クリプトコッカス ・ ネオフォルマンスでカプセルの直径のサイズの問題: 測定

この手順の全体的な目標は、カプセル径の視覚化と測定のために、C.neoformans株の多糖類カプセルを染色することです。これらの方法は、研究者がCryptococcus neoformansのカプセルサイズの誘導、イメージング、および測定を行うのに役立ちます。染色およびイメージング技術の主な利点は、シンプルで迅速であり、カプセルの直径を正確に測定できることです。

この方法を視覚的にデモンストレーションすることは、ソフトウェアの手順を初めて使用するときに混乱する可能性があるため、非常に重要です。Cryptococcus neoformansのカプセルの直径は、病原性の尺度としてよく使用されます。このプロセスを自動化する機能により、解析時間を大幅に節約できます。

カプセル産生を誘導するには、まず、C.neoformansコロニーを酵母ペプトンデキストロースブロスで摂氏37度でインキュベートし、培養が対数期になるまで18〜36時間振とうします。培養の最後に、遠心分離により酵母をペレット化し、PBSで酵母を3回洗浄します。最後の洗浄後、酵母をDMEM濃度2ミリリットルあたり10〜5番目の細胞の2倍で再懸濁し、培養物を摂氏37度および二酸化炭素5%で18時間インキュベートする。

翌日、遠心分離によって細胞を回収し、上清の最後の10マイクロリットルを除くすべてを取り除きます。酵母をインディアインクで染色するには、残りの上清にペレットを再懸濁し、細胞懸濁液の4マイクロリットルとインディアインクの4マイクロリットルをガラス顕微鏡スライドに移します。得られた溶液を泡を作らずに穏やかに混合します。

次に、厚さ1.5mmの13mmガラスカバースリップを細胞サンプルの上に置き、端を無毒のシーラントで密封します。蛍光色素で酵母を染色するには、1%ウシ血清を添加したPBSの50マイクロリットルに一晩培養ペレットを再懸濁し、細胞を55〜60マイクロリットルのcalcofluor-whiteおよびAlexa Fluor 488標識カプセルモノクローナル18B7抗体で摂氏37度で30分間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、遠心分離によって細胞を回収し、ペレットを10マイクロリットルのPBSとウシ血清アルブミンに再懸濁します。

次に、8マイクロリットルの細胞をガラス顕微鏡スライドに移し、細胞サンプルを厚さ1.5mmの13ミリメートルのガラスカバースリップで覆い、端を無毒のシーラントで密封します。両方の色素で酵母を染色するには、まず、先ほど示したように、蛍光カプセルと細胞壁染色で細胞をインキュベートします。次に、4マイクロリットルの蛍光染色細胞と4マイクロリットルのインドインクをスライドガラスに加え、示されているように真菌細胞サンプルに密封されたカバースリップを置きます。

光学顕微鏡で細胞をイメージングするには、100X対物レンズを選択し、条件ごとに少なくとも50個の重なり合わない細胞をイメージングし、露光時間は画像のコントラストを最大化し、小さな細胞の動きによるぼやけを最小限に抑えます。蛍光顕微鏡で細胞をイメージングするには、顕微鏡イメージングソフトウェアを開き、使用する蛍光色素に適した励起波長と発光波長を選択します。Z スタックコントロールパネルで、最後のオプションを選択します。

顕微鏡のファインフォーカスコントロールを使用して、まず、現在の視野内にあるすべての細胞について、単一の酵母細胞とカプセルの細胞体の最も広い点の下に焦点を合わせ、最初に設定をクリックします。次に、ファインフォーカスコントロールを使用して、現在の視野内のすべてのセルについて、同じセルのセル本体とカプセルの最も広い点より上にフォーカスし、[最後に設定]をクリックします。次に、取得タブを開き、[実験の開始]をクリックして、現在の位置のZスタックを取得します。

カプセルと細胞の直径を手動で測定するには、適切な細胞測定プログラムを開き、測定する画像を選択します。[測定] を選択し、カーソルを使用してセル全体の最も幅の広い点を通る直線を描画し、セル全体の直径を測定します。[計測] をもう一度クリックし、セル本体を通る直線を引いてセル本体の直径を測定し、次のセルを開きます。

すべてのセルが測定されたら、画像を保存します。カプセルと細胞の直径を自動的に測定するには、まず適切な画像編集プログラムを開き、すべてのインディアインク染色細胞画像を反転します。次に、元の画像と反転した画像の両方をセル測定ソフトウェアにインポートするには、測定プログラムのファイルメニューを開き、シーケンスのインポート、画像の読み込み、シーケンスの手動定義、チャネルの寸法化、インポート、および適用を選択します。

細胞体を検出してマスクするには、目的の最初の反転画像に対してコロニーアナライザーの蛍光プロトコルを選択し、[適用]をクリックします。コロニーアナライザーの蛍光プロトコルを再度選択して、逆さにしたC.neoformans細胞体画像をカプセルからセグメント化し、再度[適用]をクリックしてカウントマスクを作成します。右クリックしてカウントマスクセルボディの名前を変更し、元の画像の細胞増殖プロトコルを使用してカプセルを検出してマスクします。

「適用」をクリックして、元の画像のカウントマスクを作成し、カウントマスクカプセルの名前を変更します。元のイメージ上に新しいマスクを作成して、隣接するカプセルを互いにパーティション分割するには、カプセル領域にカプセルパーティションとカプセルを選択します。データをエクスポートするには、スプレッドシートをクリックしてから、スプレッドシートにエクスポートアイコンをクリックします。

エクスポートする測定値を選択し、最後にデータを保存します。カプセルサイズの増加は、導入後のほとんどの株で明らかですが、一部の株は自然に小さなカプセルを示します。この代表的な実験では、最大の菌株と2つの小さな菌株の間でカプセルサイズの有意差が一貫して観察されました。

また、蛍光色素を用いてカプセルサイズの違いを検出することもできます。Zスタック画像キャプチャにより、各細胞の最大カプセルと細胞本体の直径が確実に取得されます。その後、スタックを処理して、酵母細胞カプセルと細胞直径の手動測定のための最大強度予測を生成できます。

どちらの染色方法を使用したカプセル測定でも、実験内での有意差はありませんが、蛍光色素染色と比較して、カプセル径の測定にインドインクを使用した場合、実験間のばらつきが大きくなります。異なる研究者間でのカプセル径測定の有意差は、通常、使用する方法に関係なく観察されませんが、カプセルサイズの小さいながらも有意な違いは、自動測定方法を使用して検出できます。自動測定を成功させるには、細胞に焦点が合っていること、中程度から大きなカプセルがあること、過度にクラスター化されていないことが必要です。

このビデオを見た後、Cryptococcus neoformansでカプセルを誘導する方法、墨汁または蛍光染色を使用してカプセルを染色する方法、カプセルを画像化する方法、および自動化されたソフトウェアで測定する方法をよく理解しているはずです。