Name: アスペルギルス症では実験的肺真菌負担を決定する組織の定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 学ぶ組織学的定量法でマウスの侵襲性アスペルギルス症における肺真菌負荷を評価する方法です。既存の組織サンプルを利用でき、qPCRと同等の結果を得ながら動物数を削減できます。

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この研究は、によって、インディアナ大学の医学研究の強化費と NIH NIAID 1R03AI122127-01 によって部分的に支えられました。N. a. の部分的サポートされてこの期間中に免疫学者のアメリカの協会から免疫学フェローシップのキャリアによって。

動物のすべてのプロシージャは、動物愛護とインディアナ州立大学の使用委員会、インディアナ大学医学部のホストのキャンパスによって承認された-テレ ホート。
1. 感染症のためA. fumigatus分生子の準備
<ol><li>作業中に換気の発煙のフード、900 μ L 細胞培養グレード水 (CCGW) にA. fumigatus 293 原液の 125 μ L を追加します。麦芽エキス寒天培地 (MEA) 板ピペットと接種ループと均等にソリューションを転送します。</li>
	<li>24 の ° C、少なくとも 14 日間、28 日以上で暗闇の中で真菌のプレートを格納します。</li>
	<li>上記9としてガラス製のビーズを使用して分生子を収穫します。</li>
	<li>注ぐ 1.5 g 0.5 mm のプレートの上にガラス製のビーズとビーズが分生子を抽出するために被覆されるまで前後軽く傾斜それ。15 mL コニカル チューブ ビーズ/胞子混合物を収集します。5 mL ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) と渦を中断します。</li>
	<li>診断 DPBS の上澄みの 50 倍希釈の分生子をカウントします。図 1に示す領域で分生胞子の数をカウントし、濃度を計算する方程式 1を使用します。 #Conidia × 希釈ファクター × 104= 胞子/mL (式 1) 注: 追加の 4 x 4 正方形の角の部分と思われる、式 1の #Conidia として使用されるこれらの地域の平均値を持つ。</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig1.jpg"> 図 1: 検定代表エリア分生胞子を数えるために使用 (ボックス、矢印)。
<ol start="6"><li>ごと滅菌生理食塩水 (DPBS) 望ましい集中、1.0 x 108分生胞子/mL 分生胞子液の準備 50 μ L 5 x 106分生胞子/50 μ L. で感染を取得すると分生胞子懸濁液を希釈 ' n + 2' ピペッティングのアカウントに感染するマウスエラーです。 注: 標準菌収穫と準備/ろ過代わりに使用される10があります。吸引の最小限の小/水溶性菌糸抗原と分生胞子サンプルが得られるように、ガラスビード法が適しています。</li>
</ol>2. 免疫抑制と感染マウスモデルの
<ol><li>7-10 週齢のマウスを使用します。 注: BALB/c、C57BL/6 (B6)、好酸球欠損 (ΔdblGATA, balb/c 背景) と γδ T 細胞欠損 (TCRδ-/-、B6 背景) マウスはこの研究のために使用されました。各実験、年齢し、性別をマッチさせた、(男性と女性) のマウスはグループごとに使用されました。</li>
	<li>45 ° 外側右下の象限に滅菌生理食塩水で 0.1 mL (0.5 mg) 反-mouse-Ly-6 G 抗体の腹腔内 (IP) 注入を介して好中球を使い果たす (実験的スケジュールでは、図 2を参照)。</li>
	<li>24 h 後、50 で中断 106A. fumigatus胞子 x 5.0 と吸引によって、マウスに感染 μ L 滅菌生理食塩水 (手順 2.4 2.10 参照) 前述したように11。本研究で用いた DPBS で 5 mg/kg キャスポファンギン ジアセテートなど抗真菌剤と動物のサブセットを注入、感染 (毎日、図 2を参照)。</li>
	<li>獣医麻酔機を使用して 99.9% イソフルランとマウスを麻酔します。<ol>
<li>大便と小便をキャッチする誘導室の床にペーパー タオルを配置します。</li>
		<li>誘導チャンバーにマウスを置き、蓋を固定、2 分の 30 5% イソフルラン気化器に設定 s。 注: 麻酔下に合計時間は 5 分もかかりませんので、獣医軟膏は使用されません。</li>
		<li>気化器を 30 に設定最大値の半分に減らす s。</li>
	</ol>
</li>
	<li>確認呼吸、運動の不足、つま先ピンチ刺激への応答の欠如マウスは正しく観察することによって麻酔を鈍化しました。</li>
	<li>誘導室と傾斜基板上の場所から、マウスを削除します。その背中を板にマウスを置きます。その上顎中切歯がゴムバンドで軽く拘束された下顎前歯部は優しく金属ワイヤーで拘束されたことを確認します。</li>
	<li>慎重に小さな鉗子と舌のベースの分生胞子/PBS を懸濁液の 50 μ L をピペット完全拡張子で舌を保持します。</li>
	<li>完全な拡張子; で舌を保持します。急速な呼吸および誤嚥の明確なクリック ノイズを聞く。20 は、s または懸濁液は完全に吸気まで。</li>
	<li>傾斜基板からマウスを取り外し、観察用ケージをそっと置き。</li>
	<li>以下の吸引、マウスが意識を取り戻す 1 分モニター内マウス完全に意識し、ケージの周りに歩くことができるまで。動物は 21 ° C で収容され、肺が収穫されるまで、1 日 2 回監視する必要があります。</li>
	<li>好中球 (手順 2.2) 24 h 後感染症 (図 2) の枯渇を繰り返します。</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig2.jpg"> 図 2: 実験的スケジュール。この図は、以前の文書8から変更されました。
3. 収穫とマウスの肺の組織学的解析のための保全
<ol><li>深く 390 mg/ml ペントバルビ タール ナトリウム ソリューション IP の 0.1 ml の致命的な線量を持つ動物を麻酔します。</li>
	<li>安楽死をピンセットで自発呼吸の欠如と手足刺激に対する反応の有無を観察することによって確認します。安楽死、一度 70% エタノール消毒すると死体をスプレーします。</li>
	<li>吸収パッドで覆われている発泡ボードに死体を配置します。 注: 死体は、発泡ボードにすべての 4 つの手足を固定ピンでその裏に配置する必要があります。</li>
	<li>慎重にはさみを使用して上位胸の空洞を開きます。肺と心臓を公開するために胸郭を切り取る。灌流のために下大静脈をカットします。血管を切断し、臓器穿刺を避けるため。</li>
	<li>ゆっくりと 25 G 針を 45 ° の角度で心臓の右心室に冷たい DPBS 5 mL で灌流します。10% ホルマリン 5 mL で灌流を繰り返します。</li>
	<li>慎重に気管を公開し、周囲の脂肪パッドをデタッチします。注意を払い、気管を刺さない。余分な結合組織が完全に進む前に気管を視覚化するために削除されますを確認します。一度気管を公開すると、昇格する気管の下で鉗子を配置します。</li>
	<li>25 G の針を使用して上部気管に小さな穴を突きます。 注: 全体のカニューレが気管内に収まるように、穴を配置必要があります。気管の破裂を避けるために注意を使用します。</li>
	<li>穴から肺に向かって、カニューレを挿入します。カニューレを気管に緩く巻きつけ手術スレッドで固定します。 注: 気管が破裂すると場合に、過去の可能な限り気道で気管カニューレが挿入されるかもしれません。</li>
	<li>注射器を使用して、1 mL のカニューレを通して 10% ホルマリン バッファーを有する肺を膨らませます。肺のインフレ率が表示されることを確認します。そうでない場合は、カテーテルを調整しを繰り返します。肺が膨張すると、一度すぐに注意してカニューレを取り外し、安全に気管を封鎖するねじ締め。 注: 場合は気管が破裂して、肺が膨張することはできません、肺はまだ収穫されるかもしれないが、これは適切な固定を防ぐことができます。</li>
	<li>慎重慎重にスレッドで軽く持ち上げながら鉗子で気管の結合組織を切断することによって気管と肺に胸から取り外します。バッファーを 10% ホルマリン 15 mL と 50 mL の円錐管に肺や気管を配置します。チューブ外スレッドの一方の端を置き、キャップをシールします。定着剤のサンプルが完全に水没するチューブを反転します。</li>
	<li>常温 24 時間少なくともまたはさらに処理までサンプルを格納します。 注意:ホルマリンは危険です。ゴーグルとフェイス マスクを含む適切な個人用保護具を着用します。サンプルを処理するときに化学のフードの下で動作します。</li>
</ol>4. 収穫と DNA 真菌負担のマウス肺の保全
<ol><li>別のマウスに前述の手順 3.1 3.5。</li>
	<li>ゆっくりと 25 G 針、10 ml 45 ° の角度で心臓の右心室に冷たい DPBS の灌流します。</li>
	<li>ハサミで肺を切除し、ラベル付き 1.5 mL チューブに配置します。</li>
	<li>さらに処理まで-80 ° C で肺を格納します。</li>
	<li>前述の (埋め込み、区分)、製造元のプロトコル (材料の表を参照) によると、標準的な手法を使用します。</li>
</ol>5. 顕微鏡とイメージング
<ol><li>定量化するイメージング プログラムを開く (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>光学顕微鏡を使用して、スライド (対物レンズ 10 倍) をステンド グラス GMS の少なくとも 4 の異なるフィールドを取得します。画像が同じような組織の密度と肺内感染した気道の代表であることを確認します。 注: 密度と菌糸の巣の分布表示コントロール群と実験群の間に著しく異なった場合追加フィールドを取得ことがあります、または全肺セクションの GMS のエリア イメージを作成する可能性があります (4 X 目標)。必要に応じて、シリアル肺切片ヘマトキシリンとエオシン、上肺 (同等組織形態によって識別される) の同じ領域の画像を取得します。</li>
	<li>必要に応じて、画像にスケールバーを追加し、定量化する画像を保存します。、[編集] &gt; 追加/編集校正マーク &gt; メニュー: 線の太さ、色、スケール バーのサイズを選択 &gt; スケール バーが配置される画像をクリックします。メニューを閉じるし、編集を選択 &gt; マージ &gt; マージ校正マーク &gt; ファイルの [名前を付けて保存を選択 &gt; ファイル名を指定して保存します。</li>
</ol>6. 画像処理プログラムを使用して真菌の負担 (図 3) を計算するには
<ol><li>画像処理プログラムを開きます。ファイルを選択 &gt; を定量化するためのサンプル フォルダー &gt; イメージ (図 3 a)。画像を選択 &gt; タイプ &gt;「RGB スタック」(図 3 b) に変換します。</li>
	<li>3 つの指定されたイメージ (図 3 b) の 2 番目の選択に右矢印キーを使用します。「コントロール + シフト + T」をヒットさせる「しきい値」メニューの設定調整器 (図 3)。参照として元 .tiff または .jpg 画像を検索して映像プログラム (図 3) を開きます。</li>
	<li>左端に上のスライダーを引っ張るし、下のスライダーを調整 (赤) で選択領域が (通常に至る 130-160 (図 3) のスライダーの右側に示すよう顕微鏡画像の代表になるまで。</li>
	<li>選択すると、一度プレス「設定」&gt;"OK"(図 3 D)。「分析」を選択 &gt;「測定の設定」&gt;「面積、面積率、制限しきい値、表示ラベル"をチェックし、、既定値として下の設定 (ドロップ ダウン メニューと小数点以下の桁数) を残し &gt;"OK"(図 3 D).</li>
	<li>ホワイト スペースまたは背景の汚損の重要な地域エリアまたは多角形ツールを使って適切な組織の選択除外されるかもしれない。</li>
	<li>最後に、「分析」を選択 &gt;「測定」(データ ウィンドウが表示されます、または windows タスク バー上のタブは、「結果」はラベル表示されます) (図 3E)。グラフのためのデータ解析プログラムにデータを転送および統計分析。</li>
	<li>各肺サンプルの 4 つの領域率の平均値を入力します。5-8 サンプルは、グループ間に有意差を検出するには不十分です。2 つの実験群を比較すると、対になっていない学生のtを実行-意義を判断するテスト。</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig3.jpg"> 図 3: GMS 組織の各ステップの代表スクリーン ショット フィールド定量化します。(A) ファイルを選択 &gt; を定量化するためのサンプル フォルダー &gt; 選択イメージ。(B) 画像の選択 &gt; タイプ &gt;「RGB スタック」に変換します。右矢印キーを使用して、2 番目の 3 つの特定の画像を選択します。(C) ヒット「コントロール + シフト + T」「しきい値」メニューの設定調整を持ち出す。参照として元 .tiff または .jpg 画像を検索して写真ビューアー プログラムで開きます。ずっと左 (赤) で選択領域が (通常に至る 130 160 示されるスライダーの右側に顕微鏡画像の代表になるまで下のスライダーを調整する上部のスライダーを引っ張る。(D) 選択したプレス「設定」&gt;"OK"。「分析」を選択 &gt;「測定設定」&gt;「面積、面積率、制限しきい値、表示ラベルに」をチェックし、既定値として下の設定 (ドロップ ダウン メニューと小数点以下の桁数) を残し &gt;"OK"。(E) 最後に選択「分析」&gt;「測定」(データ ウィンドウが表示されます、または windows タスク バー上のタブは、「結果」をラベル表示されます)。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
7. DNA 真菌負担
<ol><li>-80 ° C から肺を削除し、少なくとも 4 時間のため凍乾 (一晩最適です) または凍結乾燥システムによって完全に乾燥するまで。</li>
	<li>肺が乾燥すると、DNA 抽出バッファー (0.1 M NaCl, 10 mM EDTA pH 8.0、10 mM トリス塩酸 pH 8.0、および 0.5 %sds) を準備します。</li>
	<li>あらかじめ温めて 60 ° C の水浴の準備の DNA 抽出バッファーを配置します。また、フェノールを配置: クロロホルム: イソアミル アルコール (25:24:1) 50 mL コニカル チューブの分離を可能にします。</li>
	<li>2 mL スクリュー キャップ チューブ 0.2 ml のガラス製のビーズに凍結乾燥肺を配置します。微粉末となるまで、15-30 秒の乾燥肺組織を挽くビード ・ ビーターを使用して。</li>
	<li>各管と渦にも 0.8 mL ウォーム DNA 抽出バッファーを追加します。さらに 15 分間インキュベートする前に各チューブ 65 ° C ビーズお風呂し渦で 15 分間、インキュベートします。インキュベート後、渦とし遠心分離機 25,000 x g で 10 分間のチューブします。</li>
	<li>各サンプルのラベルを 1.5 mL チューブの 3 セットとチューブの 1 つのセットに上澄みの最上位のレイヤーを転送します。水性トップ層をピペッティングしながら中間層を妨害を避けるために注意を使用します。</li>
	<li>フェノール: クロロホルム: イソアミル アルコールの等しいボリュームを追加し、よく混ぜます。チューブの 2 番目のセットに上位層をピペットで移す前に、15 分 25,000 × g で遠心分離します。</li>
	<li>クロロホルム: イソアミル クロロホルムの等量を加えてよく混ぜ 25,000 x g で 10 分間上層を慎重にピペットで遠心分離機のチューブの 3 番目のセットに。</li>
	<li>追加 500 μ L のイソプロパノール 50 μ L NaoAc (pH が 5.2)、ミックスと 10 分間室温でインキュベートするサンプルを許可します。30 分間 25,000 × g で遠心分離し、上清をデカントします。</li>
	<li>25,000 x g デカント エタノールに 750 μ L 氷冷 70% エタノールや 5 分間遠心分離で DNA の餌を洗浄し、40 分間ヒューム フードのチューブで空気にペレットを乾燥を許可します。</li>
	<li>TE バッファーの 300 μ L の乾燥ペレットを再懸濁します。 注: DNA は定量化されるまでの-20 ° C で保存されるかもしれない。</li>
	<li>分光光度計を用いた DNA の定量化し、qPCR 分析用各 DNA のサンプルの 0.2 μ g/μ L の 100 μ L を準備します。</li>
	<li>真菌 18S rDNA のプライマー、DNA サンプルの 1 μ g と前述したように 3 通標準 qPCR を実行し、変更されたプローブ クェンチャーのプローブを設定します (5'-/56-ファム/AGC CAG CGG/禅/CCC GCA AAT G/3IABkFQ/3 ')12,13。</li>
	<li>A. fumigatus genomic DNA から標準曲線を準備し、各 pg 菌 DNA の濃度を計算する平均のレポーターを使用してサンプルを染める Ct 値。</li>
	<li>平均値の標準誤差との真菌 DNA の pg/μ をプロットします。学生のtを実行-テストの意義を判断する分析。 注: としてより少なく有毒な代わりにここで使用されるフェノール クロロホルム DNA 抽出、カラムベース DNA 抽出キットを使用することができます。</li>
</ol>

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

この資料の目的は、画像解析と定量化のため肺の GMS 染色組織切片を用いた ia マウスにおける肺真菌負担の決定法を導入することだった。本研究では、治療では抗真菌薬で β グルカン合成対象のキャスポファンギン14改善しなかった生存率や好中球減少症 IA8野生型マウスにおける真菌の負担。しかし、γδ T 細胞や好酸球のない場合は、生存と真菌の負担改善。我々 の研究の結果はまたと比較して広く使われている真菌 DNA qPCR 法6GMS 真菌負担による同等の結果可能性があります示した。
GMS 真菌負担定量化を利用するいくつかの利点があります。最初に、プロセスは、重要な違いを決定するために必要な実験の数を減らす可能性のある既存の組織標本を利用できます。第二に、本研究では少ない動物 GMS 真菌負担定量化真菌 DNA (図 6,図 7) の qPCR と比較して有意差を達成するために必要があります。第三に、qPCR による異なる分離株における真菌の負担の比較は、リボソーム DNA コピー数15で分離依存性の違いによる影響は。対照的に、肺真菌増殖の相対的なレベルが真菌の負担を定める GMS 定量化はコピーの数によって影響を受けません。したがって、GMS 定量化の fungal 重荷用は脊椎動物の使用を減らす、rDNA コピー数の事前確定を必要としません。最後に、真菌の形態を変更する、ほかキャスポファンギン療法真菌断片化が増加し、人工的に肺乳剤12,16 からコロニー形成単位の分離測定と真菌の負担が増す可能性があります。 ,17。したがって、GMS 真菌の負担の定量化は、他の一般的に使用される方法と固有のいくつかの制限を回避できます。
ただし、GMS の定量化および/またはこの研究の限界は、注意してください。まず、著者匹敵する, 各実験群の肺の中で菌糸の生育分布を想定し、客観的フィールド x 全体の肺に真菌の負担の代表的な測定として 4 代表 10 から定量化をこうして使用(図 6 b)。それは、いくつかのインスタンスで相対分布、サイズ、および菌糸の巣の密度が十分に互いに異なるため真菌の負担と qPCR 法によるこのメソッドと等価と異なって表示される可能です。ただし、追加 4 X 客観的フィールドを使用して全肺セクション定量化の結果と同様に、統計的に有意な差 (図 6) の少ない。この計量結果の標準誤差は、客観的かつ最適な分野で増加の背景 X 4 菌糸解像度減少の可能性が高いため、この戦略とともに増加しました。そのため、高倍率の少ないフィールドの代表的な定量化が好ましいです。第二に、のみ 1 つ、中央のセクションは、各サンプルに使われました。それは可能、真菌の分離に基づくまたはマウス系統を使用する菌糸の伸長の不均一な分布のいくつかの研究があります。それらのインスタンスでより代表的な負荷を取得する各パラフィン ブロックの追加セクションを定量化する必要があります。第三に、ムチン (すなわち、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症 (ABPA)18または嚢胞性線維症 (CF)18で定量化気道真菌の増殖)、実質的な生産と GMS の反応を誘発する実験で多糖類が豊富なムチン19非特異的 GMS + 結果をもたらす、従って高い真菌負担を支持していくつかのサンプルを傾斜します。IA の好中球減少症モデルだけは、この研究で使用された、ので、他の免疫有能または抑制のモデルの使用がより少なく対等の結果で不可能です。これらの警告にもかかわらず GMS 定量化 fungal 重荷の決定に匹敵する技術の提供し、さらなる研究の継続的な利用可能性がありますさらに一貫性のある、信頼性の高い、費用対効果としてこの手法の有用性を検証します。

IA は免疫抑制療法や慢性感染症1,2のための先天性または後天性の免疫不全症の影響を受けやすい個人に発症する日和見感染です。肝臓、腎臓、心臓、コウジカビの fumigatusのいくつかのインスタンスの普及では、肺に発生する主な感染は、しばしば、脳が発生する、重度の疾患と高を伴う菌糸の広範な組織への浸潤の結果死亡率1,2の料金です。また、既存の pharmacotherapies の有効性は限られて、環境3抗真菌薬耐性菌の出現によってさらに弱体化される場合があります。したがって、開発を促進するため真菌の病原性およびホストの病理学のメカニズムや侵襲性真菌性疾患の増悪を理解する重要です。
マウスモデルのまま彼らは真菌の病原性遺伝子の役割を評価し、ホスト免疫エフェクター設立とA. fumigatus 体内4、5の成長のために研究者を許可する IA の解明のために重要です。したがって、複数の戦略が効果的に定量化や実験動物6、7のグループで真菌の負担を比較するために考案されています。これらの戦略を含む文化ベース、生化学、免疫、または qPCR のメソッドは、それぞれ異なる長所と短所を持つ。さらに、これらの各メソッドは、免疫エフェクター機能、遺伝子発現解析および比較病理7の評価を犠牲にしたもののほか動物のサブセットの献身を含みます。したがって、IA の包括的な研究は頻繁にかなりのコスト研究動物の重要な番号を要求します。したがって、複数の解析のための動物組織を用いた実験的時間、動物のコスト、および倫理的な考察を減らす効果的な戦略は、非常に貴重な7です。
このレポートでは、GMS の IA とマウスの実験群間相対真菌負担の比較のため組織切片の染色の定量化を記述する方法を導入する.データ解析、画像取り込みと処理、組織収穫感染する真菌の培養からの各ステップで詳しく説明します。GMS の定量化による真菌の負担は、qPCR ia、好中球減少症モデルおよび IA8キャスポファンギン処理野生型または好酸球欠損マウスと比較しました。GMS の定量化と qPCR 真菌 DNA の類似を示した。GMS の定量化が ia、マウスの相対的な真菌負担の比較の補足か代替方法として組織学的分析に従事している研究者に有用である可能性があります、最終的にコストと研究における動物の使用を減らすことができますが示唆されました。複雑な機構の研究。

<table><tbody><tr><td>Aspergillus fumigatus 293 ストックソリューション</td><td>菌類遺伝学 ストックセンター</td><td>FGSC #A1100</td><td></td></tr><tr><td>HyPure 細胞培養グレード 水</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>SH30529.03</td><td></td></tr><tr><td>麦芽エキス</td><td>MP Biomedicals</td><td>2155315</td><td>White Powder</td></tr><tr><td>BD&nbsp;BBLアシディカーゼ脱水培養培地:ペプトン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>L11843</td><td></td></tr><tr><td>デキストロース(D-グルコース)無水(粒状粉末/認定ACS)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>D16-3</td><td></td></tr>フィ<tr><td>ッシャーバイオ試薬寒天、粉末/フレーク、フィッシャーバイオ試薬</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>オートドライキャビネット</td><td>上海ハスック機器製造有限公司</td><td>HSFC160FD</td><td></td></tr><tr><td>1300 シリーズ クラス II、タイプ A2 生物学的安全キャビネット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>1375</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mm ガラスビーズ</td><td>BioSpec 製品</td><td>11079105</td><td></td></tr><tr><td>15 ml コニカルチューブ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td># 0267110</td><td></td></tr><tr><td>ライカモデル DME 顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>13595XXX</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>D8662-500ミリリットル</td><td></td></tr><tr><td>1.5ミリリットルチューブフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>#05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>BDプレシジョングライド&nbsp;シリンジ針、ゲージ27、L 1/2インチ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z192384</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスLy-6G抗体</td><td>BioXCell</td><td>BP0075-1</td><td>クローン1A8</td></tr><tr><td>カスポファンギン ジアセテート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0425</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein アニマルヘルス</td><td>1169567762</td><td></td></tr><tr><td>非再呼吸テーブルトップ 獣医麻酔器</td><td>Supera Anesthesia Innovations</td><td>M3000</td><td></td></tr><tr><td>ピュアライン酸素濃縮器</td><td>Supera麻酔革新</td><td>OC8000</td><td></td></tr><tr><td>傾斜板拘束</td><td>インディアナ州立大学施設管理</td><td>カスタムメイド</td><td></td></tr><tr><td>ギルソン&nbsp;ピペットマンクラシック200mlピ</td><td>ペットフィッシャーサイエンティフィック</td><td>F123601G</td><td></td></tr><tr><td>ペントバルビタールナトリウム(フェイタルプラス)</td><td>ボルテックファーマシューティカルズ</td><td>0298-9373-68</td><td></td></tr><tr><td>汎用広先端鉗子</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>10-300</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド&nbsp;標準解剖はさみ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-951-20</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド汎用湾曲鉗子</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>10-275</td><td></td></tr><tr><td>エチルアルコール-200プルーフ</td><td>PHARMCO-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド吸収性アンダーパッドフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>14-206-63BD</td><td></td></tr><tr><td>プレシジョングライド&nbsp;シリンジ針、ゲージ25、L 1インチ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>サイエン</td>ティフィック Z192406 <td></td></tr><tr><td>オールプラスチック Norm-Ject シリンジ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-817-30</td><td></td></tr><tr><td>IV CATH ANGIOCATH 22GX1GIN 50B</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>NC9742754</td><td></td></tr><tr><td>ホルマリン溶液、中性緩衝液、10%</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>50 ml コニカルチューブ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック 339652</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Embedding Cassettes II in</td><td>Tube Packs Fisher Scientific</td><td>B1000729</td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest&nbsp;Histoplast Paraffin Wax</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-900-700</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てベース金型</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-554</td><td></td></tr><tr><td>Reichert Jung Histocut 820 ミクロトーム</td><td>Labequip.com</td><td>31930</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>Precision Scientific</td><td>66630-23</td><td></td></tr><tr><td>CO2 インキュベーター</td><td>Fisher Scientific</td><td>116875H</td><td></td></tr><tr><td>シルバーステイン (修正GMS)キット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT100A-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC410530250</td><td></td></tr><tr><td>Frosted Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest Superslip Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-89</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal XYL</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-050-262</td><td></td></tr><tr><td>オリンパスプロビスAX70顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>オリンパス-AX70</td><td></td></tr><tr><td>U-PHOTOユニバーサルフォトシステム</td><td>オリンパス</td><td>OLYMPUS-U-PHOTO</td><td></td></tr><tr><td>U-MCB-2 マルチコントロールボックス</td><td>オリンパス</td><td>OLYMPUS-U-MCB-2</td><td></td></tr><tr><td>U-PS電源ユニット</td><td>オリンパス</td><td>オリンパス-U-PS</td><td></td></tr><tr><td>FreeZone 1リットルベンチトップ凍結乾燥システム</td><td>LABCONCO</td><td>7740020</td><td></td></tr><tr><td>マキシマC&nbsp;プラス&nbsp;真空ポンプ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>01-257-80</td><td>排気量 - 6.1 cfm</td></tr><tr><td>1-ブタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A383-4</td><td></td></tr><tr><td>AMRESCO&nbsp;フェノール-クロルホルム-オソアミル100ML&NBSP;DFS</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>NC9573988</td><td></td></tr><tr><td>スクリューキャップ付き自立型マイクロ遠心チューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>#02-682-557</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-24</td><td>BioSpec Products</td><td>112011</td><td></td></tr><tr><td>BioSpec Productsサプライヤー ダイバーシティパートナー 2.3 MM ジルコニアビーズ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC0451999</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース (白色結晶または結晶性粉末/分子生物学)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>塩酸、認定ACSプラス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A144S</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸、二ナトリウム塩二水和物</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>S311</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、白色粉末、電気泳動フィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム/イソアミルアルコール24:1</td><td>フィッシャー科学</td><td>AC327155000</td><td></td></tr><tr><td>Biotekのエポックのマイクロプレートの分光学光度計</td><td>フィッシャー科学</td><td>11-120-570</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade;&nbsp;ABsolute Blue qPCR Mixes</td><td>Fisher Scientific</td><td>AB4137A</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization Probe, 5&prime;-FAM-AGCCAGCGGCCCGCAAATG-TAMRA-3&prime;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sense Amplification Primer, 5&prime;-GGCCCTTAAATAGCCCGGT-3&prime;</td><td>統合DNAテクノロジーN</td><td>/ A</td><td></td></tr><tr><td>アンチセンス増幅プライマー、5&プライム;-TGAGCCGATAGTCCCCCTAA-3&プライム;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems&trade;マイクロアンプ&貿易;光学式 8 チューブ ストリップ、0.2mL</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>43-165-67</td><td></td></tr><tr><td>サーモ サイエンティフィック&nbsp;ドーム型およびフラットPCRキャップストリップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>AB-0386</td><td></td></tr><tr><td>Mx3005P QPCRシステム、110ボルト</td><td>Agilent</td><td>401443</td><td>Stratageneは現在、Agilent</td></tr><tr><td>BALB/cマウス</td>が所有しています <td>ジャクソン研究所</td><td>000651</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6(B6)マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>好酸球欠損症(&デルタ;dblGATA、BALB / c背景)マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>005653</td><td></td></tr><tr><td>&γ;&デルタ;T細胞欠損(TCR&delta;-/-, B6 background) マウス</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>002120</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>National Institutes of Health</td><td>N/A</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Spot Advanced Software</td><td>Spot Imaging</td><td>SPOT53A</td><td></td></tr> <tr><td>http://www.spotimaging.com/software/spot-advanced/ GraphPad Prism 6</td><td>GraphPad Software</td><td>N/A</td><td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td></tr> <tr><td>Fisherbrandの吸収性アンダーパッド</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-206-62</td><td></td></tr><tr><td>Step 4.5</td><td></td><td></td><td>http://www.bdbiosciences.com/sg/resources/protocols/paraffin_sections.jsp ; http://www.jove.com/science-education/5039 ; http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_Information/1/ht100.pdf</td></tr></tbody></table>

アスペルギルス症では実験的肺真菌負担を決定する組織の定量化

Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis

肺真菌負担の定量化は相対的なレベルの免疫保護と肺真菌症のマウス ・ モデルにおける真菌の病原性の決定のため重要です。真菌負担を評価するために複数の方法を使用するが、真菌 DNA の量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) は以前の文化に基づく方法にいくつかの利点と技術として登場しました。現在、肺の病理、白血球動員、真菌の負担、侵襲性アスペルギルス症 (IA) のマウスにおける遺伝子発現の包括的な評価には、多数の実験と対照動物の使用が必要となります。ここで肺真菌負担使用動物数の削減を決定する染色組織の定量化は、詳細に検討されました。肺染色染色ゴモリの変更された methanamine シルバー (GMS) 真菌の構造を識別します。各ホルマリン固定パラフィン包埋肺の 4 つの個別のフィールドから GMS ステンド セクションから撮影を行った。各画像内の領域を染色 GMS 画像解析プログラムを使用して定量を行ったし、この定量化から染色領域の平均割合はサンプルごとに決定されました。この戦略を使用して、展示好酸球欠損マウスに低下し真菌負担およびキャスポファンギン療法病キャスポファンギンと IA と野生型マウスを改善しなかった。同様に、γδ T 細胞欠損マウスにおける真菌の負担も改善されたキャスポファンギン、qPCR と GMS 定量化によって測定されます。GMS の定量化はそのための侵襲性アスペルギルス症の包括的な研究に必要な実験動物の量を減らすことができます最終的に相対的な肺真菌負担の定量法として導入されました。

図 4 には野生型の生存率のグラフが含まれます。 または ia 好酸球欠損マウスはキャスポファンギンと扱われます。その結果, 野生型マウスと比較して生存率の増加を好酸球欠損マウスに展示 (50% の死亡率率は 100%、対それぞれ)。図 5ショー代表 GMS ia 処理または未処理のカスポファンギンと好中球減少の野生型および好酸球欠損マウスから染色します。カスポファンギン治療がない野生型マウス (右側のパネル) が好酸球欠損の相対的な真菌クリアランスの結果、両方のグループを受信しなかったキャスポファンギンあった同様 (左のパネル)。図 6キャスポファンギン処理で真菌の負荷の比較を示していて、未処理の野生型または好酸球欠損マウス、真菌 DNA (図 6 a)、代表 GMS の両方の qPCR 4 (対物レンズ 10 倍) の数量フィールド (図 6 b)。両方の技術から生成された結果を示す最も重要な真菌負担キャスポファンギン治療結果が野生型および好酸球欠損マウス (図 6 a) の間に減少します。しかし、未処理のねずみで GMS 数量だけは好酸球 (図 6 b) に欠けているマウスの大幅な減少につながった。全体肺 GMS ステンド セクションの平均面積が算出した (4 X 目標)、違いは少なく統計的な有意性 (図 6) でも 4 の代表 10 X フィールドで得られた結果と同様にされました。図 7は、生存、代表 GMS 染色 (4 10 X フィールド) のイメージおよび真菌の負担の定量化両方の方法による γδ コントロールと比較するキャスポファンギンと扱われた、未処理のマウス T 細胞欠損 (TCRδKO) マウスです。生存率 (図 7 a)、真菌負担 (図 7B-D) TCRδKO マウスのキャスポファンギン治療改善。図 6の結果と同様に、真菌の負担の結果測定 qPCR (図 7 b) と代表による GMS の定量化 (図 7) 同等であった.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig4.jpg"> 図 4: ia (ΔdblGATA) の好酸球-欠損マウスにおけるキャスポファンギンと治療後の生存を増加します。15-30 マウス/グループ。3-6 実験の概要です。p &lt; 0.0001。この図は、以前の文書8から変更されました。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig5.jpg"> 図 5: 野生型、欠乏、およびキャスポファンギン扱われる好酸球またはコントロールから GMS で汚れた肺セクションの代表的な画像未処理アイオワ マウス3-4 マウス/グループの代表。スケール バーは、100 μ m に相当します。この図は、以前の文書8から変更されました。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig6.jpg"> 図 6: 野生型で真菌負担処理 IA またはコントロールと好酸球欠損マウス治療キャスポファンギン。(A) qPCR 真菌 DNA の。15-30 マウス/グループ、3-6 実験の概要です。(B) GMS 定量化組織学的セクションの 4 つのフィールド (対物レンズ 10 倍) から染色 GMS % の意味。(C) GMS の定量化, 全肺セクション (4 × 対物) % の意味。B と C は、5 マウス/グループの要約です。p &lt; 0.05。p &lt; 0.001。p &lt; 0.0001。この図は、以前の文書8で報告されたデータを使用して生成されました。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig7.jpg"> 図 7: キャスポファンギン治療後 γδ T 細胞欠損マウスにおける IA の重症度を減少します。(A) 生存。(B) qPCR 真菌 DNA の。GMS (C) 組織の定量化。(D) ia、処理または未処理のキャスポファンギン γδ T 細胞から GMS 染色切片の代表的なイメージ。A と B が 7-10 マウス/グループと 2 つの実験の概要です。C と D は、4 マウス/グループの概要です。p &lt; 0.05。p &lt; 0.01。p &lt; 0.001。この図は、以前の文書8から変更されました。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

ゴモリの変更された methanamine 銀染色組織切片の定量化による侵襲性アスペルギルス症マウスにおける肺真菌負担を決定するプロトコルについて述べる。このメソッドの使用は肺真菌 DNA の定量的 PCR による真菌負担の評価と比較して少ない動物と同等の結果になった

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse ...

このプロトコルの全体的な目標は、組織学的分析により、侵襲性アスペルギルス症のマウスの肺真菌負荷を定量化することです。この方法は、保護的および有害な宿主応答メカニズムと主要な真菌病原性因子に関する真菌病原性分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、既存の組織学的サンプルを使用して、肺真菌DNAの定量的PCRアプリケーションと同等の結果で真菌負荷を得ることができることです。この方法は、侵襲性アスペルギルス症に関する洞察を提供することができますが、病原体を宿主組織内で異なる染色を行うことができる他の疾患研究にも適用できます。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、DNA定量法よりもばらつきの少ない肺真菌負荷を定量化するための代替方法を考え始めたときでした。感染と収穫の手順を実演するのは、研究技術者のAngar Tsoggeral氏です。感染の24時間前に、実験用の7〜10週齢のマウスの好中球を、0.5ミリグラムの抗マウスLy-6G抗体を滅菌生理食塩水で45度の角度で腹腔内投与し、各動物の右下側象限に送り込み、マウスをケージに戻します。翌朝、0.5mmガラスビーズ1.5gを分生子培養プレートに注ぎ、ビーズが真菌でコーティングされるまでプレートを前後にゆっくりと傾けます。分生子でコーティングされたビーズ混合物を15ミリリットルの円錐管に集め、ビーズを5ミリリットルのDPBSに懸濁します。ビーズをボルテックスして真菌から分離し、血球計算盤で上清の50倍希釈で分生子をカウントします。分生子をDPBS濃度1ミリリットルあたり10倍から8分の1に希釈し、マウスあたり50マイクロリットルの分生子溶液を個々のマイクロピペットにロードします。つま先をつま先で挟んで反応がないことを確認した後、最初に麻酔をかけたマウスを仰臥位の斜めの板に置き、上切歯をゴムバンドで、下切歯を金属線で優しく拘束します。次に、小さな鉗子を使用して舌を慎重に完全に伸ばし、50マイクロリットルの分生子溶液を舌の基部に送達します。舌を完全に伸ばしたまま、20秒間または懸濁液が完全に吸引されるまで、急速な呼吸と誤嚥の独特のカチッという音を聞きます。次に、マウスを完全に横臥するまで監視しながらマウスをケージにそっと戻し、次の動物に感染させます。すべてのマウスが感染したら、一部の動物に抗真菌剤を注射し、感染後24時間後にすべての動物で好中球の枯渇を繰り返します。真菌を投与してから3日後、吸収パッドで覆われた発泡スチロールボードの上に最初のマウスを仰臥位に置きます。マウスがつま先をつまんで安楽死させていることを確認し、70%エタノールで髪を消毒します。手足を固定した後、ハサミを使って胸郭上部を慎重に開き、胸郭を切り取って肺と心臓を露出させます。心臓から下降する下大静脈を、他の血管を切断したり、臓器に穴を開けたりしないように注意しながら切断し、25度の角度で保持された25ゲージの針を備えた5ミリリットルの注射器を使用して、5ミリリットルの冷たいDPBSを心臓の右心室にゆっくりと灌流します。同様に5ミリリットルの10%ホルマリンを注入した後、気管を慎重に露出させ、気管に穴を開けないように注意しながら周囲の脂肪パッドを剥がします。露出した気管を鉗子で持ち上げ、25ゲージの針を使用して上部気管に穴を開けます。カニューレを穴から肺に向かって慎重に挿入し、手術用糸を気管の周りに緩く結び、カニューレを固定します。1ミリリットルの注射器を使用して、カニューレを通して1ミリリットルの10%ホルマリンバッファーで肺を膨らませ、カニューレをすばやく、しかし慎重に取り外します。手術用糸を締めて気管を密閉し、糸をそっと引っ張って結合組織を切断し、肺と気管を採取できるようにします。15ミリリットルの10%ホルマリンバッファーを含む15ミリリットルの円錐形チューブに組織を置き、糸の一端をチューブの外側に置きます。次に、キャップを密封し、チューブを反転させて、サンプルと固定剤を少なくとも24時間完全に沈めます。採取した組織をイメージングするには、まず適切なイメージング定量プログラムを開き、光学顕微鏡を使用して、10倍対物レンズの下で各ゴモリの修飾メタナミン銀またはGMS染色スライドの少なくとも4つの異なるフィールドを取得します。画像が肺内の感染した気道を表しており、それらが同様の組織密度を示していることを確認してください。画像にスケールバーを追加するには、[編集]メニューで[キャリブレーションマークの追加/編集]を選択し、線の太さ、色、スケールバーのサイズを選択します。スケールバーを配置する画像をクリックし、[編集]メニューを開き、[マージ]および[キャリブレーションマークのマージ]を選択して各画像にスケールバーを追加し、画像を適切な実験グループフォルダーに保存します。各動物の真菌負荷を計算するには、適切な画像処理プログラムを開き、画像の最初のフォルダを開きます。[画像] メニューで、[種類] と [RGB スタック] を選択して画像を変換します。右矢印キーを使用して、3 つの画像のうち 2 番目の画像を選択し、Control-Shift-T を押して Threshold メニュー設定アジャスターを開きます。元のtiffまたはjpg画像を参照として見つけ、画像表示プログラムで画像を開きます。閾値を選択する際には、選択した領域が真菌菌糸を代表するように、またサンプル間の一貫性を確保するために、元の画像を表示できることが重要です。上部のスライダーを左端まで動かし、選択した赤い領域が顕微鏡画像を代表するようになるまで下部のスライダーを調整します。[設定] と [OK] をクリックし、[分析] と [測定の設定] を選択し、面積、面積の割合、しきい値に制限、表示ラベルをチェックし、下部の設定をデフォルトのままにします。「OK」をクリックし、「分析と測定」を選択します。結果が表示されます。次に、データをグラフ化および統計分析用のデータ分析プログラムにエクスポートし、各肺サンプルの4つ以上の面積パーセンテージの平均を入力します。この代表的な生存グラフが示すように、感染後に抗真菌剤で治療された侵襲性アスペルギルス症の好酸球欠損マウスは、野生型動物と比較して生存率が高くなっています。浸潤性アスペルギルス症を発症した好中球減少性の野生型マウスおよび好酸球欠損マウスの代表的なGMS染色は、抗真菌剤治療を受けたノックアウトマウスでは、抗真菌剤治療を受けた野生動物では反応しない、ほぼ完全な真菌クリアランスを明らかにしました。さらに、先ほど示したように、定量的PCRと手動光学顕微鏡GMS定量の両方により、抗真菌剤治療により、野生型マウスと好酸球欠損マウスの間で真菌負荷が最も重要な減少をもたらすことが確認されています。しかし、未処理のマウスでは、GMS定量のみが、この実験で好酸球欠損マウスの有意な減少を決定しました。全肺GMS染色切片の平均面積を4倍倍で計算すると、その差は4つの代表的な10Xフィールドで得られた結果と同様ですが、統計的有意性は低くなります。同様の生存率、真菌負荷、および真菌クリアランスの結果は、同じ抗真菌剤で治療されたγ-δT細胞欠損マウスでも観察されます。この手順を試行する際は、組織切片の写真を撮るとき、および同等の結果を得るためにしきい値を調整するときに一貫性を保つことが重要です。この手順に続いて、標的染色とバックグラウンド染色との間の明確な違いのサンプルの組織学的分析を含む他の方法を実行して、肺や他の組織の疾患病理に関連する追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、不随意誤嚥によってマウスに真菌分生子を感染させる方法と、画像処理ソフトウェアを使用して肺組織切片の真菌増殖を測定する方法についてよく理解できるはずです。Aspergillus fumigatusとGomoriの修飾メタナミン銀染色での作業は危険な場合があり、この手順を実行するときは、個人用保護具を着用したり、換気の良いフードの下で作業したりするなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

我々は、彼らが病原体を貪食や好中球細胞外トラップ（NETS）を生成しながら、感染肺における好中球顆粒球の動態の観察のために、2光子顕微鏡を使用する方法を、示しています。...

2光子顕微鏡を用いて感染肺における好中球による貪食とNET -形成の直接観察

種子感染菌による穀物の荒廃は、より良い植物 -...

真菌の植民地、減数、およびカーネルのバイオアッセイを用いたマイコトキシンの生産の定量化

このビデオは、ゼブラフィッシュの幼生の真菌感染を定量化する方法を示しています。真菌胞子は幼虫の後脳心室にマイクロインジェクションされ、幼虫は感染の発生を可能にするためにインキュベートされます。感染した幼虫は一定の間隔で収穫され、コロニー形成単位を列挙することで感染の進行が評価されます。...

ゼブラフィッシュ幼生の真菌感染を定量化する技術

このビデオは、ヒト白血球によるFITC標識病原性真菌胞子の食作用を定量化する方法を示しています。食作用した胞子は、対比染色によって細胞付着胞子から識別され、続いてフローサイトメトリー分析が行われます。...

ヒト食細胞による真菌性胞子食作用の定量的フローサイトメトリー測定

共焦点顕微鏡によって貪食されたアスペルギルス胞子の成長を制御するために単離したマウス肺胞マクロファージの能力を評価する方法。...

共焦点顕微鏡による絶縁型肺胞マクロファージの抗真菌活性を評価する

このプロトコルは、フローサイトメトリーを用いたヒト一次食細胞によるアスペルギルス・フミガトゥス・コニディアの貪食を定量的に測定し、単なる接着から白血球へのコニジアの貪食を判別するための迅速かつ信頼性の高い方法を提供する。...

フローサイトメトリーを用いたヒト白血球によるアスペルギルス・フミガトゥス・コニディアの食細胞症の測定

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ幼虫における アスペルギルス 感染モデルについて説明する。 アスペルギルス...

宿主と病原体の相互作用の解析のためのゼブラフィッシュ幼虫のア スペルギルス 胞子の感染

マウスの気道における アスペルギルス・フミガトゥス...

全実装光学的にクリアされたマウス肺における アスペルギルス・フミガトゥス ・コニディア分布の共焦点レーザー走査顕微鏡ベースの定量分析

透過光顕微鏡技術を用いたラベルフリーのライブイメージングプロトコルを提示し、水没培養物と固体培地の両方で、画像を撮影し、糸状菌 A.ニドゥラン...

ライブ顕微鏡とオープンソースソフトウェアを用いた アスペルギルスニデュラン の成長率の定量分析

蛍光顕微鏡による分析のために、肺気道内の真菌胞子の自然な位置を保持する真菌病因モデルの方法を提示します。...

気道内の真菌胞子の空間動態を保存するマウス肺の効率的なイメージング法

学ぶ組織学的定量法でマウスの侵襲性アスペルギルス症における肺真菌負荷を評価する方法です。既存の組織サンプルを利用でき、qPCRと同等の結果を得ながら動物数を削減できます。

アスペルギルス症では実験的肺真菌負担を決定する組織の定量化

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