Name: 歯肉の炎症性三次元人体同等 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 学ぶ、3種類のヒト細胞を用いた歯肉炎症性三次元組織モデルの構築法。HaCaTケラチノサイト、歯肉線維芽細胞、THP-1マクロファージを共培養し、創傷治癒や組織再生のメカニズムを解明する。

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この作品は、科学研究 (26861689, 17 K 11813) の科学振興費日本社会によって一部に支えられました。著者は、校正のナサニエル ・ グリーン氏に感謝したいと思います。

このプロトコルは、対応するひと歯肉組織、歯肉創傷モデル、および歯肉炎モデルを作成する設計されています。ひと皮膚表皮角化細胞 (HaCaT) 親切教授ノルベルト ・ e. Fusenig ドイツ Krebsforschungszentrum (ハイデルベルク、ドイツ)7から提供されていました。ひと歯肉線維芽細胞 (HGFs) は、以前に公開されたプロトコル8によると歯肉組織から分離された.あらかじめ、インフォームド コンセントを得たし、研究が、日本歯科大学生命歯学部東京での倫理委員会で設定されたガイドラインに従って承認された (承認番号: NDU T2012 35)。細胞文化フードでプロトコルの手順 1-3 を実行必要があります。
1. 歯肉 (GTE) (図 1 a) の 3 D 人体組織等価の準備
<ol><li>ミックス タイプ - A コラーゲンゲル 10% 濃縮 MEM-α と 10% の再構築バッファー (2.2 g NaHCO3と 4.47 g HEPES 100 mL 0.05 N 水酸化ナトリウム) ピペッティングで 15 mL の生殖不能の管に。氷上を使用するまで混合コラーゲン溶液を維持します。</li>
	<li>24 ウェル プレートに 24 の文化挿入 (細孔サイズ 3.0 μ m) を配置します。</li>
	<li>
0.25% トリプシン-EDTA 溶液を使用して文化面から得られたを削除します。10 mL の培地 A に細胞を中断 (MEM-α + 20 %fbs + 1 %glutamax)。Bürker トゥルク細胞カウンターによってセルをカウントします。
	<ol>
<li>セル (1-5 x105セル/mL)、必要な数量を抽出し、190 x g で 4 分間遠心します。</li>
		<li>コラーゲン混合溶液中の細胞を中断します。次のステップまで氷の混合物をしてください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>任意の気泡を生じることがなく文化挿入セル コラーゲン混合物 (0.5 – 2.5 x 105細胞/ウェル) の 0.5 mL を追加します。ジェルの中に混合物を凝固する 37 ° C で 5% CO2加湿雰囲気で 10-30 分のための混合物を孵化させなさい。 注: は、コラーゲン ・ ゲルの不均一の形成を避けるために文化挿入部にコラーゲン混合物を追加します。</li>
	<li>まあ、挿入に 0.5 mL に培養液 1 mL を追加します。24 時間の培養プレートを孵化させなさいまたは 37 ° C で 5% CO2加湿雰囲気の中で一晩</li>
	<li>0.25% トリプシン-EDTA 溶液を使用して文化面から細胞を削除します。10 ml の培地 B の細胞を中断 (DMEM + 10 %fbs + 1 %glutamax) とセルをカウントします。抽出細胞 (1-5 105セル/mL x) 190 × g. で 4 分間遠心分離、ピペットの必要量を中断中 B の細胞</li>
	<li>誤嚥により HGF コラーゲン混合物を含む文化挿入からメディアを削除します。HGF コラーゲン混合物の上に HaCaT 細胞懸濁液 (0.5 – 2.5 x 105細胞/ウェル) の 0.5 mL を加えます。24 時間または一晩文化を孵化させなさい。 注: この時点で文化の媒体も間べきである媒体、文化挿入中は中 b. をする必要があります。</li>
	<li>KSR 媒体 (共培養中) 培養液に置き換える (MEM-α + 15% ノックアウト血清交換 + 1 %glutamax) + 5 %fbs。まあ、文化挿入に 0.5 mL 文化に培養液 1 mL を追加します。24-48 h の文化を孵化させなさい。</li>
	<li>培養液に置き換えて KSR ミディアム + 1 %fbs。よく文化に 1 mL と文化挿入に 0.5 mL を追加します。24 時間または一晩文化を孵化させなさい。</li>
	<li>0.7-1 文化に培養液をよく置き換えます mL KSR 媒体。(文化の表面は、空気にさらされる必要があります) 文化挿入から媒体を完全に取り外します。1-2 週間の文化を孵化させなさい。週二回も文化内のメディアを変更します。 注: (ケラチノ サイトの最上位のレイヤーで構成される) 文化表面上中レベル上昇てはいけないです。常に乾いた状態に保つ培養面。</li>
</ol>2. 負傷者 GTE (図 1 b) の準備
<ol><li>1-3 mm 径組織パンチャーを準備します。それを 20 分 121 ° C のオートクレーブで殺菌します。</li>
	<li>300 μ m、深さについて GTE に垂直に組織のパンチャーをプッシュし、傷をシミュレートするために組織で穴を開けます。</li>
	<li>この手順では、創傷治癒と組織再生を調査するため負傷 GTE を使用します。また、GTE 10% 中性緩衝ホルマリンを使用した組織学的解析の実行を修正します。</li>
</ol>3. 炎症性 GTE (日本支社は 1996) (図 1 b) の準備
<ol><li>以前レポート9によると thp-1 細胞を養います。</li>
	<li>ミックス タイプ - A コラーゲンゲル 10% 濃縮 RPMI 1640 年 10% 再構成バッファー (2.2 g NaHCO3と 4.47 g HEPES 100 mL 0.05 N 水酸化ナトリウム) と 10 ng/mL PMA。使用するまで氷の上混合コラーゲン溶液を維持します。</li>
	<li>カウント 1-2 x 10 の6 THP 1 セルと 190 x g に 4 分間遠心をコラーゲン混合溶液 1 mL のセル中断します。次のステップまで氷の混合物をしてください。</li>
	<li>GTE の負傷者の領域に 10-30 μ L THP 1 コラーゲン混合物を追加します。0.7-1 に培養液を交換 mL KSR 培 PMA の 10 ng/mL。</li>
	<li>72 h の 37 ° C で 5% CO2加湿雰囲気の中で混合物を孵化させなさい。</li>
	<li>歯肉炎や歯周病を調査するためにモデルを使用 (たとえば、日本支社は 1996 サイトカインのリリース10にその効果を見るために潜在的な抗炎症薬を追加します)。また、72 h PMA 処理を省略すると LPS の 2 μ G/ml、文化を追加し、48 h11,12の 37 ° C で 5% CO2加湿雰囲気で組織を孵化させなさい。</li>
</ol>4. 固定および GTE の日本支社は 1996 全体マウント免疫染色文化
<ol><li>
文化の固定。
	<ol>
<li>24 ウェル プレートから培養培地を削除します。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 2 回組織を洗浄します。</li>
		<li>文化にも挿入して 1 mL の 10% ホルマリン中性緩衝液の 1 mL を追加します。4 ° C で冷蔵庫で一晩 24 ウェル プレートを残します。</li>
		<li>次の日 10% 中性緩衝ホルマリンを削除します。</li>
		<li>全体のマウント是非、固定後 PBS に組織を 3-4 回の洗浄します。</li>
		<li>ヘマトキシリンとエオシン (H & E) 染色や正規免疫染色、脱水、パラフィン包埋、切片と進みます。 注: 全体のマウントの是非、この手順を省略できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
全体のマウント免疫染色 注: このプロトコルは、13 の参照の 1 つから変更されました。<ol>
<li>3 組織を洗う x PBS 0.5-1% トリトン、10-30 分たびに。</li>
		<li>ブロック バッファー内で 30 分間 2 回組織を孵化させなさい (PBS 1% トリトン + 10 %bsa)、室温で。</li>
		<li>5-10 分毎回ブロック バッファーで組織 2 × を洗ってください。</li>
		<li>挿入に必要な希釈/濃度に一次抗体溶液 50 μ L を追加します。薄いプラスチックしがみつくフィルムを使用して、組織を乾燥を避けるために挿入をラップします。</li>
		<li>4 ° C で 1 ~ 2 日間組織を孵化させなさい</li>
		<li>組織 3 回洗浄、PBS で 30 分間 1% トリトン + 10 %bsa。洗浄 3 回再び、PBS で 5 分 1% トリトン。</li>
		<li>二次抗体の 50 μ L を加えてブロック バッファー (PBS 1% トリトン + 10 %bsa) と各挿入するヘキスト 33342 ソリューション (NucBlue ライブ細胞染色) の 5 μ L。薄いプラスチックしがみつくフィルムを使用して、組織を乾燥を避けるために挿入をラップします。</li>
		<li>4 ° C で 1 ~ 2 日間インキュベートします。湿らせたペーパー タオルで 24 ウェル プレートをラップし、インキュベーションを通して使用されるプラスチック パックに入れます。</li>
		<li>PBS 1% トリトンの 10 分の 3 回、組織を洗浄します。</li>
		<li>鋭い針を使用して、組織を取得する文化挿入の膜をカットします。スライドに膜を配置します。 注: 組織は、膜にする必要があります。</li>
		<li>蛍光マウント中の 2-3 滴を追加します。解析までカバーガラスと暗闇の中で 4 ° C でストアを持つ組織をカバーしてください。</li>
		<li>共焦点レーザ走査型顕微鏡 (LSM) と組織を表示します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Cekici, A., Kantarci, A., Hasturk, H., Van Dyke, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+and+immune+pathways+in+the+pathogenesis+of+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontology+2000%22%5BJournal%5D)">Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease.</a> Periodontology 2000. 64 (1), 57-80 (2014).</li>
<li>Hasturk, H., Kantarci, A., Van Dyke, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Inflammatory+Diseases+and+Systemic+Inflammation%3A+Role+of+the+Macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Oral Inflammatory Diseases and Systemic Inflammation: Role of the Macrophage.</a> Frontiers in Immunology. 3, 118(2012).</li>
<li>Koh, T. J., DiPietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+wound+healing%3A+The+role+of+the+macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+reviews+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Inflammation and wound healing: The role of the macrophage.</a> Expert reviews in molecular medicine. 13, e23(2011).</li>
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<li>Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Animal+Models+in+Periodontology%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Open+Dentistry+Journal%22%5BJournal%5D)">Experimental Animal Models in Periodontology: A Review.</a> The Open Dentistry Journal. 4, 37-47 (2010).</li>
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<li>Xiao, L., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen-rich+water+achieves+cytoprotection+from+oxidative+stress+injury+in+human+gingival+fibroblasts+in+culture+or+3D-tissue+equivalents%2C+and+wound-healing+promotion%2C+together+with+ROS-scavenging+and+relief+from+glutathione+diminishment%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Cell%22%5BJournal%5D)">Hydrogen-rich water achieves cytoprotection from oxidative stress injury in human gingival fibroblasts in culture or 3D-tissue equivalents, and wound-healing promotion, together with ROS-scavenging and relief from glutathione diminishment.</a> Hum Cell. 30 (2), 72-87 (2017).</li>
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<li>Ara, T., Kurata, K., Hirai, K., Uchihashi, T., Uematsu, T., Imamura, Y., Furusawa, K., Kurihara, S., Wang, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gingival+fibroblasts+are+critical+in+sustaining+inflammation+in+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Periodontal+Res%22%5BJournal%5D)">Human gingival fibroblasts are critical in sustaining inflammation in periodontal disease.</a> J Periodontal Res. 44 (1), 21-27 (2009).</li>
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<li>Mor-Vaknin, N., Punturieri, A., Sitwala, K., Markovitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vimentin+is+secreted+by+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vimentin is secreted by activated macrophages.</a> Nat Cell Biol. 5 (1), 59-63 (2003).</li>
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<li>Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+hydroxylated+fullerene+localizes+at+the+cytoskeleton+and+inhibits+oxidative+stress+in+adipocytes+and+a+subcutaneous+adipose-tissue+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Highly hydroxylated fullerene localizes at the cytoskeleton and inhibits oxidative stress in adipocytes and a subcutaneous adipose-tissue equivalent.</a> Free Radic Biol Med. 51 (7), 1376-1389 (2011).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

このプロトコルは、歯肉組織等価および皮下脂肪組織相当前レポート8,21,22で説明を作成する方法に基づいています。これは、シンプルで簡単な方法は、いくつかの手順特別な注意が必要です。たとえば、コラーゲン混合物は、ソリューションのゲル形成を避けるために使用するまで氷で冷やす必要があります。コラーゲン混合物を文化挿入に追加すると、ソリューションは、偏りのあるゲル ( 3 b を図のように) を避けるために挿入部に注入されたを確認します。スキルを取るも GTE で穴をあけます。組織のパンチャーは時々 組織があまりにも濡れている場合組織を選ぶことはできません。組織生検システムや鉗子の有用である;ただし、負傷した位置の寸法も変更されます。また、鋭い針で穴をあけることがなく THP 1 細胞コラーゲン混合物を注入する注射器を使用することが可能だ (ゲルに針が詰まらせるれませんを確認してください)。...

歯周病は、成人の歯の喪失の主要な原因です。歯肉炎と歯周炎は、最も一般的な歯周疾患です。両方は歯肉でバイオ フィルムを介した急性または慢性炎症性変化を提示します。歯肉炎は、歯周炎は、通常慢性炎症として提示に対し、急性炎症によって特徴付けられます。組織学的レベルでは、微生物の構成要素は、マクロファージ、リンパ球、形質細胞、肥満細胞の1,2などの免疫細胞の活性化をトリガーします。(歯肉上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、骨芽細胞を含む) ローカルの細胞と対話するこれらの免疫細胞、特にマクロファージ炎症歯周組織3,4病変の結果します。ラットなどの動物の様々 な種類の歯周疾患の実験モデルを確立されているハムスター、ウサギ、フェレット、イヌ、霊長類。ただし、モデル動物の生理病理学、細胞および分子メカニズムを分析し、歯周疾患5の新しい薬を評価しにくく、人間のそれとは異なる。歯周病細菌や単分子膜ひと口腔上皮細胞の共同栽培は、歯周感染症6のメカニズムを調査する使用されています。口腔細胞の単層培養がそのまま組織の三次元 (3 D) 細胞アーキテクチャを欠いているにもかかわらず、したがって、培養状況を模倣することはできません。
ここでは、体外で歯周疾患を表す 3 D 炎症人体組織等価な歯肉 (日本支社は 1996) が確立されます。歯周疾患のこの 3 D モデルは、単層細胞培養および動物モデル間の中間位置を占めています。HaCaT ケラチノ サイト、歯肉線維芽細胞、THP 1 マクロファージなどの細胞の 3 種類はコラーゲンのゲルの共同栽培、日本支社は 1996 を構築する炎症性のイニシエーターによって刺激されます。日本支社は 1996 は密接に、細胞分化、細胞間の相互作用、および歯肉組織におけるマクロファージ活性化の生体内での条件をシミュレートします。このモデルは、薬物スクリーニングと歯周疾病の新しい薬理学的アプローチをテストのためだけでなく、創傷治癒、炎症、組織再生で細胞および分子メカニズムを分析するため多くのアプリケーションを持っています。

<table><tbody><tr><td>コラーゲンI-A型</td><td>新田ゼラチン株式会社</td><td></td> GTE MEM-αの<td>真皮を作るため</td></tr><tr><td></td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11900073</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>液 細胞培養インサート(24ウェルプレート用)、細孔径3.0 &mu;m</td><td>コーニング株式会社</td><td>353096</td><td>組織培養用</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>35050061</td><td>細胞培養試薬</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>31600034</td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>ノックアウト 血清補充</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>10828028</td><td>細胞培養試薬</td></tr><tr><td>ティッシュパンチャー</td><td>柴田システムサービス株式会社</td><td>SP-703</td><td>用GTE</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>31800022</td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td>免疫染色用</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain)</td> <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>R37605</td><td>核の標識用</td></tr><tr><td>蛍光マウント培地</td><td>Dako</td><td></td><td>免疫染色後のサンプルのマウント用</td></tr><tr><td>抗サイトケラチン 8+18 抗体 [5D3]</td><td>abcam</td><td>ab17139</td><td>上皮同定</td></tr>用 <tr><td>走査型電子顕微鏡</td><td>日立製作所</td><td>日立 S-4000</td><td>試料の表面トポグラフィーと組成観察用</td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査型顕微鏡</td><td>LSM 700;カールツァイス顕微鏡(株)</td><td>LSM 700</td><td>サンプルの免疫蛍光染色観察用</td></tr><tr><td>抗サイトケラチン19抗体</td><td>abcam</td><td>ab52625</td><td>上皮の同定用</td></tr><tr><td>アンチビメンチン抗体</td><td>abcam</td><td>ab92547</td><td>線維芽細胞および活性化マクロファージの同定用</td></tr><tr><td>抗TE-7抗体</td><td>ミリポア</td><td>CBL271</td><td>真皮の線維芽細胞の同定用</td></tr><tr><td>抗CD68抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB2700244</td><td>マクロファージの同定</td></tr><tr><td>ヒトCD14抗体</td><td>R&D Systems</td><td>MAB3832-SP</td><td>マクロファージの同定用</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594-conjugated secondary goat anti-rabbit antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11012</td><td>免疫蛍光染色用</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated secondary goat anti-mouse antibody</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>A11001</td><td>免疫蛍光染色用</td></tr><tr><td>EVOS FL Cell Imaging System</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td> THP-1細胞の<td>免疫蛍光染色用試料の観察用</td></tr><tr><td></td><td>理研BRC細胞バンク</td><td>RCB1189</td> iGTE PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate)<td>の作製</td></tr><tr><td>用</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td>THP-1細胞の分化用</td></tr></tbody></table>

歯肉の炎症性三次元人体同等

Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva

(歯肉炎・歯周炎などの歯周病は、成人の歯の喪失の主要な原因です。歯肉の炎症は、歯周疾病の根本的な生理病理学です。歯周疾患の実験モデルを現在は動物の様々 なタイプに設けられています。ただし、モデル動物の生理病理学、細胞および分子メカニズムを分析し、歯周疾患の新薬を評価しにくく、人間のそれとは異なる。ここでは、ヒトの炎症性組織培養歯肉 (日本支社は 1996) 相当を再構築するための詳細なプロトコルを提案する.2 種類のひと歯肉線維芽細胞 (HGF) と三次元条件下でヒトの皮膚表皮角化細胞 (HaCaT) などを含む人間の細胞を用いた人体組織等価な歯肉 (GTE) を構築します。GTE に穴をパンチする組織パンチャーを使用して傷のモデルを作成します。次に、人間の THP 1 球がコラーゲン ・ ゲル混合は、GTE の穴に挿入されます。10 ng/mL ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) 72 時間の adimistration、thp-1 細胞では GTE (日本支社は 1996) でフォーム炎症巣にマクロファージ分化 (日本支社は 1996 もすることができます stumilated 2 μ g/ml のリポ多糖 (LPS) の炎症を開始する 48 時間).日本支社は 1996 は、ひと細胞を用いた三次元アーキテクチャ炎症歯肉の最初の in vitroモデルです。日本支社は 1996 は、歯周疾病の主要な病理学的変化 (免疫細胞 activition、fibryoblasts、上皮細胞、単球やマクロファージの細胞相互作用) を反映します。GTE、負傷者 GTE、日本支社は 1996 は、歯周疾病の創傷治癒過程を研究する汎用性の高いツール、組織再生、炎症、細胞間相互作用や画面潜在的な医薬品として使用できます。

細胞には、位相差顕微鏡による観察 (図 2 a) の下で典型的な表皮細胞の形態が表示されます。スキャナー電子顕微鏡 (SEM) 像は、HaCaT 細胞表面が多く微絨毛で覆われていたことを示した。HaCaT 細胞間の細胞間の接続は、膜プロセス (図 2 b) によって仲介されました。細胞は、歯肉上皮マーカー K8/1814HaCaT 細胞が歯肉再建 (図 2) に適していることを示す表現。
図 3 aは、GTE の成功例を示し、図 3 bは、GTE の失敗した例を示しています。(<strong class="xf...

プロトコルの目的は、炎症性歯肉モデル体外を構築することです。この組織モデルは共同ひと細胞、HaCaT ケラチノ サイト、歯肉線維芽細胞および三次元条件下での THP 1 マクロファージの 3 種類を栽培します。このモデルは、歯肉炎や歯周炎などの歯周病を調査に適用することができます。

Periodontal diseases (such as gingivitis and periodontitis) are the leading causes of tooth loss in adults. Inflammation in gingiva is the fundamental ...

この実験の全体的な目標は、in vitroで3種類のヒト細胞を使用して3D炎症性歯肉組織モデルを再構築することです。この方法は、創傷治癒、組織再生、炎症の研究、および歯周病の潜在的な医薬品のスクリーニングに役立ちます。この技術の主な利点は、これが3次元構造を持つヒト細胞を使用して炎症性歯肉のin vitroモデルを構築する最初の方法であることです。15ミリリットルの滅菌チューブに、I-A型コラーゲン、10%濃縮MEM-α、10%再構成バッファーを加えます。その後、コラーゲン混合物を次の使用まで氷の上に置いておきます。次に、孔径が3マイクロメートルの24ウェル培養インサートを24ウェル培養プレートに配置します。次に、25%トリプシン-EDTA溶液を使用して、培養フラスコからHGFを分離します。次に、分離した細胞を10ミリリットルの培地に懸濁します。次に、Burker-Turkセルカウンターを使用してセルの数をカウントします。目的の細胞数を単離した後、細胞を190倍gで4分間遠心分離します。次に、細胞ペレットをコラーゲン溶液で懸濁し、チューブを氷の上に置きます。次に、気泡を生成せずに、5ミリリットルの細胞-コラーゲン混合物を培養インサートに加えます。次に、培養インサートを細胞-コラーゲン混合物と摂氏37度、5%二酸化炭素で10〜30分間インキュベートします。インキュベーション後、1ミリリットルの培地をウェルに加え、5ミリリットルの培地をインサートに加えます。次に、培養プレートを摂氏37度で5%の二酸化炭素と1日間インキュベートします。次に、25%のトリプシン-EDTA溶液を使用して、HaCaT細胞を培養プレートから分離します。細胞が剥離したら、細胞に10ミリリットルの培地Bを追加します。次に、セル番号を数えます。目的の細胞数を単離した後、細胞を190倍gで4分間遠心分離します。遠心分離後、細胞ペレットを培地Bに溶解し、次に、培養インサートから培地を吸引します。次に、HGF-コラーゲン混合物の上に5ミリリットルのHaCaT細胞懸濁液を加えます。培養インサートをインキュベーターに1日放置します。翌日、培地を交換します。5%ウシ胎児血清を添加した共培養KSR培地1ミリリットルを培養ウェルに加え、培養インサートに5ミリリットルを加えます。次に、培養プレートを摂氏37度で24時間インキュベートします。翌日、培地を1%ウシ胎児血清を添加した共培養KSR培地に交換します。24時間後に、培養インサートと培養物の両方から培地全体を取り出します。その後、培養ウェルのみに7〜1ミリリットルのKSR培地を新たに加え、2週間培養を続けます。文化の媒体を毎週2回よく変えることを忘れないでください。直径1〜3mmのティッシュパンチャーを用意し、オートクレーブ内で121°Cのパンチャーを20分間滅菌します。滅菌後、ティッシュパンチャーをGTEに垂直に約30マイクロメートルの深さまで押し込み、組織に傷をつけます。次に、PMAの1ミリリットルあたり10ナノグラム、10%再構成バッファー、および10%濃縮RPMI培地をコラーゲンI-A型ゲルと混合します。その後、コラーゲン混合物を次の使用まで氷の上に置いておきます。次に、THP-1細胞を190倍gで4分間遠心分離します。遠心分離後、細胞ペレットを1ミリリットルのコラーゲン溶液に懸濁し、氷上に置いておきます。次に、10〜30マイクロリットルのTHP-1細胞-コラーゲン混合物をGTEの損傷領域に追加します。次に、培地をPMA1ミリリットルあたり10ナノグラムを含む7〜1ミリリットルのKSR培地と交換します。次に、混合物を摂氏37度、二酸化炭素5%で72時間インキュベートします。再構築されたGTEを特徴付けるために、HおよびE染色と走査型電子顕微鏡が行われます。画像は、GTEが上皮と固有層の複数の層を持つ歯肉のような組織構造を示していることを示しています。また、この画像は、再構築されたGTEのHGF細胞が、コラーゲン繊維に囲まれた線維芽細胞の明確な形態学的特徴を示していることも示しています。次に、免疫蛍光染色を行い、真皮マーカーと上皮マーカーの発現を研究します。これは、GTE と iGTE が実際の炎症性ヒト歯肉の分子的特徴を持っているかどうかを検証するためのものです。画像は、ビメンチンとTE-7がGTEの固有層に強く存在していることを示しています。K19は、歯周炎における接合部上皮の特異的マーカーであり、GTE上皮では弱く発現しますが、iGTE上皮では十分に強力です。最後に、iGTEに炎症性病巣を作製するために、PMA処理されたTHP-1単球を組織の損傷領域に注入します。PMA処理の72時間後、THP-1細胞はマクロファージ様細胞に分化します。ホールマウント免疫染色により、これらの細胞が2つの重要なマクロファージマーカーであるCD14とビメンチンを発現し、炎症性病巣を形成することが確認されました。一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば3〜4週間で行うことができます。この手順を試みるときは、汚染を避けることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、LPSを使用して炎症反応を刺激するなどの他の方法を実行して、宿主とバイオフィルムの相互作用を通じて炎症を誘発する方法などの追加の質問に答えることができます。この技術は、その開発後、炎症、組織再生、創傷治癒の分野の研究者が細胞および分子メカニズムを探求し、歯周病の潜在的な薬をスクリーニングするための道を開きました。このビデオを見れば、in vitroで3D炎症性歯肉組織モデルを構築する方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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免疫成分を用いた基本的な3次元(3D)腸管モデルシステム

In Vitroでの宿主-病原体相互作用の研究のための器官型組織モデルシステム

学ぶ、3種類のヒト細胞を用いた歯肉炎症性三次元組織モデルの構築法。HaCaTケラチノサイト、歯肉線維芽細胞、THP-1マクロファージを共培養し、創傷治癒や組織再生のメカニズムを解明する。

歯肉の炎症性三次元人体同等

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