アスペルギルス症では実験的肺真菌負担を決定する組織の定量化

このプロトコルの全体的な目標は、組織学的分析により、侵襲性アスペルギルス症のマウスの肺真菌負荷を定量化することです。この方法は、保護的および有害な宿主応答メカニズムと主要な真菌病原性因子に関する真菌病原性分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、既存の組織学的サンプルを使用して、肺真菌DNAの定量的PCRアプリケーションと同等の結果で真菌負荷を得ることができることです。

この方法は、侵襲性アスペルギルス症に関する洞察を提供することができますが、病原体を宿主組織内で異なる染色を行うことができる他の疾患研究にも適用できます。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、DNA定量法よりもばらつきの少ない肺真菌負荷を定量化するための代替方法を考え始めたときでした。感染と収穫の手順を実演するのは、研究技術者のAngar Tsoggeral氏です。

感染の24時間前に、実験用の7〜10週齢のマウスの好中球を、0.5ミリグラムの抗マウスLy-6G抗体を滅菌生理食塩水で45度の角度で腹腔内投与し、各動物の右下側象限に送り込み、マウスをケージに戻します。翌朝、0.5mmガラスビーズ1.5gを分生子培養プレートに注ぎ、ビーズが真菌でコーティングされるまでプレートを前後にゆっくりと傾けます。分生子でコーティングされたビーズ混合物を15ミリリットルの円錐管に集め、ビーズを5ミリリットルのDPBSに懸濁します。

ビーズをボルテックスして真菌から分離し、血球計算盤で上清の50倍希釈で分生子をカウントします。分生子をDPBS濃度1ミリリットルあたり10倍から8分の1に希釈し、マウスあたり50マイクロリットルの分生子溶液を個々のマイクロピペットにロードします。つま先をつま先で挟んで反応がないことを確認した後、最初に麻酔をかけたマウスを仰臥位の斜めの板に置き、上切歯をゴムバンドで、下切歯を金属線で優しく拘束します。

次に、小さな鉗子を使用して舌を慎重に完全に伸ばし、50マイクロリットルの分生子溶液を舌の基部に送達します。舌を完全に伸ばしたまま、20秒間または懸濁液が完全に吸引されるまで、急速な呼吸と誤嚥の独特のカチッという音を聞きます。次に、マウスを完全に横臥するまで監視しながらマウスをケージにそっと戻し、次の動物に感染させます。

すべてのマウスが感染したら、一部の動物に抗真菌剤を注射し、感染後24時間後にすべての動物で好中球の枯渇を繰り返します。真菌を投与してから3日後、吸収パッドで覆われた発泡スチロールボードの上に最初のマウスを仰臥位に置きます。マウスがつま先をつまんで安楽死させていることを確認し、70%エタノールで髪を消毒します。

手足を固定した後、ハサミを使って胸郭上部を慎重に開き、胸郭を切り取って肺と心臓を露出させます。心臓から下降する下大静脈を、他の血管を切断したり、臓器に穴を開けたりしないように注意しながら切断し、25度の角度で保持された25ゲージの針を備えた5ミリリットルの注射器を使用して、5ミリリットルの冷たいDPBSを心臓の右心室にゆっくりと灌流します。同様に5ミリリットルの10%ホルマリンを注入した後、気管を慎重に露出させ、気管に穴を開けないように注意しながら周囲の脂肪パッドを剥がします。

露出した気管を鉗子で持ち上げ、25ゲージの針を使用して上部気管に穴を開けます。カニューレを穴から肺に向かって慎重に挿入し、手術用糸を気管の周りに緩く結び、カニューレを固定します。1ミリリットルの注射器を使用して、カニューレを通して1ミリリットルの10%ホルマリンバッファーで肺を膨らませ、カニューレをすばやく、しかし慎重に取り外します。

手術用糸を締めて気管を密閉し、糸をそっと引っ張って結合組織を切断し、肺と気管を採取できるようにします。15ミリリットルの10%ホルマリンバッファーを含む15ミリリットルの円錐形チューブに組織を置き、糸の一端をチューブの外側に置きます。次に、キャップを密封し、チューブを反転させて、サンプルと固定剤を少なくとも24時間完全に沈めます。

採取した組織をイメージングするには、まず適切なイメージング定量プログラムを開き、光学顕微鏡を使用して、10倍対物レンズの下で各ゴモリの修飾メタナミン銀またはGMS染色スライドの少なくとも4つの異なるフィールドを取得します。画像が肺内の感染した気道を表しており、それらが同様の組織密度を示していることを確認してください。画像にスケールバーを追加するには、[編集]メニューで[キャリブレーションマークの追加/編集]を選択し、線の太さ、色、スケールバーのサイズを選択します。

スケールバーを配置する画像をクリックし、[編集]メニューを開き、[マージ]および[キャリブレーションマークのマージ]を選択して各画像にスケールバーを追加し、画像を適切な実験グループフォルダーに保存します。各動物の真菌負荷を計算するには、適切な画像処理プログラムを開き、画像の最初のフォルダを開きます。[画像] メニューで、[種類] と [RGB スタック] を選択して画像を変換します。

右矢印キーを使用して、3 つの画像のうち 2 番目の画像を選択し、Control-Shift-T を押して Threshold メニュー設定アジャスターを開きます。元のtiffまたはjpg画像を参照として見つけ、画像表示プログラムで画像を開きます。閾値を選択する際には、選択した領域が真菌菌糸を代表するように、またサンプル間の一貫性を確保するために、元の画像を表示できることが重要です。

上部のスライダーを左端まで動かし、選択した赤い領域が顕微鏡画像を代表するようになるまで下部のスライダーを調整します。[設定] と [OK] をクリックし、[分析] と [測定の設定] を選択し、面積、面積の割合、しきい値に制限、表示ラベルをチェックし、下部の設定をデフォルトのままにします。「OK」をクリックし、「分析と測定」を選択します。

結果が表示されます。次に、データをグラフ化および統計分析用のデータ分析プログラムにエクスポートし、各肺サンプルの4つ以上の面積パーセンテージの平均を入力します。この代表的な生存グラフが示すように、感染後に抗真菌剤で治療された侵襲性アスペルギルス症の好酸球欠損マウスは、野生型動物と比較して生存率が高くなっています。

浸潤性アスペルギルス症を発症した好中球減少性の野生型マウスおよび好酸球欠損マウスの代表的なGMS染色は、抗真菌剤治療を受けたノックアウトマウスでは、抗真菌剤治療を受けた野生動物では反応しない、ほぼ完全な真菌クリアランスを明らかにしました。さらに、先ほど示したように、定量的PCRと手動光学顕微鏡GMS定量の両方により、抗真菌剤治療により、野生型マウスと好酸球欠損マウスの間で真菌負荷が最も重要な減少をもたらすことが確認されています。しかし、未処理のマウスでは、GMS定量のみが、この実験で好酸球欠損マウスの有意な減少を決定しました。

全肺GMS染色切片の平均面積を4倍倍で計算すると、その差は4つの代表的な10Xフィールドで得られた結果と同様ですが、統計的有意性は低くなります。同様の生存率、真菌負荷、および真菌クリアランスの結果は、同じ抗真菌剤で治療されたγ-δT細胞欠損マウスでも観察されます。この手順を試行する際は、組織切片の写真を撮るとき、および同等の結果を得るためにしきい値を調整するときに一貫性を保つことが重要です。

この手順に続いて、標的染色とバックグラウンド染色との間の明確な違いのサンプルの組織学的分析を含む他の方法を実行して、肺や他の組織の疾患病理に関連する追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、不随意誤嚥によってマウスに真菌分生子を感染させる方法と、画像処理ソフトウェアを使用して肺組織切片の真菌増殖を測定する方法についてよく理解できるはずです。Aspergillus fumigatusとGomoriの修飾メタナミン銀染色での作業は危険な場合があり、この手順を実行するときは、個人用保護具を着用したり、換気の良いフードの下で作業したりするなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。