Name: マウスの大腸腫瘍モデルにおける結腸マイクロバイ生物多様性環境エンリッチメントの効果を定義する方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 学ぶ マウスの大腸腫瘍モデルにおける環境エンリッチメントが腸内マイクロバイオーム多様性に与える影響を評価する方法。マイクロバイオームを正常化し、16S rDNAシーケンスで細菌叢の変化を解析することで、再現性の高い実験結果を得られます。

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我々 はユタ大学の生物統計学コア統計アドバイスや国立がん研究所賞 P30 CA042014 でサポートされているこれらの技術のコアへのアクセスのためのライブラリの順序、および k. ブーシェのユタ大学ゲノム コア B. Dalley をありがとうございます。記載されたプロジェクトは、国立癌研究所助成金 P01 CA073992 K01 CA128891 とハンツマン癌財団によって支えられました。

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著者は、彼らが利益相反のあるを宣言します。

この手順は、正常または担癌動物の環境エンリッチメントの次の便から分離された細菌叢の解析できます。これらは男女別と遺伝子型の多くの動物を取得する繁殖を含む大規模な実験なので実験の開始前に動物の間マイクロバイを正規化欠かせません非 EE を避けるために関連のマイクロバイに及ぼす影響生物多様性。
NE と EE の条件間の一貫性を保つのため、繁殖の過程はすべてのマウス最初同じ微生物への暴露があるし、したがって、似たマイクロバイ内容を持っているとされるように行われます。それは可能とそのマウスの遺伝子型が可能性が高い、マイクロバイ組成に影響を与えます。このため、マウス遺伝子型数は便を利用する動物が、マイクロバイのような多様性を発生する条件 NE と EE の間維持されます。
いくつかの困難は、実験設計 EE 明らかです。まず、実験の詳細に依存して、実験に必要な動物の数が総数もケージで使用できる動物の数によって制限されます。たとえば、履歴データ周囲マウス生存 EE の実験では、機構基になる生存率の改善前の実験で観察を定義する動物の数を計算...

環境エンリッチメント (EE) 研究活用集合住宅社会的刺激 (大きい住宅ケージ、動物のより大きいグループ)、認知刺激 (小屋、トンネル、ネスト材料、プラットフォーム)、(実行中の身体活動に影響を与えるパラメーター車輪)。EE は、病気の開始そして進行の散髪誘導性脱毛症、アルツハイマー病を含むマウス モデルの広い配列を使用に及ぼす活動の増加と改善された社会と認知の相互作用を理解する多くの研究所で利用されていますレット症候群といくつかの腫瘍と消化器の病気は、1,2,3,4,5,6をモデル化します。
いくつかのマウス モデルはマウスの大腸癌の研究に開発されています。おそらく明確に定義されたモデルは、 Apc分マウスです。Apc分マウス 1990年7、ウィリアム ・鳩の研究所で開発された、ひと大腸癌に通常関連付けられているAPC遺伝子の変異マウスのモデルとして使用されています。APC遺伝子変異人間と対照をなしてApc分マウスは主に大腸腫瘍の非常にまれな出来事と小腸腫瘍を開発します。ただし、単一ノッキン ノックアウトTcf4、ヘテロ接合体変異Tcf4ヘット対立遺伝子は大幅にApc分対立遺伝子8と組み合わせれば大腸腫瘍を増加します。最近、大腸腫瘍のこのマウス モデルは大腸腫瘍6EE の効果を決定するために使用されています。Biceら。研究、4 つの異なるマウスの行の男女に EE の生理・表現型効果 (野生型(WT) Tcf4ヘット/+ Apc+/+、Tcf4+/+ Apc分/+、とTcf4Het/+Apc分/+)) に定義されました。おそらく最も興味深い発見だった EE が両方の男性と女性の大腸腫瘍動物の寿命を大幅に向上します。これは EE が少なくとも減らすことができること示されて症状の一部は大腸癌に関連付けられているし、動物の健康を改善します。驚くことに、男性のこの改良された寿命減らされた腫瘍の直接の結果ではない、代わりに腫瘍の治癒改善マイクロバイ生物多様性6を含む応答の開始にリンクされていた。
いくつかの EE 特定研究は興味深い結果で公開されています。ただし、技術的な観点からには、重要な結果を多くの場合他の所に変換可能です。濃縮デバイスと使用すると、住宅だけではなく、非常に複雑な問題が、また寝具、食品、換気、繁殖、遺伝学、活動ルーム、動物のプロトコルでは、異なる研究室間の同一の EE 方法論を維持します。他の中の要件9,10,11。1 つの例は動物の統合場所動物必要があります安定統合マウスのコロニーにしたがって非治療関連効果を避けるために、遺伝的背景と食事組成を正規化します。さらに、多くの EE 研究疾患と共通のマウス飼育慣行が腸内マイクロバイ10,12の組成に影響を与えることができる方法でマイクロバイの重要性を実現する前に完了しています。
EE の繁殖戦略や動物の配置正しく実行がいない場合、ストレスを増やすことができます。EE 研究利用する多数のオスおよびメス動物および複数の遺伝子型が、実験のセットアップできますので難しい結合するいくつかのリットルから動物の要件を考えます。したがって、繁殖と離乳戦略は異なるリットルから正しい遺伝子型の離乳の動物の組み合わせを許可するように開発されました。この主な根拠はリットルの間で細菌叢を正常化して動物に実験環境に移動されたときに、ストレスを軽減します。マイクロバイはダム10から送信されました。植民地に微生物の多様性を提供するために女性がジャクソン研究所から購入し、1 ヶ月前に実験が始まった9,10,12コロニーに統合します。マイクロバイ生物多様性動物との間をさらに正常化するには、女性が共同繁殖前に収容されました。次の繁殖、飼育中に共同住宅、脱出する能力は、看護の仔は、妊産婦ケア13,14、おそらくマイクロバイ正規化を促進ストレス レベルを向上しました。非 EE を防ぐために関連、マイクロバイに及ぼす影響は、すべての実験動物のこの共同住宅 1 つ実験ケージに異なるリットルからいくつかの男性を結合するときに発生した戦闘と追加のストレスを防止しました。最後に、すべての遺伝子型の動物の等しい数は、ケージの中で含まれていた。これは遺伝子の全体改善微生物叢の多様性のための機会を提供、coprophagia (便を消費する動物の傾向) または全体的な研究.に可能な遺伝子型固有の動作の違いの貢献を削除
このプロトコルはマイクロバイ研究所叢正規化、もっと制服マイクロバイ集団を有効にする微生物叢伝送と動物コロニーの統合を含む知られている側面を含める前の EE 研究を拡大する戦略を提供します。実験動物の間これらの注意事項を聞き入れは調査の調査結果を混同する非治療関連微生物叢の違いの能力が不可欠です。EE 以外を排除する関連微生物叢変化には発病と進行中の微生物叢組成に EE の役割を定義する研究者ができるようになります。

<table><tbody><tr><td>Teklad Diets/Harlan Labs Chow</td><td>Harlan Labs</td><td>3980X</td><td>マリオ・カペッキ博士がHarlan Labsと共同で処方した標準照射チャウです。</td></tr><tr><td>Cell-Sorb Plus寝具</td><td>Fangman Specialties</td><td>82010</td>オート<td>クレーブ使用前に。</td></tr><tr><td>新生児のためのAIMSタトゥーシステム</td><td>AIMS</td><td>NEO-9</td><td>https://animalid.com/neonate-rodent-tattoo-identification/32。他の動物グレードのタトゥーシステムとインクは、アラミスマイクロタトゥーキットを含む同様の結果で使用することができます。</td></tr><tr><td>Zyfone One Cage 2100 AllerZone マウスマイクロアイソレータシステム ケージ、AllerZoneフィルタートップ、モジュール式ダイエットデリバリーシステム完備</td><td>ラボ製品</td><td>82120ZF</td><td>各EEケージには、各カタログ#82120ZF、82100ZF、82101ZFの1つと、82109ZFの2つが必要です。食べ物は片側だけにあります。</td></tr><tr><td>Zyfone One Cage 2100 Life Span Enrichment Device</td><td>Lab 製品</td><td>82109ZF</td><td>各EEケージには、各カタログ#82120ZF、82100ZF、および82101ZFの1つと、82109ZFの2つが必要です。食べ物は片側だけにあります。</td></tr><tr><td>Zyfone 1つのおり 2100のおり 2100のおり 13-7/8" 長さX 19-1/16"幅X 7-3/4"深さ</td><td>実験室プロダクト</td><td>82100ZF</td><td>各EEのおりは各カタログ#82120ZF、82100ZF、および82101ZFの1つ、また82109ZFの2つを必要とする。食べ物は片側だけにあります。</td></tr><tr><td>Zyfone One Cage 2100 AllerZone マイクロアイソレーターフィルタートップ</td><td>ラボ製品</td><td>82101ZF</td><td>各EEケージには、各カタログ#82120ZF、82100ZF、82101ZFの1つと、82109ZFの2つが必要です。食べ物は片側だけにあります。</td></tr><tr><td>トンネル</td><td>Bio-Serv</td><td>K3323またはK3332</td><td>ケージを一緒に接続し、濃縮のために使用</td></tr><tr><td>トンネルをケージに接続するためのグロメット</td><td>ユタ大学機械工場によって製造</td><td>n/a</td><td>材料が咀嚼およびオートクレーブに耐性があることを確認してください</td></tr><tr><td>ファストトラックホイール</td><td>Bio-Serv</td><td>K3250またはK3251</td><td>マウスイグルーと床で使用する</td></tr><tr><td>マウスイグル</td><td>ーBio-Serv</td><td>K3328、K3570またはK3327</td><td>ファストトラックホイールとフロアで使用</td></tr><tr><td>マウスイグルーフロア</td><td>Bio-Serv</td><td>K3244</td><td>マウスイグルーとファストトラック</td></tr><tr><td>マウスハット</td>で使用 <td>Bio-Serv</td><td>K3272、K3102、K3271</td><td></td></tr><tr><td>クロールボール</td><td>Bio-Serv</td><td>K3330またはK3329</td><td></td></tr><tr><td>Bio-hut</td><td>Bio-Serv</td><td>K3352</td><td>シェルターとネスティングに使用される木材パルプ小屋</td></tr><tr><td>粘着フィルム&nbsp;</td><td>VWR</td><td>60941-072</td> マウスが層流から<td>逃げるのを防ぐために、大きなケージのドリル穴を一時的に覆うために使用します</td></tr> 換気<tr><td>ラック</td><td>Techniplast</td><td>Bio-C36</td><td>この研究で使用したキャビネットは現在供給されていません。Bio-C36 もよく似ています。</td></tr><tr><td>1.5 mL マイクロフュージチューブ-RNAseおよびDNAseフリー</td><td>任意のサプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNAスツール MiniKit</td><td>Qiagen</td><td>51504</td><td>このキットは、50のDNA調製物用の試薬を供給します。便溶解バッファー=ASL;塩化グアニジニウム溶解バッファー= AL;緩衝液1を塩化グアニジン= AW1で洗浄します。ウォッシュバッファー2 = AW2;EDTA=AEウォーターバス付き溶出バッファー</td></tr><tr><td>(95°Cまで加熱可能)</td><td>任意のサプライヤー</td><td></td><td>便サンプルを94度インキュベーションして細胞を溶解します。</td></tr><tr><td>ウォーターバス(70度に加熱可能)</td><td>任意のサプライヤー</td><td></td>便<td>サンプルの70度のインキュベーション用&nbsp;</td></tr><tr><td>エタノール (200プルーフ)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>蛍光光度計: Qubit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA broad Range Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>EB Buffer or 10 mM Tris pH 8.5</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>実験特異的プライマー</td><td>任意のサプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCRグレード水</td><td>任意のサプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2X KAPA HiFi HotStart レディミックス&nbsp;</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2601</td><td>Amplicon Amplification用(1.25 mLで100 rxns)。</td></tr><tr><td>診断用ゲルの実行用アガロース</td><td>任意のサプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TapeStation 高感度 D1000 スクリーンテープトレース</td><td>Agilent</td><td>5067-5583</td><td>TapeStation またはバイオアナライザー機器は、ライブラリの品質を分析するための機関ゲノミクスコアで一般的です。あるいは、Bioanalyzer DNA1000 Chip(Agilent, 5067-1504)を使用することもできます。</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP Magnetic Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Magentic ビーズ PCRクリーンアップ用-5mLで250のPCR反応を洗浄できます</td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td>Life Technologies</td><td>AM10027</td><td></td></tr><tr><td>Library Preparation Guide</td><td>Illumina</td><td></td><td>Illumina. 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Illlumina MiSeq System用の16SリボソームRNA遺伝子アンプリコンの調製。 https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf。</td></tr><tr><td>ユニークなデュアルインデックス</td><td>Illumina</td><td>Illumina Experiment Managerソフトウェア</td><td>無料で入手可能: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html</td></tr><tr><td>Nextera XT 96インデックスキット</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1002</td><td>アンプリコンにバーコードを追加するために使用されます</td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 96ウェル反応プレート</td><td>Applied Biosystems/ThermoFisher</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq インデックスプレートフィクスチャ</td><td>イルミナ</td><td>FC-130-1005</td><td></td></tr><tr><td>粘着性クリアプレートシール</td><td>Applied Biosystems / ThermoFisher</td><td>4360954</td><td>Applied Biosystems / ThermoFisher Microamp 接着フィルム</td></tr><tr><td>MiSeqによるv3試薬とデュアル300 bpリードによるシーケンシング</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3003</td><td></td></tr><tr><td>PhiXコントロールキット</td><td>イルミナ</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼK (600mAU/ml)</td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td>プロテイナーゼKの20mg/mlに相当 QiaAmpキットに付属</td></tr><tr><td>データ分析ツール</td><td>Qiime</td><td>QIIMEソフトウェアツール</td><td>インストールはシステムによって異なる場合があり、QIIMEのウェブサイトにはいくつかのオプションが記載されています(http://qiime.org/install/install.html)。この研究では、MacQIIME ソフトウェア パッケージ 1.9.1 を使用しました (Werner Lab, SUNY, http://www.wernerlab.org/software/macqiime</td></tr><tr><td>Step 13.2.</td><td>Qiime</td><td>FastQ Join方式</td><td>&nbsp;(http://code.google.com/p/ea-utils &nbsp;)。&nbsp;この研究では、http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html 複数の結合ペアの端が使用されました。Aronesty, E. ea-utils: 生物学的シーケンシングデータを処理するためのコマンドラインツール。Expression Analysis、ノースカロライナ州ダーラム。(2011年)。</td></tr><tr><td>ステップ 13.3.</td><td>Qiime</td><td>De-Novo OTUピッキングプロトコル</td><td>http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html。</td></tr><tr><td>ステップ 13.3.1.</td><td></td> Uclust Edgar, R.C. Searchを使用した<td>Open Taxonomic Units(OTU)</td>検索<td>と、BLASTよりも桁違いに高速なクラスタリング。バイオインフォマティクス。26 (19), 2460-2461, doi:10.1093/bioinformatics/btq461 (2010).</td></tr><tr><td>ステップ 13.3.1.</td><td>Pynast</td><td>Pynast</td><td>Caporaso, J.G. et al. PyNAST: テンプレートのアラインメントに配列をアラインメントするための柔軟なツール。バイオインフォマティクス。26 (2), 266-267, doi:10.1093/bioinformatics/btp636 (2010).&nbsp;</td></tr><tr><td>ステップ 13.3.1.</td><td>Pynast</td><td>Pynast_Greengenes</td><td>DeSantis, T.Z. et al. Greengenes, キメラチェックされた16S rRNA遺伝子データベースおよびARBと互換性のあるワークベンチ。Appl Environ Microbiol.72 (7), 5069-5072, doi:10.1128/AEM.03006-05 (2006).Greengenesバージョン13_8は、この研究</td></tr><tr><td>13.3.1で使用されました。備考:&nbsp;</td><td>Qiime</td><td>Multiple Split Libraries</td><td>http://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html.</td></tr><tr><td>13.3.1. 注意事項:&nbsp;</td><td>Qiime</td><td>Pick de novo OTUsスクリプト</td><td>http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html&nbsp;</td></tr><tr><td>ステップ 13.2.2.</td><td>Qiime</td><td>マッピング ファイル</td><td>http://qiime.org/documentation/file_formats.html を作成します。</td></tr><tr><td>ステップ 13.2.2.</td><td>Qiime</td><td>マッピング ファイル http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html を検証し</td><td>ます。</td></tr><tr><td>ステップ 13.3.3.</td><td>Qiime</td><td>OTU をサンプルの説明にリンクし、マッピング ファイル</td><td>http://qiime.org/scripts/make_otu_network.html。</td></tr><tr><td>ステップ 13.3.4.</td><td>Qiime</td><td>プロット http://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html を通じて分類群を要約します</td><td>。</td></tr><tr><td>ステップ 13.3.5.</td><td>Qiime</td><td>Biome Summarize テーブル</td><td>http://biom-format.org/documentation/summarizing_biom_tables.html&nbsp;この研究では、すべてのサンプルを 20,000 OTU にレア化した後、QIIME でアルファ希薄化スクリプトを使用して分析しました。</td></tr></tbody></table>

マウスの大腸腫瘍モデルにおける結腸マイクロバイ生物多様性環境エンリッチメントの効果を定義する方法

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

いくつかの最近の研究は、人間の病気の改善に豊かな環境での生活の有益な効果を説明しています。マウスにおける環境エンリッチメント (EE) がマウスの免疫システムを活性化腫瘍を低減または腫瘍微小環境における改善マイクロバイ多様性を含む創傷修復応答を刺激することによって腫瘍軸受け動物の生存に影響を与えます。ここではマウスの大腸腫瘍モデルにおけるマイクロバイの生物多様性に関する環境エンリッチメントの効果を評価するための詳細な手順。動物飼育と動物の遺伝子型とマウス コロニー統合に関する考慮事項に関する注意事項、説明、すべての最終的に微生物生物多様性に影響を与えます。これらの注意事項を聞き入れより多くの均一マイクロバイ転送を許可することがあります、その結果調査の調査結果を混同することができます治療非依存の影響を軽減するため。さらに、この手順では、次の長期的な環境エンリッチメント遠位結腸から収集した便から分離された DNA の 16S rDNA 配列を使用してが微生物叢変化によって特徴付けられます。腸内細菌叢の不均衡は、炎症性腸疾患、大腸癌も肥満や糖尿病などの発症に関連付けられます。重要なは、さまざまな人間の病気を再現することができますマウスの堅牢なモデルが存在する疾患マイクロバイ病因の役割を研究する EE ・ マイクロバイ分析このプロトコルを利用できます。

いくつかの研究は、心身医学の実践は、健康上の成果を向上させることを実証しています。同様に、マウスの環境エンリッチメント向上寿命と腫瘍傷修理6などを含む成果が向上します。そこで、EE プロシージャは、最初の実験 (図 1) の開始前にマイクロバイ標準化中この表現型の微生物叢の役割を定義する目的で開発されました。重要なは、すべての繁殖動物は、繁殖の開始前に、少なくとも 1 ヶ月マウス コロニーに統合され新生の子犬が実験に先立ち叢伝送を正規化する 1 つ大きな檻の中で母親と共同収容。動物は 21 日と 28 日の間、各遺伝子型の等しい数がそれぞれ住宅、EE または NE 環境 (図 2A) に引き離されます。16 週ですべての動物から便が収集され、均質化 (図 2B) に続いて細菌 DN...

環境エンリッチメント (EE) は、ライフ スタイル、ストレスと病気間の接続の根底にあるメカニズムを明らかにするために使用される動物の住宅環境です。このプロトコルでは、動物の死亡に影響を与える可能性があります細菌の生物多様性の変化を定義する大腸腫瘍と EE のマウス モデルを使用する手順について説明します。

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

この出版物の主な目標は、げっ歯類のマイクロバイオームを正常化する方法を提示することです。このデモンストレーションでは、環境濃縮がマイクロバイオームに及ぼす影響を、結腸腫瘍の発生中に分析します。このプロトコルは、環境濃縮介入の前にマイクロバイオームを正常化することで、実験の再現性がどのように向上するかを示しています。また、豊かな環境を使用して動物のストレスを軽減し、相互作用を改善する方法も示します。私たちは結腸腫瘍モデルにおける環境濃縮の影響に焦点を当てていますが、この方法は、疾患の病因におけるマイクロバイオームの役割をよりよく理解するために簡単に適用できます。ケージは無菌状態で設置し、換気されたフードの下で作業します。この実験のコントロールは、ネスティング用の寝具と実験用組織を備えた従来のケージで構成されていますが、それ以外は濃縮装置がありません。子犬の飼育ケージや環境的に強化されたケージを設置するには、2つの大型オートクレーブケージを滅菌済みのグロメットで固定されたトンネルで接続し、各ケージに滅菌済みのプラットフォームを含めて床面積を増やします。EEの場合、滅菌された走行輪、トンネル、イグルー、小屋、クロールボール、ネスティング材もご用意ください。エンリッチケージとコントロールケージの両方を同じラックに配置して、均等に換気を行います。繁殖には、通常のケージで1頭の種牡馬と2頭の潜在的な母馬を組み合わせます。毎朝、動物が夜間に交尾したことを示す膣栓を確認してください。プラグが見られない場合、膣のプローブに対する抵抗は、内在化されたプラグを検出することができます。メスが膣栓を持っている場合は、大きな子犬飼育ケージに移します。最大12個の妊娠中のダムを、同じ週にすべてのダムが分娩することが期待されるプラットフォームを備えた環境的に豊かなケージに収容できます。子犬が生後21〜28日になったら、オスとメスを遺伝子型ごとに対照環境または濃縮環境に分配します。各ケージには、各遺伝子型の割合を保つようにしてください。非濃縮ケージは最大5匹のマウスを飼育できますが、濃縮ケージは社会刺激のために少なくとも20匹のマウスを必要とし、最大41匹のマウスを飼育できます。マウスを安楽死させる1〜2日前に便の収集を開始します。常に同じ時間帯に収集してください。生きている動物から便を集めるには、清潔なケージの上で動物を慎重に首をかしげます。次に、滅菌鉗子を使用して排便便を採取し、滅菌マイクロチューブに移します。動物がすぐに排便しない場合は、清潔なケージに入れて、動物が排便するのを待ちますが、これには最大1時間かかる場合があります。安楽死させた動物から便を採取するには、それを解剖して結腸にアクセスします。次に、盲腸のすぐ下の結腸を切り取り、濾紙の上に結腸を広げます。次に、鉗子を使用して結腸管の上部を持ち上げ、はさみを使用して内腔を開きます。縦方向に遠位から近位に切り取り、結腸を縦に開きます。次に、滅菌鉗子を使用して、遠位結腸から便を滅菌マイクロチューブに収集します。便のサンプルは摂氏マイナス80度で保管します。便に加えて、結腸や小腸、ミクロソーム、脂肪組織などから他の組織サンプルを採取します。市販のキットを利用して、便病原体検出プロトコルに従って便から微生物DNAを分離します。その際、マイナス80°Cの冷凍庫からサンプルをドライアイスに移し、秤量します。次に、テキストプロトコルに記載されているように、微生物DNAを増幅するPCRを設定します。次に、磁気ビーズを使用して反応生成物をクリーンアップします。クリーンアップのために、まずアンプリコンPCRプレートを短時間遠心分離して反応生成物をプールします。次に、磁気ビーズをボルテックスして均一に分散させ、20マイクロリットルのアリコートを各反応ウェルに移します。全量をゆっくりと10回ピペッティングして、ビーズを溶液と完全に混合します。その後、ビーズを5分間落ち着かせます。次に、PCRプレートを磁気スタンドに置き、ビーズの磁気収集後に上清が透明になるまで2分間待ちます。次に、上清を取り除いて捨てます。次に、プレートを磁石に置いたまま、ビーズの各ウェルに200マイクロリットルの新鮮な80%エタノールを入れ、30秒待ちます。次に、上清を慎重に取り除きます。この洗浄手順を一度繰り返し、ビーズを10分間自然乾燥させます。次に、プレートを磁気スタンドから取り外し、各ウェルに52.5マイクロリットルのトリスを加えて、ビーズから反応生成物を溶出します。全量をゆっくりと10回ピペッティングして、ビーズを溶液に完全に混合します。次に、前と同じように磁気スタンドにビーズを収集し、上清50マイクロリットルをきれいなPCRプレートに移します。プレートを透明な接着剤で覆い、マイナス20°Cで最大1週間保管します。採取した上清を使用してインデックスPCRを行い、バーコードをアダプター配列に付加します。次に、製品を精製し、シーケンシング用のインデックス付きライブラリを調製します。マウスでは、環境エンリッチメントが寿命と腫瘍創傷修復を改善することが知られています。この表現型における微生物叢の役割を定義するために、繁殖動物をマウスコロニーに少なくとも1か月間統合して、微生物叢を正常化しました。その後、彼らは繁殖され、その子孫は豊かな環境または通常の環境で育てられました。子孫もまた、腫瘍を有するか、または野生型であった。16週間後、動物を安楽死させ、糞便サンプルを採取して微生物DNAを分離しました。次に、PCRを使用してサンプル中の16Sリボソームサブユニットを増幅し、マイクロバイオームの成分を調査しました。次に、バーコードインデックスを使用して反応生成物を同定しました。興味深いことに、環境の強化は野生動物の生物多様性を改善しませんが、腫瘍を持つ動物の生物多様性を大幅に増加させます。これは、このメソッドの感度を示しています。この生物多様性の増加は、アルファプロテオバクテリアとベータプロテオバクテリアのクラスが大幅に増加し、病原性ガンマプロテオバクテリアが減少したプロテオバクテリア門の存在の増加に起因していました。ベータプロテオバクテリアクラスの最大の増加は、分泌された免疫グロブリンAの分解に関与する可能性のある共生細菌であるSutterella属でした。このビデオを見た後、関心のある介入を開始する前に、実験動物間のマイクロバイオームを正常化するために畜産慣行を変更する方法を十分に理解しているはずです。この手順を実行するときは、動物が環境内で自分の領域を確立していることを忘れないでください。このため、環境の変化はストレスを引き起こし、動物のマイクロバイオームに影響を与える可能性があります。動物の行動の突然の変化は、ストレスの身体的兆候です。この手順に続いて、特定の微生物を単離し、さらに特徴付けして、同定された微生物が疾患の進行に十分であるかどうかを試験することができます。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

私たちは迅速かつ一貫して人間の大腸炎に見られるものに形態学的および分子の類似点をもつマウスの大腸腫瘍を発生するプロ炎症剤デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）の3つのサイクルが続く遺伝毒性物質のアゾキシメタン（AOM）の投与にプロトコルを実証関連癌。...

アゾキシメタン（AOM）とデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）によるモデリング大腸炎関連癌

このビデオでは、結腸腫瘍担存マウスの糞便サンプルからのDNA分離プロトコルについて説明しています。抽出したDNAをPCRで増幅し、磁気ビーズベースのアプローチでさらに洗浄します。この方法は、環境濃縮が結腸微生物叢と動物の死亡率に及ぼす影響を判断するために使用できます。...

糞便微生物DNA単離:マウス腫瘍モデルにおける環境濃縮がマイクロバイオームの多様性に及ぼす影響の研究

このビデオでは、マウス近位結腸ループまたはpcLoopセグメントを生成する外科的処置と、その後に蛍光マーカーをセグメントに注入して腸上皮透過性を研究する手順について説明します。...

マウス近位結腸ループモデルの生成:管腔内注射後の血清中の蛍光マーカーの検出により、近位結腸ループを生成し、腸の透過性を測定する外科的処置

このビデオは、結腸炎症のあるインターロイキン-10欠損マウスに糞便微生物叢移植の手順を示しています。腸内でコロニー形成された糞便微生物は二次代謝産物を放出し、抗炎症性サイトカイン放出を誘発し、結腸の炎症を軽減します。...

インターロイキン-10欠損マウスにおける糞便微生物叢移植の影響の評価

過去数年間、新世代内視鏡は、ネズミ大腸炎および結腸直腸腫瘍を評価するための重要な診断研究助剤として浮上している。私たちはここに、マウスにおける炎症と大腸腫瘍の内視鏡的な評価だけでなく、大腸炎および大腸腫瘍の内視鏡的重症度を記録するために小数の識別子を使用して新たなスコアリングシステムのための詳細なプロトコルを提示する。...

検証済みの内視鏡スコアリングシステムを使用して、大腸炎および結腸直腸腫瘍の重症度を評価するためにマウスでの柔軟な大腸内視鏡検査

私たちは、硬性内視鏡を使用してマウスの結腸病理の治療薬の有効性を縦断的にモニタリングする方法を記述します。このプロトコルは、生きたマウスの個々の腫瘍の治療応答の特性評価や、潜在的な疾患の再発のモニタリングに容易に使用できます。...

生きたマウスのシリアル内視鏡イメージングを使用して、腸の異常のための新しい治療の有効性の非侵襲的評価

マウスの環境強化には、複雑で困難なセットアップと、マウスの堅牢な代謝および抗癌効果を保証するための包括的な飼育および取り扱い技術が必要です。このプロトコルは、マウスで上記の効果を再現するための詳細な手順を提供します。...

豊かな環境の住宅マウス用のプロトコル

ここでは、抗生物質誘発性疑似細菌フリーデキストラン硫酸ナトリウム誘発性大腸炎マウスモデルを確立するためのプロトコルを提示し、腸内細菌叢の役割を調査します 大腸炎に対するセ レウス菌 のプラスの効果を調節する。...

腸内細菌叢の調節による大腸炎に対する セレウス菌 投与の緩和効果の調査

3次元コロノイドの発生のためのマウス結腸陰窩の単離を詳述するプロトコルについて説明します。その後、確立されたコロノイドは、炎症性チャレンジを受ける前、または上皮単層を確立するように指示される前に、宿主上皮の細胞組成を反映するように最終分化され得る。...

確立されたマウスコロノイドに対する腸の炎症の上皮効果を in vitro で研究する

本プロトコルは、非炎症条件下で pks+大腸菌 をマウスに定着させるために必要な手順と、便中での pks+大腸菌 の拡大の定着と評価のための非侵襲的手法を説明しています。...

非炎症条件下でのマウス pks+大腸菌 の定殖

学ぶ マウスの大腸腫瘍モデルにおける環境エンリッチメントが腸内マイクロバイオーム多様性に与える影響を評価する方法。マイクロバイオームを正常化し、16S rDNAシーケンスで細菌叢の変化を解析することで、再現性の高い実験結果を得られます。

マウスの大腸腫瘍モデルにおける結腸マイクロバイ生物多様性環境エンリッチメントの効果を定義する方法

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