可視化と系統特異的マーカーと間葉系細胞脂肪細胞の微分の潜在性の定量化

この手順の全体的な目標は、系統特異的なタンパク質マーカーである脂肪酸結合タンパク質4を使用して、間質細胞の脂肪形成系譜への分化を視覚化および定量化することです。これは、まず目的の間質細胞を単離し、増殖させることによって達成されます。その後、間質細胞を回収し、標準的なin-vitro培養プレートに播種します。

数日間のインキュベーション後、細胞を脂肪形成分化培地で処理します。細胞を14日間インキュベートし、定期的に培地を交換します。分化後、細胞を固定し、脂肪酸結合タンパク質4に対する抗体で染色します。

自動化されたハイコンテントスクリーニング免疫蛍光顕微鏡を使用して、マイクロウェルプレート内の標識細胞の画像をキャプチャします。その後、専用の画像解析ソフトウェアを使用して、差別化を定量化します。従来のOil Red Oなどの色素を用いた脂肪分化の測定方法とは異なり、本動画で紹介するアッセイでは、系統特異的タンパク質である脂肪酸結合タンパク質4に対する抗体を用いて脂肪分化を確認しています。

これにより、脂肪形成分化に対応する遺伝子発現の変化を定量化します。このアッセイは、分化した細胞の割合、細胞あたりの蛍光シグナルの強度、細胞形態の変化など、豊富な情報を提供することができます。複数の特性を分析する機能により、さまざまな治療に応じた分化の潜在的な微妙な変化を特定することができます。

また、このアッセイは高いスループル能力を備えているため、高スループル薬物スクリーニングアプリケーションに最適です。DMEM/F-12基礎培地である完全ASC培地に細胞を再懸濁し、10%ウシ胎児血清、GlutaMAX、および抗生物質を補充します。96ウェルの培養プレートにピペットで入れ、ウェルあたり5000細胞です。

ドナーごとに8つの井戸が必要です。4つのウェルは制御培地を受け取り、残りのウェルは分化培地を受け取ります。各処理の 4 ウェルごとに、ノードの一次制御が行われます。

細胞を37度でインキュベートし、5%二酸化炭素の大気条件で4日間加湿します。これは、細胞が各ウェルでコンフルエントに成長できるようにするためです。4日目に、プレートをインキュベーターから取り出します。

各ウェルからメディアの半分を取り出します。インスリン、イソブチルメチルキサンチン、デキサメタゾン、およびインドメタゾンを添加した等量の完全なASC培地、または脂肪形成分化培地を同量加えます。プレートを37度でインキュベートし、5%二酸化炭素の大気条件で加湿します。

十分な分化に必要な期間は14日間です。この間、2〜3日ごとにメディア交換を行ってメディアを補充します。分化後、インキュベーターからプレートを取り出します。

各ウェルからすべての培地を慎重にピペットで取り出します。氷冷メタノールを添加して細胞を固定します。室温で5分間インキュベートします。

メタノールを取り除き、トリス緩衝生理食塩水で洗浄します。0.25%のカゼインブロッカーを追加してブロックします。室温で10分間インキュベートします。

カゼインを取り除き、トリス緩衝生理食塩水で洗います。抗FABP4抗体を抗体希釈バッファーで200倍希釈することにより、一次抗体ミックスを調製します。ノードプライマリコントロールとして予約されているウェルを除くすべてのウェルに混合物を追加します。

代わりに、これらのウェルに抗体希釈バッファーを添加してください。室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、トリス緩衝生理食塩水で細胞を一度洗浄します。

取り出し、新鮮なトリス緩衝生理食塩水を加え、ロッカーで5分間インキュベートします。このプロセスを 2 回繰り返します。Anti-Rabbit Alexa 488 second reantibody を抗体希釈バッファーで200倍希釈し、2つ目のreantibody mixを調製します。

細胞核を標識するDAPIを、最終希釈率1〜2000で添加します。混合物をすべてのウェルに加え、光退色を防ぐためにプレートをホイルで包みます。室温で30分間インキュベートします。

インキュベーション後、TBSで細胞を洗浄し、さらにロッカーで15分間の洗浄を2回行います。ウェルからすべてのバッファーを取り出し、細菌の増殖を防ぐために、0.4ミリグラム/ミリグラムのチメロサールを補充した保存バッファーを追加します。このバイオアッセイのイメージングには、自動ステージ、集束対物レンズ、フィルターを備えたハイコンテントスクリーニングマシンが使用されます。

正しいフィルターが配置されていることを確認します。最高品質のプレートの底を清掃します。A1を左上隅に配置して、プレートをステージにロードします。

プレート取得ウィザードを使用して、プレート番号、倍率、日付、実験条件、ラベリングの詳細など、実験に関する重要な情報を記録します。使用するマイクロウェルプレートの種類を選択します。ユーザーは、取得する井戸とサイトの数を選択できます。

画像化するすべてのウェルをグリッドを強調表示して選択します。ステージを最も明るい井戸に移動します。最も明るいウェルを選択すると、すべての画像が線形範囲にあるピクセルグレー値で取得され、したがって染色強度に正比例することが保証されます。

この手順を実行しないと、明るいウェルで撮影された画像は過飽和になる可能性があります。実験に適したチャンネルの組み合わせ、露光時間、およびZオフセットパラメータを選択します。FABP4およびDAPIのイメージングに使用されるフィルターは、染色の視覚化に使用される特定のラベルに対応しています。

FABP4の可視化には、480ナノメートルで励起し、560ナノメートルで発光するAlexa 488を使用しました。また、360ナノメートルで励起し、460ナノメートルで発光するDAPI色素を用いて、細胞核を可視化しました。Oil Red Oでラベル付けされたプレートでは、脂肪滴を明るい燃料透過光で視覚化しました。

また、Oil Red Oラベルも、575ナノメートルで励起し、630ナノメートルで発光するため、蛍光で視覚化されました。すべてのセットアップが完了すると、生物学的アッセイを取得する準備が整います。画像は自動的にオンラインサーバーに保存されるため、画像へのリモートアクセスが容易になります。

オンラインサーバーに保存されている画像の完全なセットには、リモートデスクトッププログラムを使用してアクセスできます。その後、MetaXpressソフトウェアを使用して画像を分析できます。セルスコアリングアプリケーションでは、DAPIなどのフィールド内のすべての核を検出するための波長を選択できます。

その後の波長を使用して、核、細胞質、または両方の細胞位置のいずれかで陽性マーカーを検出できます。脂肪酸結合タンパク質4(FABP4)は、脂肪形成系譜のマーカーです。FABP4の発現は、分化した脂肪細胞の核と細胞質に局在しています。

この生物学的アッセイでは、細胞スコアリングモジュールを使用してFABP4の発現を解析します。まず、DAPIチャネルを使用して細胞核を検出し、バックグラウンド上のサイズとシグナル強度のユーザー定義のパラメーターを使用します。FOOT Cチャンネルと、バックグラウンド上のサイズと信号強度のユーザー定義パラメータを使用してFABP4信号を検出します。

この生物学的アッセイでは、560ナノメートルの範囲で増殖するOil-Red-O標識脂肪滴を、MetaXpress缶モジュールであるTransflourで分析しました。この解析アルゴリズムは、DAPI標識核を使用して、ユーザーが指定した細胞サイズと染色強度の基準を満たす全細胞を検出します。また、ピットのサイズと強度も指定し、この場合、細胞核のすぐ近くにある脂肪滴を検出します。

脂肪滴のサイズ、染色強度、細胞あたりの数に関する情報は、Transflourアッセイによって記録されます。オイルレッドOラベルは、一部の細胞から漏れ出したり、溶解したりしたため、実際の分化量が制限され、混乱する可能性があることに注意することが重要です。DAPI、核染色剤、およびFABP4で標識された、早期および後期継代細胞、対照細胞、および分化細胞の代表的な画像が、マージおよびセグメンテーション画像とともに示されています。

セグメンテーション画像は、分化したセルを緑のオーバーレイで、未分化のセルを赤色のオーバーレイで表示します。FABP4を発現する細胞の割合は、脂肪形成分化能の尺度として使用されました。FABP4発現細胞の有意な増加は、早期および後期継代細胞における脂肪形成分化に伴って観察された。

早期継代細胞は、後期継代細胞よりも有意に大きな分化の増加を示しました。DAPIとOil Red Oの代表的な画像が、マージ画像とセグメンテーション画像と一緒に示されています。セグメンテーション画像は、すべての核を緑色のオーバーレイで、Oil-Red-O染色された脂質液滴を赤色のオーバーレイで示しています。

細胞あたりのOil Red O染色の面積は、脂肪形成分化能の尺度として使用されました。オイルレッドO染色面積の有意な増加は、脂肪形成分化に伴って観察されました。早期継代細胞は、後期継代細胞と比較して、細胞あたりのオイルレッドO染色の面積が大きかった。

ウェスタンブロットを行い、分化した早期および後期継代ASCのFABP4タンパク質発現レベルを分析しました。FABP4バンドの光学密度を全タンパク質ローディングコントロールの比率として半定量的に分析したところ、FABP4免疫標識は早期継代で有意に増加し、後期継代分化細胞では程度は低いが増加することが示されました。このビデオをご覧いただくことで、幹細胞を脂肪細胞系譜に分化させる方法、脂肪原性遺伝子特異的マーカーである脂肪酸結合タンパク質4を用いた免疫蛍光染色の実施方法、そして最後に、脂肪酸結合タンパク質4に免疫陽性の細胞から関連するすべての形態学的特徴を画像化し、解析する方法について理解しているはずです。

このビデオがあなたの研究に役立つことを願っています。