初期ニワトリ胚形態形成における物理的な力の役割を探る

この実験プロトコルの全体的な目標は、ex ovo実験を通じて、初期胚の脳の発達における機械的な力の役割を研究することです。この方法は、生物学的形態の生成である形態形成における機械的な手がかりの役割など、発生生物学と生体力学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、組織および生物レベルでの形態形成における機械的力の役割を特徴付けることができることです。

この手順を開始するには、70%エタノールを含む繊細なワイプを使用して、受精した特定の病原体を含まないホワイトレグホーン鶏の卵を洗浄します。次に、卵をホルダーに縦方向に配置します。その後、卵のインキュベーターを目標温度37.5°Cに設定し、湿度を48〜55%に保ちます。

卵を約40〜44時間、HH11〜13にインキュベートします。その後、卵を室温で約15〜30分間冷ましてから、70%エタノールで洗浄します。このステップでは、卵を下から割って、殻をそっと引き離し、内容物を150 x 15ミリメートルのペトリ皿に慎重に堆積させます。

胚側が上になるように、卵を割る間、卵を孵化したときと同じ向きに保ちます。使い捨てのパスツールピペットを使用して薄いアルブミンを取り除きます。鈍い端の鉗子を使用して、卵黄から濃厚なアルブミンを分離します。

卵黄の上部を軽くこすり落として、濃厚なアルブミンが取り除かれていることを確認します。次に、先端の細い鉗子を使用して、胚の上に濾紙リングを置き、リングの長軸と胚の長軸を一致させて中央に配置します。続いて、濾紙リングを囲む卵黄をハサミで切ります。

その後、リングと胚を卵黄から最初に卵黄が切断された部位に向かって斜め方向に引き抜きます。次に、室温PBSで2つの連続した100ミリメートル皿で胚をすすぎます。次に、35mmのシャーレに濾紙リングを入れます。

胚の背側を上にして、35mmのペトリ皿のもう一方の濾紙の上に置きます。その後、濾紙サンドイッチの上にステンレス製のリングをはめます。胚を傷つけないように注意してください。

次に、前に準備したCCMの3ミリリットルを各ペトリ皿に追加します。引っ張った毛細血管針を胚の上部に軽くすくい取ることにより、各胚のビテリン膜を切除します。次に、前端から始めて脊索に向かって、ビテリン膜を剥がします。

その後、35mmシャーレ8枚を150mmシャーレ1枚にセットし、水分飽和ワイプを敷き詰めて湿度を保ちます。次に、150mmのシャーレを密封可能なビニール袋に入れ、酸素95%とCO25%の混合ガスを袋に入れます。袋を密封し、摂氏37.5度のインキュベーターに入れます。

次に、インキュベーターから胚を取り出し、OCTシステムを使用して胚を画像化し、神経管のねじれ角を決定します。胚を光学顕微鏡に移し、10倍の倍率で視覚化します。200マイクロリットルのピペットを使用して、ペトリ皿から0.2ミリリットルのメディアを段階的に取り出します。

培地除去の各ラウンドの後に明視野画像を撮影して、胚に対する培地と空気の界面の影響を観察します。胚の表面張力がねじれを誘発するまで、培地の除去を続けます。OCTシステムを使用して胚を再度画像化し、制御胚と比較するための最終的なねじり角度を確立します。

心臓ループの方向を変更するには、一対の鉗子を使用して濾紙を裏返し、胚が腹側を上にします。次に、引っ張った毛細管を使用して内腔前膜にスリットを切り開き、機械的な力で心臓を右側から左側に押します。流体の表面張力をかけて、心臓を左側に保ちます。

次に、胚をさらに20時間インキュベートして、ねじれのキラリティーの変化を確認します。ここに示されているのは、HH11でVMが除去された収穫された胚です。同じ胚をVM除去後27時間インキュベートし、ねじれの減少を示しました。

これは、流体表面張力が印加されたときに脳のねじれを受けたのと同じ胚であり、これは同等の段階で正常な脳のねじれを受けた対照胚です。この手順を試みるときは、胚を傷つけないように注意することが重要です。この手順に従って、有限要素解析などの他の方法を実行して、物理的な力が形態にどのように影響するかを計算でモデル化できます。

したがって、ここで開発されたこの技術は、ニワトリ胚の形態形成のメカニズムに関する将来の研究への道を開きました。このビデオを見た後、in vitro培養用のニワトリ胚の採取方法、ビテリン膜の顕微手術による除去方法、ビテリン膜によって提供される力の再現方法、OCTおよび明視野イメージングによる胚の形態のモニタリング方法を理解できるはずです。