ ミックス 10 を最大速度で s、磁気分離板に 25 μ L/ウェルのピペットです。</li>
	<li>ピペット 25 μ L 組織ホモジネート磁気分離の 96 ウェル プレート、25 μ L 空欄として 3 井戸への解決策を均質化します。</li>
	<li>透明なプラスチック圧力シールを用いた磁気分離板をシールし、600 rpm で揺れながら 54 ± 1 ° C で 18-22 h のためのインキュベーターでプレートを配置します。</li>
	<li>24 井戸洗浄の 0.1 mL と RNase フリー 31.5 mL 水を混合することによってバッファー洗浄バッファー コンポーネント 2 のコンポーネント 1 と 1.67 mL の洗浄緩衝液 × 1 を準備します。</li>
	<li>インキュベーターからプレートを削除します。揺れの定温器の温度を 50 ± に設定 1 ° C</li>
	<li>手持ちの磁気プレート洗濯機の磁気分離プレートをマウントし、場所でロックします。圧力シールを削除し、解決する磁気ビーズの 1 分を待ちます。</li>
	<li>洗浄のステップ: 反転磁気分離プレート液の残留を削除するティッシュ ペーパーで軽くシンクとしみをプレート上に搭載します。各ウェルに 100 μ L の洗浄緩衝液 X 1 を追加マルチ チャンネル ピペットを使用して、待機 15 s. は、3 回、洗浄するのにこの手順を繰り返します。</li>
	<li>各ウェルに前置増幅器試薬 50 μ L をピペットします。プレート シール アルミシール プレートを室温で 1 分の 800 の rpm でプレートを振る。600 rpm で揺れながら 50 ± 1 ° C で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>4.9 (洗浄のステップ) の手順を繰り返します。</li>
	<li>各ウェルに増幅試薬 50 μ L をピペットします。プレート シール アルミシール プレートをステップ 4.10 のようにプレートを振る。</li>
	<li>4.9 (洗浄のステップ) の手順を繰り返します。</li>
	<li>渦 10 ラベル プローブ最大速度で s。ラベル プローブの 50 μ L を各ウェルに追加します。シール、プレート (ステップ 4.10) を振る。</li>
	<li>ステップ 4.9 (ステップ洗浄) を繰り返します。</li>
	<li>渦 10 ストレプトアビジン フィコエ リスリン (SAPE) 最大速度で s。SAPE の 50 μ L を各ウェルに追加します。シール、プレート (ステップ 4.10) を振る。</li>
	<li>使用洗浄緩衝液ではなく SAPE 洗浄バッファーを除いてステップ 4.9 (洗浄工程) を繰り返します。</li>
	<li>各井戸とシール プレート、アルミ プレート シールに SAPE 洗浄バッファーの 130 μ L を追加します。3 分間室温で 800 rpm でプレートを振る。</li>
	<li>スタートアップ磁性体粒子アナライザー。製造元の指示に従って、校正及び検証ルーチンを実行します。</li>
	<li>磁性体粒子アナライザーで以下のパラメーターを使用してプロトコルを設定: サンプル サイズ: 100 μ L;DD のゲート: 5,000-25,000;[タイムアウト]: 90 s;ビーズ イベント/ビーズ領域: 100;次へをクリックします。パネルでそれぞれビーズ番号を選択し、製造元によって示されるようにそれぞれのターゲット遺伝子を持つビーズ領域を定義します。</li>
	<li>新しい分析を追加するには、[バッチ] タブから「バッチの作成は、既存のプロトコルを使用して」を選択します。不明なまたは空白として指定する井戸をそれぞれプレート レイアウトでとサンプルパネル内の各サンプル用ラベルを提供します。</li>
	<li>96 ウェル リアクション プレートからアルミ プレート シールを削除します。イジェクトボタンを押してプレート トレイを取り出し、磁性体粒子アナライザーにプレートをロードします。撤回をクリックして |バッチを実行アナライザーを開始します。読み終わった後、取り出し、96 ウェル プレートを取り外します。きれいにし、製造元の推奨どおりに磁性体粒子アナライザーをシャット ダウンします。</li>
</ol>5. データの解析
<ol><li>バッチで |[結果] タブは、それぞれの分析ファイルを選択し、 to.csv [エクスポート] ボタンをクリックします。表計算ソフトを使用するオープン the.csv ファイル。</li>
	<li>ビーズ数を観察し、< 40 ビーズ/地域に結果を省略します。</li>
	<li>空白の井戸の値を平均し、標準偏差 (SD) と検出限界 (LOD) エクササイズ (空白の平均 + (3xSD)) ターゲット遺伝子ごと。として検出されない LOD より低い値を設定します。 注: 正規化の式の値が検出された場合は、サンプル データとして不十分なを考えてください。上限感度制限で式の値として 20,000 以上を考慮します。これらのサンプルの溶解液を希釈し、再分析する必要があります。</li>
	<li>空白の平均 per 遺伝子生データからを減算します。</li>
	<li>サンプルあたり選択した正規化遺伝子の幾何平均を計算します。個々 のサンプル データをそれぞれの幾何平均を正規化します。</li>
	<li>データ科学プラットフォームまたは定義されたアルゴリズムを使用してデータを分析します。<ol>
<li>データの追加をクリックして、データ科学プラットフォームにデータをインポートします。プロセス ワークスペースにデータ ファイルをドラッグし、 [属性の選択]オペレーターに接続、プリンシパル主成分分析 (PCA)演算子、そして結果t ポートへ。</li>
		<li>属性の選択演算子で正規化された遺伝子データのサブセットと乳房癌のサブタイプなど名目変数を選択します。プロセスを実行するには、再生をクリックします。[グラフ] タブで、「3 D カラーを散布図」グラフのスタイルで、カラーフィールドで名目変数を選択します。3次元プロットの PCA データ変動を評価します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Abrahamsen, H. N., Steiniche, T., Nexo, E., Hamilton-Dutoit, S. J., Sorensen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+quantitative+mRNA+analysis+in+paraffin-embedded+tissues+using+real-time+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction%3A+a+methodological+study+on+lymph+nodes+from+melanoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Towards quantitative mRNA analysis in paraffin-embedded tissues using real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction: a methodological study on lymph nodes from melanoma patients.</a> J Mol Diagn. 5 (1), 34-41 (2003).</li>
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<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+and+Eosin+Staining+of+Tissue+and+Cell+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin and Eosin Staining of Tissue and Cell Sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2008).</li>
<li>Molecular Machines and Industries. H&E Staining Kit Plus for Laser Microdissection and more, Prod. No 70302. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.molecular-machines.com/single_cell_sorting_products/consumables/mmi_he_staining_kit_plus">http://www.molecular-machines.com/single_cell_sorting_products/consumables/mmi_he_staining_kit_plus</a> (2018).</li>
<li>Lin, F., Prichard, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLin%2C+F+%22Handbook+of+Practical+Immunohistochemistry%3A+Frequently+asked+questions%22">Handbook of Practical Immunohistochemistry: Frequently asked questions</a>. , Springer. (2011).</li>
<li>Grech, G., et al. <a target="_blank" href="https://www.omicsonline.org/open-access/molecular-classification-of-breast-cancer-patients-using-formalinfixedparaffinembedded-derived-rna-samples-2155-9929-S8-016.php?aid=67638">Molecular Classification of Breast Cancer Patients Using Formalin-fixed Paraffin-embedded Derived RNA Samples.</a> Journal of Molecular Biomarkers & Diagnosis. 7 (S8), (2016).</li>
</ol>

「Invitrogen™ QuantiGene™ プレックス アッセイは、Thermo fisher Scientific 社独自のものです。

ビーズを用いた多重 bDNA アッセイに劣化した RNA FFPE 乳癌のティッシュおよび正常乳管由来の遺伝子の発現を定量化する最適化されました。アッセイの最適化、遺伝子の正規化関与 8 よく知られているバイオ マーカーおよび潜在的な 5 を利用した内腔と基底のサブタイプで乳がんの腫瘍を分類するアルゴリズムを開発します。データの正規化が行われた正規化遺伝子の順列を使用します。正規化の遺伝子の選択は、Luminal/基底分類子遺伝子による受容体の状態の最高の予測に基づいていた。FFPE 組織から Luminal/基底サブタイプを分類するには、正規化の遺伝子選択された β-アクチン (ACTB)、グリセルアルデヒド 3-リン酸デヒドロゲナーゼ (GAPDH) やヒポキサンチン Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1)。
メソッドは、次の正規化の遺伝子セットの適切な選択の研究領域とその他の診断で使用に合わせることができます。研究部門でこのメソッドの 1 つの重要な適用は、史料も臨床結果と注釈が付けられるバイオ マーカーの測定です。これが迅速かつ正確に、回顧的な研究、潜在的な予測マーカーを検証でき、無病生存率および全体的な生存データを待っている長期前向き研究を避けるため。現在当社グループは、新しいアルゴリズムを使用して代替データの正規化のための遺伝子を正常化の開発を必要とする受容体陽性エクソソームを検出するアッセイの使用を調査中です。液体生検と堅牢な遺伝子発現アッセイの使用が高スループット マルチプレックスアッセイ治療中の患者管理の適応を許可、治療効果、治療への抵抗のための潜在的な再発に従う手段を提供し、腫瘍の転移能力は。
このメソッドは、腫瘍の診断の可能なアプリケーションの広い範囲を持っても、現在の診断のワークフローに適応。診断の分野でこのメソッドの主な利点があります: (1) 実施高スループット試金、(2) 主観イメージ ベースの測定からその結果を除く複数のターゲットの (3) の正確な検出同時に、精度を高めるし、専門性の高い施設・設備と人材を必要としない患者の貴重なサンプルと (4) の使用を最小限に抑えます。一緒にビーズを用いたマルチプレックス アッセイに必要な材料の低入力、最適化されたサンプリング プロセスによりさらに腫瘍の多様性の実態調査同じ患者セクション悪性組織の複数の病巣を正確に分離するレーザ切断を使用して、一致した正常組織 (図 4) とそれらの間の複数の遺伝子発現を比較することが可能です。低材料投入は限られた腫瘍組織を提供する腫瘍生検の診断アプリケーションに不可欠です。劣化の RNA のサンプルから遺伝子発現を測定するアッセイの機能により、分析機関または研究所にサービスを提供するためのサンプルの容易な交通機関です。さらに、セクション全体の分析は、H & E 染色材料 (図 1) を使用することもできました。
このプロトコルの成功のために不可欠です: (1) 試金のため分離し、(2) 開発も腫瘍のサイト/s の適切なサンプリング最適化し、検証データの正規化アルゴリズムの各遺伝子式パネルおよび/または個々 の予後を確保します。または、予測バイオ マーカー。前者は、サンプリングを行う技術者・科学者の技術的な経験に依存します。追加のコアを取るし、多重磁気ビーズ アッセイ (96 ウェル フォーマット) の同じ形式のティッシュのマイクロ アレイ (TMA) を準備することをお勧めします。これは RNA を用いた測定試料のレプリカとして腫瘍のサイトのアーカイブを提供します。TMAs は、フォロー アップ調査や結果の検証のための他の手法とも評価することができます。正規化アルゴリズムの開発、検討されている材料と正規化遺伝子正規化の選択によって決まります。レベルおよび分析サンプルの発現の変動に基づいて遺伝子の正常化、異なるパネルを選択し、これによって異なる起源から癌組織、プラズマ、または循環腫瘍細胞からエクソソーム異なります。アッセイの検証には、様々 な準備が異なる正規化アルゴリズムにもなりますのでサンプルの処理が含まれます。
組織溶解液の量が少ないから派生で直接遺伝子発現を測定の追加の利点を提供する要約、bDNA 技術磁気ビーズ化技術との組み合わせでの使用は、標的遺伝子の適切なパネルの選択患者材料、microdissected 材料、エクソソーム循環腫瘍細胞など。腫瘍の不均一性の検出だけでなくパネルの適切な使用早期診断、再発の早期発見のため腫瘍由来エクソソームを検出する可能性があります。ビーズ ベース多重と組み合わせて bDNA 技術を使用して信号増幅アーカイブ材料の臨床的に注釈付きで複数の遺伝子発現を測定しのためのリソースを提供する核酸増幅ステップの必要性がないのでバイオ マーカーの検証。

アーカイブ ホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 素材を使用して RNA によるアッセイの最適化は手術ティッシュの処理と組織の整合性保全1、使用されるホルマリンによって引き起こされる RNA の低下の可変性のために挑戦 2。史料から正確な遺伝子発現研究の実行の制限を克服するためには、私たちのグループは bDNA 多重磁気ビーズ アッセイを使用しました。ターゲット テンプレートの酵素増幅ではなく bDNA 技術は、特定のプローブの交配と記者信号3の増幅を使用します。キャプチャと検出プローブの短い認識シーケンスは、ターゲット RNA4の短い断片に交配させるのに設計されています。さらに、このアッセイで直接原料として組織乳剤の使用は事前の RNA の抽出・精製を必要とするアッセイに起因する RNA の必然的な損失を克服します。信号増幅、短い認識シーケンスの使用および浄化のステップの除外は、アッセイの技術的な変化の低減に貢献します。技術は、試金 (最大 80 RNA ターゲット) を多重化し、低材料投入からターゲットのパネルの発現を測定する可能性を提供します。このプロトコルでは、準備をし、レーザ切断のための組織サンプルの染色をについて説明します。腫瘍と正確な選択を提供する組織の構造のイメージングとのプロファイリングを容易にする膜スライド染色: 異種腫瘍中で悪性の細胞のクローン (1) 腫瘍、乳房組織に通常のダクトと (2)。
乳癌の分子分類は (HER2) に 3 分子のクラス、すなわち、内腔、人間の表皮成長因子受容体 2 患者の腫瘍を分類するための分子マーカーを尋問プロセス-豊かな, と基底のサブタイプ。HER2 濃縮サブタイプはよく定義されており、低エストロゲン受容体 (ER) やプロゲステロン受容体 (PgR) の不在と組み合わせて ERBB2 遺伝子増幅により、HER2 受容体高発現。内腔のサブタイプは、ER と基底のサブタイプは、一般的な負 3 受容体 (HER2、ER、PgR) と大幅トリプル ネガティブ乳がん (TNBC) がん診断サブタイプ5,6と重複のため一般的に肯定的です。他のマーカーを使用して、上皮と間葉の特性を決定します。フィブロネクチン (FN1) 乳房組織間葉系コンパートメントの主成分であります。FN1 発現の増加と一緒に伴われる高キ67 染色より侵襲性の腫瘍7、8にシグネチャを示し、転移9に関連付けられています。興味深いことに、FN110受信者線維芽細胞の幼若化シグナルの活性化を誘導する腫瘍細胞由来機構の解明にあることがわかった。したがって、エクソソーム早期発見や転移の潜在的なマーカーは、11の再発と機構の解明を循環します。
乳房癌転写サブタイピングの腫瘍領域選択は反復的 macrodissection12,13によって実行されました。組織の不均一性を克服し、感度を上げる私たちは確実に古典的な組織染色多重分子プロファイリング メソッドを組み合わせています。原則の証拠として 2 つの異なる乳房癌クローンはその上皮間葉系の署名や転移の可能性によって定義されています。記述されていたプロトコルのワークフローを簡単に現在の臨床設定に変換し、選択的に分離し、ターゲット mRNA プロファイリングを使用して組織のサブタイプを特徴付けるために使用できます。

<table><tbody><tr><td>ミクロトーム</td><td>ライカ</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン マイヤーズ</td><td>シグマ</td><td>MHS16-500mL</td><td></td></tr><tr><td>エオシン Y 水溶液</td><td>シグマ</td><td>HT110216-500mL</td><td></td></tr><tr><td>正常ウサギ血清</td><td>モノサン</td><td>MONX10963</td><td>使用希釈率:1/40</td></tr><tr><td>ビオチン化ウサギ抗マウス</td><td>ダコ</td><td>E0354</td><td>使用希釈率:1/200</td></tr><tr><td>ER 抗体 (6F11)</td><td>Vector Laboratories</td><td>VPE614</td><td>使用希釈率: 1/45</td></tr><tr><td>HER2 抗体 (CB11)</td><td>Novocastra</td><td>CB11-L-CE</td><td>使用希釈率: 1/325</td></tr><tr><td>Ki67 抗体 (MIB-1)</td> <td>Dako</td><td>M7240</td><td>使用希釈率: 1/500</td></tr><tr><td>Avidin Biotin Complex kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti-E 倒立顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>Ti-E</td><td>4x、10x、20x、40x対物レンズ</td></tr><tr>レーザー<td>マイクロダイセクションメンブレン分子</td><td>機械&産業</td><td>S0103</td><td></td></tr><tr><td>mmi CellCamera 1.4</td><td>分子機械 &インダストリーズ</td><td>MX4285c-ACK07</td><td></td></tr><tr><td>mmi Cellcut Plus</td><td>Molecular Machines &産業</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ディフューザーキャップ</td><td>分子機械 &インダストリーズ</td><td>50210</td><td></td></tr><tr><td>mmi Celltoolsソフトウェアv.4.01rcl</td><td>分子機械&Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer comfort</td><td>Eppendorf</td><td>5355000038</td><td></td></tr><tr><td>1.5mL 加熱ブロック Eppendorf Thermomixer</td>用 <td>Eppendorf</td><td>22670522</td><td></td></tr><tr><td>Labnet Vortemp 56 Shaking incubator</td><td></td> 22670565 <td></td> Labnet 52056A-220 <td></td></tr> LX200<tr><td>用 96ウェルプレート加熱ブロック</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100/200</td><td>Luminex</td><td></td><td>磁気ビーズ分析装置</td></tr><tr><td>Invitrogen QuantiGene サンプル処理キット - FFPE 組織</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>QS0109</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 アッセイキット (磁気分離)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>QP1011</td><td></td></tr><tr><td>Thermaseal RTS シーリングフィルム</td><td>Thermaseal</td><td>765246</td><td></td></tr><tr><td>ハンドヘルド磁気プレートウォッシャー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>QP1011</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen QuantiGene インキュベーター温度バリデーションキット</td><td>Affymetrix/Panomics</td><td>QS0517</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K (50&micro;g/&micro;L)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14622</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Sets</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>Multi Speed Vortex</td><td>Kisker Biotech</td><td>MSV-3500</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Silvercrest</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNASEZAP</td><td>Sigma</td><td>R2020-250ML</td><td></td></tr><tr><td>アルミニウム 96 ウェルプレートシール</td><td>Sigma</td><td>Z721549-100EA</td><td></td></tr><tr><td>温度検証キット</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>QS0517</td><td></td></tr><tr><td>RapidMiner Studio Community 7.1.001</td><td>RapidMiner</td><td></td><td>Data Science Platform</td></tr><tr><td>Hybridisation oven</td><td>Hybaid (Thermo Scientific)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

乳房癌のアーカイブ材料を用いた多重 rna に基づく発現アッセイの最適化

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

アーカイブの組織、腫瘍の不均一性や新鮮凍結組織標本の欠如の核酸分解することができます世界中の病理学研究室でがん診断サービスに悪影響を。遺伝子増幅と式診断テスト アーカイブ素材またはサービス研究所への輸送を必要とする材料を使用してより堅牢で正確なテスト現在の臨床のワークフローに適応が必要です。我々 の研究チームは、Invitrogen™ QuantiGene™ のプレックスの試金 (Thermo fisher Scientific 社) Luminex xMAP®磁気ビーズの分岐 DNA (bDNA) 技術を使用してアーカイブの材料で RNA を定量化するの使用を最適化されています。本稿に記載されている遺伝子発現アッセイは、正確に解釈イメージング技術に固有の主観を省略するさまざまな分子サブタイプ乳癌に分類できる、小説、迅速、かつ多重の方法です。さらに、必要な材料の低入力、ために異種腫瘍は、ヘマトキシリンを使用してレーザー microdissected をすることができ、エオシン (H & E) 染色標本。このメソッドより良い患者管理と感染症のモニタリングを可能にする液体の生検で腫瘍の分類診断の可能性とバイオ マーカーの測定を含むアプリケーションの広い範囲を持ってください。さらに、アーカイブの材料のバイオ マーカーの定量測定は腫瘍学研究の回顧的な研究は、潜在的なバイオ マーカーと臨床成果を検証できる臨床的に注釈付きの素材のライブラリへのアクセスに便利相関。

この方法は、H &amp; E 染色 (図 1) の 40 の転写物の同時測定のため適用されている、microdissected (図 2) が著しく低い FFPE 素材。腫瘍を比較するとき受容体の状態 (図 3 a)、内腔と基底分子サブタイプ17腫瘍の分類と FN1、間葉系のマーカーの発現の正確な特性評価を示すこのメソッドを使用して、様々 な受容体の正と負のサブタイプにマッチさせたコントロール組織 (図 3 b)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig1.jpg"> 図 1: H &amp; E を用いた遺伝子発現によって汚された材料。発現プロファイルの関係は、汚された腫瘍セクションに比べて無染色腫瘍セクションから派生します。[ピアソン相関p-値 = 5.34E-26]。許可17で再現。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig2.jpg"> 図 2: FFPE 組織のレーザーマイクロダイ。(A) H &amp; E 染色スライド;(B) 免疫組織化学的染色法による ER 式の(C) HER2 免疫組織化学的染色;(D) レーザー顕微解剖膜スライドのセクション 20 μ m の無染色。黄色の矢印は、区画されていませんはっきりによる染色の欠如に侵襲性の腫瘍の領域を示します。(E) は 20 μ m のセクションは、関心のある分野の良い描写 H &amp; E と汚れます。白い矢印は、レーザー解離トレイルを示し、赤い矢印は、解剖時にレーザーの焦点を示しています。すべてのイラストが 10 倍の倍率で撮影されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig3.jpg"> 図 3: (A) 受容体の状態および (B) 間葉系マーカー、FN1 と比較すると乳腺腫瘍の発現は通常一致します。古典的な診断乳房癌のサブタイプは、HER2 あいまいな免疫組織化学染色免疫染色と蛍光現場の交配 (魚) を使用して、診断結果に従って定義されます。(A) HER2 および ER, 交配ベース法による測定 (B) FN1 の正規化された表現は、HER2 陽性、ER 陽性、TNBC の場合患者と比較して一致正常な乳房組織を示したものです。クラスカル ・ ウォリス検定 (K W χ2) を示します、HER2 の発現は有意 (p &lt; 0.05) HER2 肯定的なコホートで一致した正常組織ではなく, 腫瘍組織に高く、TNBC コホートで有意に低かった。ER の発現が ER 陽性、TNBC コホートで一致する通常のではなく, 腫瘍組織で有意に見つかりませんでした。FN1 は、HER2 と ER の肯定的なサブタイプの腫瘍組織に高く、TNBC のコホートにおいても腫瘍組織に大幅上昇するという傾向を示しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig4.jpg"> 図 4: 事例研究: 不均一性腫瘍。形態的に異なる腫瘍 microdissected、異なるサンプルとして扱われます。(A) マスター H &amp; E のセクションをスキャンします。(B、 C)10 倍と 40 倍の倍率は、各腫瘍形態の識別のためにそれぞれ。(D) の免疫染色 ER 10 倍の倍率で。(E) の免疫染色キ67 腫瘍 1 より高い分裂能を示す倍率 10 倍で。(F) 各腫瘍の免疫組織学的結果から期待される腫瘍間の比較的高いと等しい式を示す ESR1 遺伝子の発現レベルを正規化します。(G)、FN1 発現の増加を伴う高キ67 FN1、間葉系のマーカーの発現レベルを正規化染色より侵襲性の腫瘍の署名を示します。逆は FN1 発現の低下によって表される低悪性増殖の遅い腫瘍のように見える腫瘍 2 で観察されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

アーカイブの組織、腫瘍の不均一性や新鮮凍結組織標本の欠如の核酸分解することができます世界中の病理学研究室でがん診断サービスに悪影響を。本稿では、乳癌を分類する多重磁気ビーズ アッセイを用いたバイオ マーカーのパネルの最適化について説明します。

乳房癌のアーカイブ材料を用いた多重 RNA に基づく発現アッセイの最適化

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

この方法は、乳がん患者を既知の治療群と知られていない治療群に分類するために最適化に成功しています。このアッセイの高感度により、レーザーマイクロダイセクションを使用してさらに研究できる不均一なサンプルを同定できます。RNAベースのマルチプレックスアッセイの主な利点は、ヘマトキシリンおよびエオシン染色されたホルマリン固定パラフィン包埋アーカイブ材料を使用した結果の再現性であり、高分解能の出力とバイオマーカーの検証を可能にします。テキストプロトコルに記載されているように組織を調製します。解剖を開始するには、スライドの制限を設定し、顕微鏡のステージの動きを校正します。次に、4X対物レンズを使用して染色されたメンブレンスライドをスキャンします。メンブレンスライド上のマイクロダイセクション用のターゲット領域を選択し、囲みます。総面積を追跡します。適切なダウンストリームRNA解析には、少なくとも42平方ミリメートルが必要です。次に、定義されたパラメータでレーザー切断を開始します。次に、キャップリフト機構を使用して解剖された切片を取り出し、その切片を機械付属物に取り付けられたラベル付きチューブのディフューザーキャップにセットします。解剖された切片がキャップに取り出されない場合は、ターゲット領域の解剖を繰り返します。マイクロダイセクションの精度は重要なステップであり、キャップ上に存在するマイクロダイセクションがマークされたスキャン画像と一致することを常に確認する必要があります。必要な数の組織切片をそれぞれ別々のチューブに集め、組織サンプルの溶解に進みます。溶解には、各サンプルに2.4マイクロリットルの均質化溶液をプレ平方ミリメートルの組織領域に適用し、次にサンプルを最大速度で10秒間ボルテックスします。次に、サンプルを2, 500 gで5秒間スピンダウンします。次に、必要に応じてサンプルを1.5ミリリットルのチューブに移し、摂氏65度の振とうのある加熱ブロックに入れます。600rpmで12〜18時間振とうします。次に、ライセートを室温で5分間21, 000gで遠心分離します。透明な上清を新しいラベル付きチューブに慎重に集めます。組織の破片を移さないでください。上清液はマイナス80°Cで保存することができます。ハイブリダイゼーションベースのアッセイ用のすべての試薬を調製した後、磁気分離96ウェルプレートの最大90ウェルに25マイクロリットルの組織ホモジネートをロードします。25マイクロリットルのコントロールサンプルを3つの指定されたウェルにロードし、25マイクロリットルの均質化溶液をブランクとして3つのウェルにロードします。次に、透明なプラスチック製の圧力シールを使用して磁気分離プレートを密封し、プレートを摂氏54度のインキュベーターに18〜22時間振とうします。翌日、プレートをハンドヘルド磁気プレートワッシャーに取り付けてロックし、圧力シールを取り外して、磁気ビーズが落ち着くまで1分間待ちます。次に、洗浄を行います。プレートをシンクの上に置き、ティッシュペーパーを使用して静かに拭き取り、すべてのウェルに100マイクロリットルの1Xウォッシュバッファーをロードして15秒待ちます。このプロセスを3回繰り返して、洗浄ステップを完了します。最後の洗浄液を取り出した後、ウェルに50マイクロリットルのプリアンプ試薬をリロードし、アルミプレートシーラーでプレートをシールし、プレートを室温で800rpmで1分間振とうします。次に、プレートを摂氏50度で1時間振とう続けます。これが完了したら、別の洗浄手順を実行します。次に、ウェルに50マイクロリットルの増幅試薬をリロードし、プレートをアルミニウムプレートシールでシールし、室温で1分間、50°Cで1時間、さらに別の洗浄ステップで振とうインキュベーションを繰り返します。次に、ラベルプローブを最大速度で10秒間ボルテックスし、次に50マイクロリットルのラベルプローブを各ウェルに追加します。その後、プレートを再シールし、前と同じように振とうインキュベーションを繰り返し、続いて別の洗浄ステップを行います。次に、新たに混合したストレプトアビジンフィコエリスリン50マイクロリットルをウェルにロードし、室温600rpmで振とうインキュベーションを行い、続いてストレプトアビジン洗浄緩衝液を用いた洗浄ステップを行います。洗浄ステップが完了したら、各ウェルに100マイクロリットルのストレプトアビジン洗浄バッファーをロードし、プレートをアルミニウムプレートシールでシールし、プレートを室温で800rpmで3分間振とうします。最後のインキュベーションステップでは、マグネティックビーズアナライザーを起動し、装置が校正され、バリデーションプロトコルが実施されていることを確認してください。ソフトウェアで、[バッチ]タブから[既存のプロトコルを使用してバッチを作成]を選択して、新しい分析を追加します。次に、プレートレイアウトで、ウェルを不明またはブランクとして指定し、サンプルパネルでそれぞれにラベルを付けます。次に、リアクションプレートからアルミニウムシールを取り外し、プレートローダートレイを取り出して、プレートをアナライザーにロードします。次に、[リトラクト]をクリックし、[バッチの実行]をクリックしてアナライザーを開始します。読み取り後、プレートを取り出し、メーカーが推奨する磁気ビーズアナライザーを清掃します。分析するには、[バッチ結果] タブに移動します。それぞれの分析ファイルを選択し、csvファイルとしてエクスポートするオプションを使用してから、スプレッドシートソフトウェアを使用して平均と生のスコアを作成します。コントロールが予期される信号を表示していることを確認します。サンプルの生データを正規化し、データサイエンスプラットフォームを使用するか、定義されたアルゴリズムを使用してデータ分布を分析し、主成分分析を実行します。マルチプレックスビーズリーダーとアッセイの性能は非常に重要であり、貴重な患者サンプルの前に十分にアノテーションされたコントロールサンプルの段階希釈を実行することで、正しい結果が保証されます。属性については、正規化された遺伝子データのサブセットと、乳がんのサブタイプなどの名義変数を選択します。トレーニング済みで検証済みの分類アルゴリズムを適用して、未知のサンプルを特徴付けます。記載された方法は、H&E染色、マイクロダイセクション、高度に分解されたFFPE材料中の40の転写産物の同時測定に適用されています。この方法を使用すると、さまざまな受容体陽性および陰性サブタイプの腫瘍および適合対照組織と比較した場合に、間葉系マーカーFN1の受容体状態および差次的発現の正確な特性評価を示すことが可能である。腫瘍内の不均一性は、この方法を使用して特徴付けることができます。ER陽性腫瘍は、明確な腫瘍形態および有糸分裂活性を示す領域内でFN1の空間的差次的発現を示す。このビデオを見れば、ターゲットRNAのビーズへのハイブリダイゼーション、シグナル増幅、定量後に、組織溶解物から複数の遺伝子を直接測定する方法について十分に理解できるはずです。アッセイ感度により、レーザーマイクロダイセクション材料の使用が可能です。この手順を試行する際には、各アッセイの前に装置を校正し、貴重な患者サンプルを流す前に品質管理材料を使用して感度範囲を決定することを忘れないでください。アッセイワークフローは、臨床検査室に容易に適応できます。最大90サンプルのRNAプロファイリングを、2日間で12時間で実行できます。病理検査室での乳がん受容体の状態の測定には時間がかかり、経験豊富な病理医が必要です。このデジタル化されたマルチプレックスビーズベースのアッセイを使用すると、RNA発現を正確に定量できます。一次診断における生検におけるフラクショナルバイオマーカーの分析は、腫瘍の提示です。この方法論を幅広いバイオマーカーパネルとともに使用し、セクション全体を利用することで、ヘテロジェニックサンプルを同定します。この方法論を使用したアッセイの開発は汎用性が高く、サンプルのインプットが少なくて済みます。サンプルには、バイオマーカーの検証に重要な臨床注釈付きサンプルや、患者の監視や早期診断に重要なリキッドバイオプシーが含まれます。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

ここでは、サンプルの限られた量を扱う場合は特に、マイクロRNA（miRNA）の発現レベルのコストと時間効果のハイスループットスクリーニングのツールと​​してのマイクロ流体プラットフォームとの組み合わせで最適化された多重逆転写定量PCR（定量RT -...

ハイスループットマイクロRNAプロファイリング：最適化されたマルチプレックスフリューダイナミックArrayTMのIFCSでナノリッタースケールでの定量RT - PCR

細胞プロセスのシステム·レベルの理解を達成することは、現代の細胞生物学の目標です。我々はここでゲノム規模のRNAiライブラリーを用いた遺伝子の機能を調べるために、様々な細胞機能のエンドポイントのルシフェラーゼレポーターを多重化するための戦略について説明します。...

培養細胞における癌関連シグナル伝達を問い合わせるための多重ルシフェラーゼベースのスクリーニング·プラットフォーム

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乳癌細胞におけるエストロゲン調節マイクロRNAのプロファイリング

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miRNAを用いた乳がん組織におけるmiRNA発現の臨床病理学的解析<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション

HER2 のプロトコルは、非相互リンク、無料のホルマリン組織固定液を使用して低温保存とホルマリン固定の利点を結合する魚します。

ホルマリン固定パラフィン包埋標本を表す人間の病気の分子バイオ マーカーの貴重な情報源。実験に基づく cDNA ライブラリの準備プロトコル、最初に新鮮な冷凍 RNA をデザインおよび最適化組織からアーカイブされたマイクロ Rna の解析に格納された 35...

ホルマリン固定パラフィン包埋 RNA 試料を用いた回顧マイクロ Rna シーケンス: 相補的な DNA ライブラリの準備のプロトコル

RNAベースのアプローチを使用して、固形腫瘍組織の定量的免疫プロファイルを決定し、免疫腫瘍学バイオマーカー探索のための臨床コホートを活用することは、分子および情報学的プロトコルを介して記述されています。...

固形腫瘍の予知免疫モデリング

このレポートでは、自動スライドステーナーでのマルチプレックス免疫蛍光(mIF)アッセイの自動化プロトコルについて説明します。これは、標準的なハイスループット組織オートステイナーおよびホールスライド蛍光イメージャーでの空間プロテオミクスの高い再現性を実証しており、トランスレーショナルリサーチにおける多数の組織スライドにわたるカスタムmIFアッセイに最適です。...

トランスレーショナルリサーチのためのハイスループット自動マルチプレックス免疫蛍光アッセイ(英語)

このプロトコルは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片におけるタンパク質イメージングマスサイトメトリーによるマルチプレックスmRNA検出の方法論を詳述しています。...

デュアルモダリティ分子地図作成:マルチプレックスmRNA検出とタンパク質イメージングマスサイトメトリーの統合

このプロトコルは、マイクロRNAおよびマルチプレックスタンパク質を同時に検出および定量するためのホルマリン固定パラフィン包埋組織を用いたタンデム免疫蛍光ハイブリダイゼーションアッセイを記述している。...

新しい検出および定量法としてのロック核酸 in situ ハイブリダイゼーションによるマイクロRNA増幅と認識

学ぶレーザー顕微鏡解剖と多重磁気ビーズアッセイを用いた乳房癌のRNA発現解析。FFPEアーカイブ材料から高感度にバイオマーカーを検出し、治療群分類と腫瘍異質性評価を実現する方法です。

乳房癌のアーカイブ材料を用いた多重 RNA に基づく発現アッセイの最適化

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