乳房癌のアーカイブ材料を用いた多重 RNA に基づく発現アッセイの最適化
August 1st, 2018
アーカイブの組織、腫瘍の不均一性や新鮮凍結組織標本の欠如の核酸分解することができます世界中の病理学研究室でがん診断サービスに悪影響を。本稿では、乳癌を分類する多重磁気ビーズ アッセイを用いたバイオ マーカーのパネルの最適化について説明します。
この方法は、乳がん患者を既知の治療群と知られていない治療群に分類するために最適化に成功しています。このアッセイの高感度により、レーザーマイクロダイセクションを使用してさらに研究できる不均一なサンプルを同定できます。RNAベースのマルチプレックスアッセイの主な利点は、ヘマトキシリンおよびエオシン染色されたホルマリン固定パラフィン包埋アーカイブ材料を使用した結果の再現性であり、高分解能の出力とバイオマーカーの検証を可能にします。
テキストプロトコルに記載されているように組織を調製します。解剖を開始するには、スライドの制限を設定し、顕微鏡のステージの動きを校正します。次に、4X対物レンズを使用して染色されたメンブレンスライドをスキャンします。
メンブレンスライド上のマイクロダイセクション用のターゲット領域を選択し、囲みます。総面積を追跡します。適切なダウンストリームRNA解析には、少なくとも42平方ミリメートルが必要です。
次に、定義されたパラメータでレーザー切断を開始します。次に、キャップリフト機構を使用して解剖された切片を取り出し、その切片を機械付属物に取り付けられたラベル付きチューブのディフューザーキャップにセットします。解剖された切片がキャップに取り出されない場合は、ターゲット領域の解剖を繰り返します。
マイクロダイセクションの精度は重要なステップであり、キャップ上に存在するマイクロダイセクションがマークされたスキャン画像と一致することを常に確認する必要があります。必要な数の組織切片をそれぞれ別々のチューブに集め、組織サンプルの溶解に進みます。溶解には、各サンプルに2.4マイクロリットルの均質化溶液をプレ平方ミリメートルの組織領域に適用し、次にサンプルを最大速度で10秒間ボルテックスします。
次に、サンプルを2, 500 gで5秒間スピンダウンします。次に、必要に応じてサンプルを1.5ミリリットルのチューブに移し、摂氏65度の振とうのある加熱ブロックに入れます。600rpmで12〜18時間振とうします。
次に、ライセートを室温で5分間21, 000gで遠心分離します。透明な上清を新しいラベル付きチューブに慎重に集めます。組織の破片を移さないでください。
上清液はマイナス80°Cで保存することができます。ハイブリダイゼーションベースのアッセイ用のすべての試薬を調製した後、磁気分離96ウェルプレートの最大90ウェルに25マイクロリットルの組織ホモジネートをロードします。25マイクロリットルのコントロールサンプルを3つの指定されたウェルにロードし、25マイクロリットルの均質化溶液をブランクとして3つのウェルにロードします。
次に、透明なプラスチック製の圧力シールを使用して磁気分離プレートを密封し、プレートを摂氏54度のインキュベーターに18〜22時間振とうします。翌日、プレートをハンドヘルド磁気プレートワッシャーに取り付けてロックし、圧力シールを取り外して、磁気ビーズが落ち着くまで1分間待ちます。次に、洗浄を行います。
プレートをシンクの上に置き、ティッシュペーパーを使用して静かに拭き取り、すべてのウェルに100マイクロリットルの1Xウォッシュバッファーをロードして15秒待ちます。このプロセスを3回繰り返して、洗浄ステップを完了します。最後の洗浄液を取り出した後、ウェルに50マイクロリットルのプリアンプ試薬をリロードし、アルミプレートシーラーでプレートをシールし、プレートを室温で800rpmで1分間振とうします。
次に、プレートを摂氏50度で1時間振とう続けます。これが完了したら、別の洗浄手順を実行します。次に、ウェルに50マイクロリットルの増幅試薬をリロードし、プレートをアルミニウムプレートシールでシールし、室温で1分間、50°Cで1時間
、さらに別の洗浄ステップで振とうインキュベーションを繰り返します。次に、ラベルプローブを最大速度で10秒間ボルテックスし、次に50マイクロリットルのラベルプローブを各ウェルに追加します。その後、プレートを再シールし、前と同じように振とうインキュベーションを繰り返し、続いて別の洗浄ステップを行います。次に、新たに混合したストレプトアビジンフィコエリスリン50マイクロリットルをウェルにロードし、室温600rpmで振とうインキュベーションを行い、続いてストレプトアビジン洗浄緩衝液を用いた洗浄ステップを行います。
洗浄ステップが完了したら、各ウェルに100マイクロリットルのストレプトアビジン洗浄バッファーをロードし、プレートをアルミニウムプレートシールでシールし、プレートを室温で800rpmで3分間振とうします。最後のインキュベーションステップでは、マグネティックビーズアナライザーを起動し、装置が校正され、バリデーションプロトコルが実施されていることを確認してください。ソフトウェアで、[バッチ]タブから[既存のプロトコルを使用してバッチを作成]を選択して、新しい分析を追加します。
次に、プレートレイアウトで、ウェルを不明またはブランクとして指定し、サンプルパネルでそれぞれにラベルを付けます。次に、リアクションプレートからアルミニウムシールを取り外し、プレートローダートレイを取り出して、プレートをアナライザーにロードします。次に、[リトラクト]をクリックし、[バッチの実行]をクリックしてアナライザーを開始します。
読み取り後、プレートを取り出し、メーカーが推奨する磁気ビーズアナライザーを清掃します。分析するには、[バッチ結果] タブに移動します。それぞれの分析ファイルを選択し、csvファイルとしてエクスポートするオプションを使用してから、スプレッドシートソフトウェアを使用して平均と生のスコアを作成します。
コントロールが予期される信号を表示していることを確認します。サンプルの生データを正規化し、データサイエンスプラットフォームを使用するか、定義されたアルゴリズムを使用してデータ分布を分析し、主成分分析を実行します。マルチプレックスビーズリーダーとアッセイの性能は非常に重要であり、貴重な患者サンプルの前に十分にアノテーションされたコントロールサンプルの段階希釈を実行することで、正しい結果が保証されます。
属性については、正規化された遺伝子データのサブセットと、乳がんのサブタイプなどの名義変数を選択します。トレーニング済みで検証済みの分類アルゴリズムを適用して、未知のサンプルを特徴付けます。記載された方法は、H&E染色、マイクロダイセクション、高度に分解されたFFPE材料中の40の転写産物の同時測定に適用されています。
この方法を使用すると、さまざまな受容体陽性および陰性サブタイプの腫瘍および適合対照組織と比較した場合に、間葉系マーカーFN1の受容体状態および差次的発現の正確な特性評価を示すことが可能である。腫瘍内の不均一性は、この方法を使用して特徴付けることができます。ER陽性腫瘍は、明確な腫瘍形態および有糸分裂活性を示す領域内でFN1の空間的差次的発現を示す。
このビデオを見れば、ターゲットRNAのビーズへのハイブリダイゼーション、シグナル増幅、定量後に、組織溶解物から複数の遺伝子を直接測定する方法について十分に理解できるはずです。アッセイ感度により、レーザーマイクロダイセクション材料の使用が可能です。この手順を試行する際には、各アッセイの前に装置を校正し、貴重な患者サンプルを流す前に品質管理材料を使用して感度範囲を決定することを忘れないでください。
アッセイワークフローは、臨床検査室に容易に適応できます。最大90サンプルのRNAプロファイリングを、2日間で12時間で実行できます。病理検査室での乳がん受容体の状態の測定には時間がかかり、経験豊富な病理医が必要です。
このデジタル化されたマルチプレックスビーズベースのアッセイを使用すると、RNA発現を正確に定量できます。一次診断における生検におけるフラクショナルバイオマーカーの分析は、腫瘍の提示です。この方法論を幅広いバイオマーカーパネルとともに使用し、セクション全体を利用することで、ヘテロジェニックサンプルを同定します。
この方法論を使用したアッセイの開発は汎用性が高く、サンプルのインプットが少なくて済みます。サンプルには、バイオマーカーの検証に重要な臨床注釈付きサンプルや、患者の監視や早期診断に重要なリキッドバイオプシーが含まれます。
概要
この研究は、癌診断を妨げる可能性のあるアーカイブ組織における核酸分解と腫瘍の不均一性という課題に取り組んでいます。著者らは乳がんの分類を効果的に行うために、マルチプレックス磁気ビーズアッセイを最適化しました。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 腫瘍学
- 病理学
- バイオマーカー研究
背景
- アーカイブ組織における核酸分解は診断の正確性に影響を与えます。
- 腫瘍の不均一性は乳がんの分類を複雑にします。
- 新鮮凍結組織標本はしばしば入手できません。
- マルチプレックスアッセイは分類と感度を向上させることができます。
研究の目的
- 乳がん分類のためのバイオマーカーパネルを最適化する。
- アーカイブ組織を使用したアッセイの感度を高める。
- 高解像度の出力によって結果を検証する。
使用された方法
- レーザーマイクロディセクションによる組織サンプルの準備。
- バイオマーカー分析のためのマルチプレックス磁気ビーズアッセイ。
- マイクロディセクションされたサンプルからのRNA抽出。
- 遺伝子発現データの統計分析。
主な結果
- アッセイは乳がん患者を治療グループに正常に分類しました。
- 不均一なサンプルで高い感度が達成されました。
- 受容体状態の正確な特徴付けが実証されました。
- ホルマリン固定パラフィン包埋材料を使用した結果は再現可能でした。
結論
- 最適化されたアッセイは乳がん分類のための信頼できる方法を提供します。
- 高度に分解されたアーカイブサンプルの分析を可能にします。
- この方法は腫瘍生物学のさらなる研究を促進する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This multiplex RNA-based expression assay addresses a critical bottleneck in oncology biomarker validation by enabling accurate molecular subtyping of breast cancer from degraded archival FFPE tissue. By overcoming limitations of nucleic acid degradation and tumor heterogeneity, the method provides a robust, quantitative platform for retrospective biomarker validation and liquid biopsy applications. Its compatibility with clinical workflows and low input requirements support scalable implementation in pathology laboratories for improved patient stratification and disease monitoring.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantitative measurement of 40 transcripts in microdissected FFPE material.
- Operational Value: Supports functional target validation by characterizing receptor status and mesenchymal marker FN1 expression across breast cancer subtypes.
- Predictive Value: Facilitates biomarker validation in clinically annotated archival libraries, reducing mechanistic ambiguity in target selection.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible quantitative outputs from laser microdissected H&E-stained FFPE sections.
- Scalability: Enables multiplexed analysis of up to 90 samples over two days, supporting high-throughput biomarker screening.
- Platform Reuse: Adaptable to liquid biopsy applications and wider biomarker panels for continuous monitoring applications.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by enabling analysis of heterogeneous tumors via laser microdissection.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides quantitative biomarker measurements in archival material to support retrospective validation of clinical outcome correlations.
- Disease Relevance: Accurately classifies breast cancer into molecular subtypes, informing target selection and portfolio triage decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The assay integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical biomarker validation, enabling quantitative analysis of archival and liquid biopsy samples for oncology applications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via multiplexed transcript measurement in microdissected tissue.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized, reproducible RNA quantification from degraded FFPE material.
- Analytics: Enables data normalization, distribution analysis, and principle component analysis for comparative condition assessment.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by validating biomarkers in clinically annotated archival libraries.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for biomarker validation across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence through accurate receptor status characterization and differential expression analysis in heterogeneous tumors.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility using H&E-stained FFPE material with low input requirements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling retrospective biomarker validation and reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative biomarker measurement in archival tissue for clinical outcome correlation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in laser microdissection and hybridization-based assay workflows.
- Dependent on magnetic bead analyzer instrumentation and calibrated validation protocols.
- Necessitates cross-team standardization for sample preparation, lysis, and hybridization steps.
- Requires adaptation considerations for varying degrees of tissue degradation and heterogeneity.
- Practical limitation: Sensitivity range must be determined using quality control material before running precious patient samples.
