人間歯槽骨膜から骨膜由来細胞の骨形成促進活性に及ぼすビタミン D の間葉系幹細胞の分離

この研究の全体的な目標は、歯歯槽骨膜から採取された培養間葉系幹細胞に対するビタミン D の骨誘導効果を調査することです。間葉系幹細胞の使用は、過去10年間の歯科医療における大きな進歩です。それらは、歯科組織の多くの部分から分離および培養することに成功しています。

ただし、目的は、肺胞骨膜から間葉系幹細胞を分離して培養し、ビタミンD化合物の骨誘導性を調査することです。一般的に言えば、この問題に不慣れな個人は、肺胞骨膜に由来する間葉系幹細胞の骨形成という新しいアイデアのために苦労するでしょう。研究室スタッフの手順のデモンストレーションは、ミス・シンウェン・チーです。

まず、歯科手術中に骨膜セパレーターを使用して患者から骨膜組織を採取します。約2 x 5ミリメートルのスライスを収集します。

組織切片を抗生物質と一緒にDPBSに保存します。ラボでは、採取後24時間以内にメスを使用して肺胞骨膜組織の断片を徹底的にミンチングします。次に、35mmのシャーレに載せた組織を適切な培養培地で培養します。

5%の二酸化炭素ガスを含む加湿された摂氏37度のインキュベーターを使用してください。3日後、採取した骨膜組織を廃棄し、培地を交換します。細胞が約80%のコンフルエントまで増殖したら、トリプシンを添加して培養細胞を剥離します。

そして、培養物を3分間インキュベートします。この後、0.8ミリリットルのメディウムを追加して分離を終了します。収集してカウントした後、プレートあたり1ミリリットルに5, 000個の細胞を分配します。

この段階で、めっきされたセルを継代1としてマークします。これらの細胞を培養し、80%のコンフルエントまで増殖した後、再度分離します。通過1の媒体は、最初はオレンジまたは赤の色です。

3日後に培地がオレンジ色に変わり始めたら、交換してください。継代1細胞が80%のコンフルエントに達したら、ゼロ世代から第1世代への準備と同じ手順を繰り返して、第2世代から第5世代までの細胞を作成します。週に2回、媒体を交換してください。

4週間後、顕微鏡下で細胞の形態を観察することにより、細胞が骨形成系統に分化する可能性を評価します。von kossaアッセイを使用して細胞を幹細胞化します。このアッセイは、培養物中の石灰化沈着物の存在を区別します。

細胞をPBSで洗浄し、10%ホルマリン1ミリリットルで30分間固定します。この後、ホルマリンを取り除き、次に細胞を洗浄し、5%の硝酸銀で処理します。細胞をUV光に1時間さらします。

次に、硝酸銀を取り除き、細胞を2ミリリットルの5%硫酸ナトリウムで毎回3分間4回処理します。治療の合間に溶液を交換してください。最後に、蒸留水を使用して細胞を2回洗浄します。

骨膜組織サンプル34個中20個で、骨髄由来の幹細胞コロニーが得られました。ドナーに関連する要因は、培養の成功に有意に影響を与えることは認められませんでした。当初、PDCは、丸い細胞と紡錘形の細胞が混在するコロニーと球状のクラスターを形成していました。

最初の継代後、細胞は紡錘形の均質な線維芽細胞様であった。骨形成分化の終了時に、von kossaアッセイはカルシウム沈着物の存在と骨形成形成の可能性を示しました。これらの結果は、骨膜細胞集団のうち、前駆細胞が骨形成細胞に分化する可能性を秘めていることを強く示しています。

骨形成前駆細胞もカルシトリオールで処理し、RTPCRを用いて調べ、細胞の早期骨形成分化の強力な指標であるアルカリホスファターゼの発現レベルを評価しました。ビタミンCとビタミンDの活性代謝物であるカルシトリオールの両方の治療は、アルカリホスファターゼ発現を増加させました。また、コラーゲン1mRNAの発現は、同じ処理に応答して増加しました。

骨シアロタンパク質mRNAの発現は、高濃度のカルシトリオールで処理した細胞で増加することがわかりました。しかし、CBFA1、およびオストカルシウムmRNAの発現は治療に反応しませんでした。このビデオを見た後、聴衆はヒト肺胞骨膜の石灰化と培養プロトコルをよく理解しているはずです。

一度マスターすれば、この追求は適切に実行すれば4〜5週間で完了します。この実験を試みるときは、細胞の汚染を避けるために、慎重で無菌的な技術を使用することが重要です。