マウスの大腸腫瘍モデルにおける結腸マイクロバイ生物多様性環境エンリッチメントの効果を定義する方法

この出版物の主な目標は、げっ歯類のマイクロバイオームを正常化する方法を提示することです。このデモンストレーションでは、環境濃縮がマイクロバイオームに及ぼす影響を、結腸腫瘍の発生中に分析します。このプロトコルは、環境濃縮介入の前にマイクロバイオームを正常化することで、実験の再現性がどのように向上するかを示しています。

また、豊かな環境を使用して動物のストレスを軽減し、相互作用を改善する方法も示します。私たちは結腸腫瘍モデルにおける環境濃縮の影響に焦点を当てていますが、この方法は、疾患の病因におけるマイクロバイオームの役割をよりよく理解するために簡単に適用できます。ケージは無菌状態で設置し、換気されたフードの下で作業します。

この実験のコントロールは、ネスティング用の寝具と実験用組織を備えた従来のケージで構成されていますが、それ以外は濃縮装置がありません。子犬の飼育ケージや環境的に強化されたケージを設置するには、2つの大型オートクレーブケージを滅菌済みのグロメットで固定されたトンネルで接続し、各ケージに滅菌済みのプラットフォームを含めて床面積を増やします。EEの場合、滅菌された走行輪、トンネル、イグルー、小屋、クロールボール、ネスティング材もご用意ください。

エンリッチケージとコントロールケージの両方を同じラックに配置して、均等に換気を行います。繁殖には、通常のケージで1頭の種牡馬と2頭の潜在的な母馬を組み合わせます。毎朝、動物が夜間に交尾したことを示す膣栓を確認してください。

プラグが見られない場合、膣のプローブに対する抵抗は、内在化されたプラグを検出することができます。メスが膣栓を持っている場合は、大きな子犬飼育ケージに移します。最大12個の妊娠中のダムを、同じ週にすべてのダムが分娩することが期待されるプラットフォームを備えた環境的に豊かなケージに収容できます。

子犬が生後21〜28日になったら、オスとメスを遺伝子型ごとに対照環境または濃縮環境に分配します。各ケージには、各遺伝子型の割合を保つようにしてください。非濃縮ケージは最大5匹のマウスを飼育できますが、濃縮ケージは社会刺激のために少なくとも20匹のマウスを必要とし、最大41匹のマウスを飼育できます。

マウスを安楽死させる1〜2日前に便の収集を開始します。常に同じ時間帯に収集してください。生きている動物から便を集めるには、清潔なケージの上で動物を慎重に首をかしげます。

次に、滅菌鉗子を使用して排便便を採取し、滅菌マイクロチューブに移します。動物がすぐに排便しない場合は、清潔なケージに入れて、動物が排便するのを待ちますが、これには最大1時間かかる場合があります。安楽死させた動物から便を採取するには、それを解剖して結腸にアクセスします。

次に、盲腸のすぐ下の結腸を切り取り、濾紙の上に結腸を広げます。次に、鉗子を使用して結腸管の上部を持ち上げ、はさみを使用して内腔を開きます。縦方向に遠位から近位に切り取り、結腸を縦に開きます。

次に、滅菌鉗子を使用して、遠位結腸から便を滅菌マイクロチューブに収集します。便のサンプルは摂氏マイナス80度で保管します。便に加えて、結腸や小腸、ミクロソーム、脂肪組織などから他の組織サンプルを採取します。

市販のキットを利用して、便病原体検出プロトコルに従って便から微生物DNAを分離します。その際、マイナス80°Cの冷凍庫からサンプルをドライアイスに移し、秤量します。次に、テキストプロトコルに記載されているように、微生物DNAを増幅するPCRを設定します。

次に、磁気ビーズを使用して反応生成物をクリーンアップします。クリーンアップのために、まずアンプリコンPCRプレートを短時間遠心分離して反応生成物をプールします。次に、磁気ビーズをボルテックスして均一に分散させ、20マイクロリットルのアリコートを各反応ウェルに移します。

全量をゆっくりと10回ピペッティングして、ビーズを溶液と完全に混合します。その後、ビーズを5分間落ち着かせます。次に、PCRプレートを磁気スタンドに置き、ビーズの磁気収集後に上清が透明になるまで2分間待ちます。

次に、上清を取り除いて捨てます。次に、プレートを磁石に置いたまま、ビーズの各ウェルに200マイクロリットルの新鮮な80%エタノールを入れ、30秒待ちます。次に、上清を慎重に取り除きます。

この洗浄手順を一度繰り返し、ビーズを10分間自然乾燥させます。次に、プレートを磁気スタンドから取り外し、各ウェルに52.5マイクロリットルのトリスを加えて、ビーズから反応生成物を溶出します。全量をゆっくりと10回ピペッティングして、ビーズを溶液に完全に混合します。

次に、前と同じように磁気スタンドにビーズを収集し、上清50マイクロリットルをきれいなPCRプレートに移します。プレートを透明な接着剤で覆い、マイナス20°Cで最大1週間保管します。採取した上清を使用してインデックスPCRを行い、バーコードをアダプター配列に付加します。

次に、製品を精製し、シーケンシング用のインデックス付きライブラリを調製します。マウスでは、環境エンリッチメントが寿命と腫瘍創傷修復を改善することが知られています。この表現型における微生物叢の役割を定義するために、繁殖動物をマウスコロニーに少なくとも1か月間統合して、微生物叢を正常化しました。

その後、彼らは繁殖され、その子孫は豊かな環境または通常の環境で育てられました。子孫もまた、腫瘍を有するか、または野生型であった。16週間後、動物を安楽死させ、糞便サンプルを採取して微生物DNAを分離しました。

次に、PCRを使用してサンプル中の16Sリボソームサブユニットを増幅し、マイクロバイオームの成分を調査しました。次に、バーコードインデックスを使用して反応生成物を同定しました。興味深いことに、環境の強化は野生動物の生物多様性を改善しませんが、腫瘍を持つ動物の生物多様性を大幅に増加させます。

これは、このメソッドの感度を示しています。この生物多様性の増加は、アルファプロテオバクテリアとベータプロテオバクテリアのクラスが大幅に増加し、病原性ガンマプロテオバクテリアが減少したプロテオバクテリア門の存在の増加に起因していました。ベータプロテオバクテリアクラスの最大の増加は、分泌された免疫グロブリンAの分解に関与する可能性のある共生細菌であるSutterella属でした。

このビデオを見た後、関心のある介入を開始する前に、実験動物間のマイクロバイオームを正常化するために畜産慣行を変更する方法を十分に理解しているはずです。この手順を実行するときは、動物が環境内で自分の領域を確立していることを忘れないでください。このため、環境の変化はストレスを引き起こし、動物のマイクロバイオームに影響を与える可能性があります。

動物の行動の突然の変化は、ストレスの身体的兆候です。この手順に続いて、特定の微生物を単離し、さらに特徴付けして、同定された微生物が疾患の進行に十分であるかどうかを試験することができます。