虚血性脳卒中のモデルラットの血液脳関門の破壊のIn Vivo評価

この手順の全体的な目標は、虚血性脳卒中のモデルラットの血液脳関門の破壊の生体内評価の再現性の高い技術を提供することです。

この手順の全体的な目標は、虚血性脳卒中の反応モデルにおける血液脳関門の破壊をin vivoで評価する再現性の高い方法を提示することです。これは、脳の左側にある中大脳動脈閉塞のための管腔内フィラメントを使用した虚血性脳卒中の誘発によって達成されます。手順の次のステップは、頸静脈外枝のカニューレ挿入と、中大脳動脈閉塞の終わりと再灌流期間の開始時にエバンス ブルー色素を注入することです。

24時間後、深い麻酔下で、動物の循環系がエバンスブルーから洗い流され、脳が摘出されます。次に、2つの大脳半球を分離し、均質化して遠心分離し、最終的に組織の上清を使用して、分光光度計でエバンスブルー濃度を測定します。麻酔と流量測定。

4%イソフルランを使用して麻酔を誘発し、手術期間中は70%の亜酸化窒素と13%の酸素の混合物でイソフルラン1〜1.5%で維持します。麻酔をかけた動物をフィードバック制御加熱ブランケットの上で腹臥位に置き、この加熱ユニットに接続された直腸プローブを使用して体温を正常な生理学的範囲に維持します。頭蓋骨左側の手術部位を剃り、ガーゼパッドを使用してベタジン溶液を塗布して皮膚を消毒します。

70%エタノールを含む滅菌パッドと交換し、両方の手順を3サイクルで繰り返します。左目の外側眼角から左耳の付け根まで伸びる頭蓋骨に1センチメートルの長さの皮膚切開を行い、左側頭筋を解剖して頭蓋骨を露出させます。次に、ドップラー流量計ペンシルプローブの先端を簡単に配置できるように、ブレグマの横方向5ミリメートルと後方1ミリメートルに小さな穴を開けます。

ラットを腹臥位から仰臥位に回し、レーザーペンシルプローブを以前に開けた頭蓋骨の穴に入れて、局所的な脳血流を監視します。各動物のベースライン領域脳血流を記録し、それを限局性脳虚血の 100% 誘発と見なします。首の部分を剃り、ベタジン溶液と70%エタノールで皮膚を消毒します。

0.2ミリリットルの0.5%ブピバカインを手術部位に注射し、鎮痛剤を投与します。首の腹面に2センチメートルの長さの外科的切開を行い、左総頸動脈にアクセスします。総頸動脈を隣接する筋膜と迷走神経から分離して、外部頸動脈と内部頸動脈の分岐にアクセスします。

左総頸動脈または5-0嚢縫合糸を使用して外部頸動脈のいずれかを永久に結紮し、内頸動脈を翼状口蓋動脈のレベルまで解剖します。総頸動脈の周りに5-0嚢縫合糸を緩く配置し、血管マイクロクリップで内部頸動脈を一時的に固定します。前に緩いネクタイをする前に総頸動脈に小さな切開を行い、次に4-0シリコーンコーティングされたナイロン縫合糸を内部頸動脈の管腔に挿入し、総頸動脈の周りの縫合糸を締めてナイロン縫合糸を固定し、血液漏れを防ぎます。

血管マイクロクリップを内頸動脈から取り外します。次に、中大脳動脈起始の閉塞を示す局所脳血流の著しい減少が観察されるまで、シリコーン被覆管腔内フィラメントを進めます。特に、内側脳動脈閉塞は、局所脳血流の80%以上の減少が検出されると開始されます。

このモデルでは、マイクロクランプを使用して翼状口蓋動脈を一時的にブロックし、フィラメントを心房経路に正しく導きます。このステップは、内側大脳動脈閉塞の成功にとって非常に重要です。頸静脈カニューレ挿入とエバンスブルー注射。

正中線の左側に向かって首に縦に1センチメートルの切開を行い、次に表在筋膜を鈍く解剖して左頸静脈の外部枝にアクセスします。次に、頸静脈の角膜端を5-0嚢縫合糸で永久に結紮します。静脈の周りに2本のタイを緩く配置し、血管マイクロクランプで頸静脈の心臓端を一時的に固定します。

2つの縫合糸で頸静脈を小さく切開し、ヘパリン化された血清充填カテーテルを静脈の管腔腔に挿入し、約10ミリメートル進めます。その後、静脈の周りの結紮糸を締めてカテーテルを固定し、出血を防ぎます。静脈の崩壊を避けるために、少量の血清を注入します。.

虚血期間の終わり、つまり90分で、管腔内縫合糸を抜いて再灌流を開始します。再灌流期間の開始時に、エバンスブルー染料を生理食塩水に2%溶液1キログラムあたり1ミリリットルを5分間かけてゆっくりと注入します。.その後、0.5ミリリットルの生理食塩水を注射してカニューレを洗浄し、注射カニューレを静脈から引き抜きます。

エバンスブルー注射後の組織の色の変化に注意してください。最後に、首と頭の切開部を縫合し、動物を回復ケージに入れます。血液脳関門透過性の評価。

24時間の再灌流後、チオペンタールナトリウムで動物に深く麻酔をかけます。次に、胸骨の下に小さな穴を開けて胸腔を開きます。右心房に小さな開口部を作り、左心室から250ミリリットルの温めた生理食塩水を15分間注入して、心房から取り残された正常な生理食塩水が無色になるまで、エバンスブルーを循環から洗い流します。

すぐに頭蓋骨から脳を取り出し、脳マトリックスに入れます。嗅球と小脳を解剖し、清潔なカミソリの刃を使用して、脳の右半球を正中線に沿って左から分離します。各半球を秤量し、2.5ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水で別々に均質化し、ボルテックスマシンを使用して2.5ミリリットルの16%トリクロロ酢酸と2分間混合します。

脳サンプルを30分間遠心分離し、冷蔵庫で10分間冷却します。上清を使用して、610ナノメートルの分光光度計でエバンスブルーの吸光度を推定します。代表的な結果。

偽手術動物では、脳の両半球用に調製された組織のエバンスブルー濃度は非常に小さく、互いに有意な差はありません。90分にわたる虚血の誘発とそれに続く24回の再灌流により、虚血性ラットの脳の病変半球のエバンスブルーレベルが大幅に増加しました。.まとめると、これらの知見は、通常の条件下では、Evans Blueは血液脳関門を容易に通過して脳実質に入ることができず、脳虚血性障害は、血液脳関門の社内透過性を通じてEvans Blueの血管外漏出を誘発したことを示しています。

写真は、偽手術動物と虚血動物の脳を示しています。脳組織におけるエバンスブルーの血管外漏出の強度(青色)は、病変した半球の血液脳関門の破壊の程度から生じることに注意してください。結論。血液脳関門の in vivo 評価により、研究者は虚血誘発性血管性脳浮腫の可能な病態生理学的メカニズムを研究し、新しい治療介入を見つけることができます。

この手法はシンプルで信頼性があります。研究者は、技術の性能をさらに向上させ、その精度を確保するために、いくつかの技術的なポイントを考慮に入れる必要があります。レーザードップラー流量計による局所脳血流の常時記録とシリコーンコーティングフィラメントの使用により、MCAOの成功率を高め、死亡率を下げることができます。

注射の投与量と時点は、虚血性障害後の血液脳関門の動的な性質により、信頼性の高い結果を得るための 2 つの重要なパラメーターです。