化学の切断とSchmidtea メディテラネアプラナリアの咽頭再生

この切断手順の全体的な目標は、他の臓器に損傷を与えることなく、プラナリアから咽頭を選択的かつ完全に除去することです。この方法は、再生フィールドの主要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、幹細胞が欠損した臓器を認識し、その再生を開始する方法などです。

この技術の主な利点は、非常に正確であり、プロセス中に他の臓器が損傷を受けないことです。私が最初にこの方法を思いついたのは、アジ化ナトリウムでプラナリアに麻酔をかけていたときでした。アジ化ナトリウムにさらされると咽頭が飛び出すことに気づきました。

切断には動物の適切な選択と、動物の動きと形態の注意深い観察が必要なため、この方法を視覚的に示せることが重要です。その手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるDivya Shiroorです。手順を開始する前に、プラスチック製の移送ピペットを使用して、5〜7日前に清潔なペトリ皿に供給された線虫を選択します。

ペトリ皿の下に平らな定規を置き、各プラナリアが皿を這うときに長さが少なくとも6ミリメートルであることを確認します。次に、選択した最大20匹のワームを35ミリメートルのシャーレに移し、トランスファーピペットを使用してディッシュからすべてのプラナリア水を取り除きます。皿を実体顕微鏡の下に置き、倍率を調整して view複数の動物が見ることができる。

作りたての100ミリリットルのアジ化ナトリウム溶液を5ミリリットル皿に加えます。咽頭の押し出しを観察するために、皿を3〜4分間動かさずに動物を監視します。皿の中の動物の少なくとも半分が咽頭を完全に伸ばしたら、プラスチック製の移送ピペットを使用して吸引し、皿の周りのワームを数回強制的に分配します。

咽頭が完全に伸びていた場合、この激しいピペッティングにより咽頭が剥離します。または、細い鉗子を使用して咽頭をつかみ、プラナリアを半月板に向かって上向きに持ち上げます。動物が持ち上げられると、表面張力によって咽頭が剥離します。

咽頭を動かしている間は、動物に偶発的な怪我をさせないように注意してください。プラナリアは非常に柔らかい体で、特にアジ化ナトリウム中では簡単に損傷します。トランスファーピペットを使用して、切断された約15匹の動物を新鮮なプラナリア水が入った新しい皿に移し、ワームを新鮮なプラナリア水で3回すすぎます。

アジ化ナトリウムは完全に洗い流してください。化学物質の痕跡でさえ、動物を溶かす可能性があります。次に、ワームを摂氏20度で7日間インキュベートします。

切断の翌日、ワームを顕微鏡の下に戻し、ワームの背側に黒い斑点が見えるかどうかを確認します。線虫に餌を与えるには、適量の肝臓ペーストを微量遠心チューブに移し、チューブを短時間遠心分離して気泡を取り除きます。ペーストペレットの体積を推定した後、その体積の5分の1にプラナリア水を追加します。

チューブ内の総容量に基づいて、2パーセントの赤い食用色素を追加します。染料がペースト全体に均一に分布するまで食品サンプルを完全に混合し、チューブを再度短時間遠心分離します。切断した動物を新しいシャーレに移し、約1時間暗闇に置きます。

インキュベーションの終わりに、P200ピペットチップの端から約半センチメートルを切り取り、修正したチップを使用して25マイクロリットルの赤肝臓ペーストを皿に移します。動物に30分間餌を与えます。次に、白い背景にワームを配置して、赤く見える動物の数をスコアリングします。

アジ化ナトリウム溶液で約6分後、咽頭の白い先端が見えます。数分後、動物は活発に収縮し、咽頭を体外に力強く排出します。アジド曝露の約11分後、動物は弛緩し、その時点で咽頭の特徴的なベル形状がはっきりと見えるようになります。

これで切断の準備が整いました。この大きな色素沈着していない組織の塊を取り除くと、切断された動物の背側に黒い斑点が現れます。咽頭の再生をより正確にモニターするために、動物を蛍光標識ストレプトアビジンで一晩染色することができます。

肝臓ペーストに食用着色料を組み合わせることで、食べる動物と食べない動物を区別することができます。次に、赤色の動物の数を定量化して、機能的な咽頭を持つ動物の割合を評価できます。一度習得すると、このテクニックは20分または30分で完了することができます。

この手順を試みるときは、切断をいつ開始すべきかを正確に特定するために、プラナリアの動きを注意深く観察することを忘れないでください。選択的切断は、幹細胞が再生を達成するために適切な系統決定をどのように開始するかなどの問題に対処するのに役立ちます。このビデオでは、アジ化ナトリウムを使用して咽頭を選択的に除去する方法を十分に理解できます。

アジ化ナトリウムでの作業は非常に危険です。実験後は、常に手袋をはめて取り扱い、廃棄物を適切に捨て、作業スペースを清掃することを忘れないでください。