Name: リポ多糖投与マウス肝臓における免疫応答時に白血球の二光子励起生体イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: 学ぶ 二光子励起生体イメージングを用いて、リポ多糖投与マウス肝臓における白血球の動態と形態をリアルタイムで観察する方法。最小侵襲の外科手技で敗血症時の免疫応答を可視化し、肝臓免疫学の理解と治療評価に貢献します。

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この研究助成金から国立研究財団の韓国 (NRF) (Y m グラント号 2016R1A2B4008199 MSIP。 韓国政府によって資金を供給されるによって支えられましたH.) 厚生省と韓国の福祉 (許可番号: HI14C1324)。

すべてのプロシージャは、機関動物ケアおよび使用委員会の延世大学医科大学、韓国のガイドラインにしたがって運営しました。LysM 緑の蛍光蛋白質 (GFP; gfp/+) マウス8と CX3Cr1 GFP (gfp/+) 生体イメージングのための 8-12 週齢9マウスが使用されました。すべての手術器具はオートクレーブと 70% アルコールで消毒.
1. カスタム設計されたマウス肝イメージング ツールのサポート室
<ol><li>マウス肝イメージング室の設計<ol>
<li>(図 1) をイメージング マウス肝臓の次のサイズの部屋を作る: 内側のチャンバー (120 mm 長さ × 幅 160 mm × 30 mm 高さ)、外側室内 (100 mm 長さ × 幅 100 mm × 24 mm)、ボルト (Ф 3 × 30 mm 高さ)、ナット (Ф 4 mm)、と翼形ナット (Ф 4 mm)。</li>
		<li>硬化エージェントとエラストマーの比が 1:9 の基本とのシリコーンの 120 g の合計を測定します。</li>
		<li>液状シリコーン混合物を 250 mL の三角フラスコに入れて、よく混ぜてね。フラスコを乾燥器に入れて、ポンプを真空下で約 1 時間の空気の泡を削除します。</li>
		<li>カスタム設計されたマウスの商工会議所の高さ 10 mm ほどに液状シリコーン ミックスを注ぐそれをさせ (図 1 a) の日のカップルのための治療法。</li>
	</ol>
</li>
	<li>カバー スライドとベッドを固定レバーの準備<ol>
<li>金属製のフレームでは、シリコーン接着剤を使用してガラスを添付します。1 日 (図 1 b) で乾燥させます。</li>
		<li>水浸漬レンズ用蒸留水を効果的に保持するために半永久的な水ブロック構造が不可欠です。1 mm のシリコーン接着剤を丸めを行い、一晩それを強化します。</li>
		<li>硬化剤とエラストマー ベースのミックスし、それを注ぐ高さの約 8-10 mm。 実行 6 ウェル プレートに硬化プロセス 1.1.2-1.1.4 で説明したよう。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 組合の準備
<ol><li>1 × リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 性腸炎サルモネラ血清型から LPS 粉末を希釈するための準備します。(1 × PBS: 137 mM 2.7 mM KCl 塩化ナトリウム 10 mM Na2HPO4、1.8 mM KH2PO4)。</li>
	<li>37 ° c の水浴の PBS を予熱して慎重に LPS 粉ボトル (25 mg) を開きます。</li>
	<li>ピペットで移しなさい援助を使用して、滅菌 PBS (5 mL) を注ぎ LPS パウダー ボトルと優しくかき混ぜるまたは在庫ソリューションを準備するソリューションを中断します。 注: LPS 粉末を液状、過酷なボルテックス泡が発生できます。1.5 mL チューブの因数を作るときに損失を最小限にするために泡を避けます。</li>
	<li>− 20 ° C、LPS 原液を格納し、注射用 1 mg/mL 組合ソリューションに希釈します。</li>
	<li>1 mg/mL の LPS 溶液 (20 mg/kg) を 1 mL の注射器を使用して非麻酔下マウスの腹膜に注入します。対照動物の PBS の同じボリュームを挿入します。</li>
	<li>十分な炎症性応答を 2 時間待つ。</li>
</ol>3. 血管を染色するテキサス赤デキストランの準備
<ol><li>2 つの 15 mL の円錐管と滅菌 PBS の 10 mL を準備します。</li>
	<li>テキサス赤デキストラン粉 (25 mg) 3 mL の PBS を希釈し、よく混ぜます。空 15 mL の円錐管に混合物を転送します。</li>
	<li>デキストランの混合物 (3 mL) を含む 15 mL の円錐管に残り PBS (7 mL) を転送します。</li>
	<li>0.45 μ m のシリンジ フィルターを 10 mL の注射器の先端に接続します。シリンジ フィルターが針を置き換える必要があります。</li>
	<li>デキストランの混合物 (10 mL) をフィルター処理します。こぼれることを避けるために均等に押し、注射器。</li>
	<li>光ブロック 1.5 mL チューブにデキストラン溶液 2.5 mg の 500 μ L を分注、− 20 ° C で保存解凍後、4 ° C で保存します。</li>
</ol>4. 手術のプロセス
<ol><li>手術テーブルと、手術前に 70% アルコールを使用してすべての機器を消毒します。肝切除のためのツールを設定し、37 ° c (図 2 a、 B) 加熱プレートを調整します。</li>
	<li>麻酔、腹腔チレタミン/チレタミンの 30 mg/kg とキシラジンの 10 mg/kg、マウスを注入します。これらのソリューションは、混合し、同時射出のため PBS で希釈できます。マウスのつま先を軽く押す anesthetization を確認します。 反射がない場合次の手順に進みます。</li>
	<li>マウスの網膜の乾燥を防ぐために眼軟膏の少量を適用します。</li>
	<li>脱毛クリーム (図 2) を使用して腹部周辺の体毛を削除します。</li>
	<li>尾静脈またはインスリン注射器 (図 2 D) を使用してレトロな軌道注入を介してテキサス赤デキストラン溶液 (2.5 mg/mL の濃度) の 200 μ L を注入します。</li>
	<li>マーカーで右弓下の領域をマークします。剣状突起から肋骨の終わりに線描する必要があります。鉗子、はさみ (図 2 e, F) で表皮をカットします。</li>
	<li>マイクロ剪刀、鉗子を用いた腹腔内を開き、慎重に肝臓を公開します。左葉外側綿棒 (図 2, H) を使用して展開する必要があります。</li>
	<li>肝臓の乾燥を防ぐために腹腔内に 500 μ L の滅菌 PBS を注ぐ。</li>
	<li>カスタム設計されたチャンバーで右側臥位でマウスを置き、シリコン ベッドに組織接着剤の少量を適用します。その後、綿棒 (図 2 i) を用いた肝慎重に取り付けます。 メモ: 肝臓の組織は非常にもろい、機械的に引っ張らないで、肝を。優しく、綿棒でそれをロールアウトします。</li>
	<li>数秒後は、500 μ L の肝臓から乾燥を防ぐため滅菌 PBS で再び肝臓を濡れています。肝臓に金属製のフレームを置き、ナット (図 2 j) でしっかりと固定します。</li>
</ol>5 2 光子顕微鏡を用いた肝臓の生体イメージング
<ol><li>880 nm、緑、セットし禅ソフトウェア (カールツァイス) レーザーをオンに、波長を設定するを実行し、赤のチャンネル。蛍光強度 (図 3 a) によるとレーザー パワーを調整します。排出フィルター情報のとおりです: グリーン/Alexa488、500-550 nm、赤/Alexa 555、575 610 nm。</li>
	<li>イメージングの段階でチャンバーを配置し、水浸対物レンズ カバー ガラスに近い X 20 を配置します。</li>
	<li>その体温 (図 3 b) を維持するためにマウスの体の下でシリコン ラバー ヒーターを修正します。</li>
	<li>金属製のフレームに 500 μ L の蒸留水をドロップ、肝臓 (図 3) に近い対物レンズを引き出します。</li>
	<li>イメージングの領域の深さを調べるし、フォーカスを調整します。</li>
	<li>イメージングを実施します。</li>
	<li>長期用チレタミン/チレタミンとキシラジンの混合物の半分線量イメージング中にそれぞれの時間を挿入します。この段階で、37 ° C でマウスの体温を維持することが不可欠です。常に目にマウスに anesthetization 時間とすべてのマウスは異なりますので。 注: このメソッドは手術とイメージング後回復に適していません。我々 は倫理的手術後すぐにマウスを犠牲します。</li>
	<li>安定した anesthetization の 30 分毎のペダルの反射神経をチェックします。</li>
</ol>6. データの分析
<ol><li>データ分析ソフトウェア Volocity を開き、ソフトウェアにライブラリ内の生データをインポートします。</li>
	<li>状況に合わせて、スナップショット画像からノイズを除去します。 注: 滑らかな画像を得るためには、'罰金または '中央' のフィルターを使用します。さらに、暗いまたはぼやけた画像を明確にするのに 'コントラスト強調' 機能を使用します。</li>
	<li>スナップショット画像を JPEG または TIFF ファイルと AVI ファイルの映画の 100%、輸出に編集した項目に適合します。</li>
</ol>

<ol><li>Girard, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fuels%2C+hormones%2C+and+liver+metabolism+at+term+and+during+the+early+postnatal+period+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat.</a> J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).</li>
<li>Marques, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+liver+biology+in+vivo+using+conventional+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy.</a> Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).</li>
<li>Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+Microscopy+Imaging+of+the+Liver+following+Leishmania+Infection%3A+An+Assessment+of+Hepatic+Hemodynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics.</a> J Vis Exp. (101), e52303(2015).</li>
<li>Honda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+neutrophil+recruitment+in+hepatic+ischemia-reperfusion+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice.</a> Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).</li>
<li>Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+spinning-disk+confocal+microscopy+for+the+intravital+analysis+of+platelet+dynamics+in+response+to+systemic+and+local+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation.</a> PLoS One. 6 (9), e25109(2011).</li>
<li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145(2012).</li>
<li>Sierro, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Liver+Capsular+Network+of+Monocyte-Derived+Macrophages+Restricts+Hepatic+Dissemination+of+Intraperitoneal+Bacteria+by+Neutrophil+Recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment.</a> Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).</li>
<li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 719-726 (2000).</li>
<li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+fractalkine+receptor+CX%283%29CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).</li>
<li>Heymann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+intravital+multiphoton+microscopy+imaging+of+immune+cells+in+healthy+and+diseased+liver+using+CXCR6.Gfp+reporter+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li>
</ol>

著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

肝臓は多くのグループ3,10, その機能の重要性のために積極的に研究されています。例えば、ヘイマンらは agarose を使用して繊細な手法を提案します。ただし、このメソッドは、高精度なことが判明した、アガロースの設定時間がかかります。ただし、私たちの方法論ですべての手順が実施される他の交絡因子を最小限に抑え、30 分以内。ハートビートは、ビデオを乱すことがので第二に、肝臓を安定化非常に重要です。この現象を避けるためには、マウスを右側臥位に再配置されます。
このプロトコルでもう一つの重要なステップは、金属製のカバー フレームと金属製のバー上でその場所の生産だった。私たちが直面した最も重要な障害だった肝固定圧力の適切な量を使用してに応じて肝壊を克服する方法を決定します。当初、蝶ナットのみがカバー スライドを保持するために適用されたとき血液の循環が低下して、肝臓がカバー スライドの重量に耐えることができませんでした。代わりに、バーに沿ってカバー スライドを配置する前にボ...

肝臓は、哺乳類の主要な代謝器官それはエネルギー、ホルモンおよび解毒1の司令塔として機能します。その重要性のため研究者は炎症時に肝臓の変化を明らかにする多くの in vitroとin vivoの実験を行った。肝2からのライブ画像をキャプチャする生体顕微鏡を使用されています。確かに、イメージングの方法をされている様々 な肝臓は2,3,4,5,6を導入しました。しかしより簡易な外科的アプローチを開発、標的臓器や免疫細胞の安定化を達成するために、我々 は生体イメージングのための彼らの努力を最小限に抑えるための研究者を導くことができる単純なプロトコルを設計しました。
本研究では、安定的かつ新規イメージング室と出血や可能な限りの感染を最小限に抑えるために使用できる手術手技を紹介しました。肝臓は 2 時間以上そのまま残ったことを確かめた。この方法では、我々 は正常に LCMs7と敗血症性条件下における好中球の形態を識別されます。以来、このメソッドは、手術中に震えていると予期せぬ炎症など物理的・生物的交絡要因を最小化、このメソッドを使用して応答で肝臓の免疫細胞の急性反応を観察することができると見込んでください。試薬には、LP が好きです。

<table><tbody><tr><td>カスタムデザインチャンバー</td><td>ライブセルインスツルメンツ</td><td></td><td>カスタムデザインサイズ</td></tr><tr><td>メタルカバースライド</td><td>ライブセルインスツルメンツ</td><td></td><td>カスタムデザインサイズ</td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>電子顕微鏡科学#</td><td>72204-03</td><td></td></tr><tr><td>シルガード 184 シリコーンエラストマーキット</td><td>ダウ コーニング</td><td></td><td></td></tr><tr><td>三角フラスコ</td><td>DURAN</td><td>21 216 36</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養プレート(フラットタイプ)</td><td>HYUNDAI Micro Co.</td><td>H31006</td><td></td></tr><tr><td>デシケーター</td><td>ADARSH</td><td>55204</td><td></td></tr><tr><td>High Q BOND SE 5 mL</td><td>BJM LAB</td><td></td><td>半永久的なダムを作るには</td></tr><tr><td>フレキシブル シリコーン ゴム ヒーター</td><td>オメガ</td><td>SRFR/SRFG シリーズ、M1250/0800</td><td></td></tr><tr><td>DC 電源</td><td>東洋工大</td><td>DP30-03A</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td></td><td></td><td>自家製</td></tr><tr><td>サルモネラ菌由来のリポ多糖類(LPS) 血清型腸炎</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6011</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red Dextran</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1830</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 高透明度ポリプロピレン 円錐管</td><td>FALCON</td><td>14-959-49B</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu;mフィルター (Minisart シリンジフィルター)</td><td>ザルトリウス</td><td>16555k</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml マイクロチューブ 琥珀色</td><td>アクシゲン</td><td>MCT-150-X</td><td>遮光用</td></tr><tr><td>1mLシリンジ</td><td>韓国ワクチン</td><td>KV-S01</td><td></td></tr><tr><td>3mLシリンジ</td><td>韓国ワクチン</td><td>KV-S03</td><td></td></tr><tr><td>10mLシリン</td>ジ <td>韓国ワクチン</td><td>KV-S10</td><td></td></tr><tr><td>0.3mLインスリンシリンジ</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td>324900</td><td></td></tr><tr><td>脱毛クリーム 100 mL</td><td>ボディ ナチュア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>綿棒</td><td>ABDI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ゾレチル 50 5 mL</td><td>ヴィルバック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ロンプン 10 mL</td><td>バイエル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒーティング プレート</td><td>ライブ セル インスツルメンツ</td><td>PH-S-10</td><td>カスタムデザイン</td></tr><tr><td>サイズ DC コントローラー</td><td>ライブ セル インスツルメンツ</td><td>CU-301</td><td></td></tr><tr><td>マイクロデスセクションはさみ</td><td>ハーバード装置</td><td>72-5418</td><td></td></tr>は<tr><td>さ</td>み<td>Roboz</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>Roboz</td><td>RS-5137</td><td></td></tr>獣<tr><td>医結合</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>ZENソフトウェア(ブラックエディション)</td><td>カールツァイ</td><td></td>ス<td>LSM用プログラム7 MP</td></tr><tr><td>LSM 7 MP</td><td>カールツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>分析プログラム</td></tr></tbody></table>

リポ多糖投与マウス肝臓における免疫応答時に白血球の二光子励起生体イメージング

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

敗血症は組織と臓器障害を引き起こす可能性が重度の感染症の種類の損傷。敗血症に関連する死亡率および罹患率率が非常に高く、ない直接の治療または臓器関連のメカニズムをリアルタイムで詳細に調べた。肝臓は毒素と人間の体内で感染症を管理する主要臓器であります。ここで、肝被膜マクロファージ (LCMs) 好中球などの免疫細胞の運動性を追跡するためにエンドトキシンの誘導後マウス肝臓の生体イメージングを実行する目的とします。したがって、露出低侵襲手術と肝臓の手術法を考案しました。リポ多糖 (LPS)、一般的なエンドトキシンを腹腔内に注入したマウス。露出と LPS 投与する LysM 緑の蛍光蛋白質 (GFP) でマウスの肝臓、その好中球がわかった募集の生体イメージングのための外科的手法を使用してマウスの肝臓はリン酸バッファーのそれと比べると増加しました。生理食塩液投与の肝。LPS 処理後の好中球数は時間と大幅に増加。また、CX3Cr1 GFP マウスを使用して、我々 は正常に、LCMs と呼ばれる肝マクロファージを可視化。したがって、生体内で免疫の移動を制御する新しい試薬の有効性を調べるためには、運動性および肝臓における好中球および LCMs の形態を決定することができによる臓器障害や組織損傷の治療の効果を識別するために敗血症における白血球の活性化。

シンプルで非常に安定した画像処理室が考案されました。チャンバーの下部は、マウス本体と臓器のすべりを防止するシリコンで覆われていた。また、シリコンは弾力性の適切な量があるのでそれはカバーのスライド (図 1 a, C) の圧力による損傷が予想されるを防ぐことができます。第二に、組織の安全な接着剤 (ボンド獣医) は、シリコーンの円形のベッドの上で抽出した肝臓を修正するために適用されました。このメソッドには、心拍や呼吸運動によって引き起こされる震えているを避けるために私たちが有効になります。最後に、金属カバー スライドは配置され固定ボルトとナット、マウスの体サイズと突出レバー (図 1 b-D) の位置に基づきます。麻酔が正しく実行されたときこれらのイメージング設定 6 h 以上最後の可能性があります。
<p class="jove_content"...

最小の侵入と生きたマウス肝臓の二光子励起イメージングのための新しい外科プロトコルを設立しました。この手法は、リポポリサッカライド誘起ブタエンドトキシン肝臓の微細構造を確認できた。肝の白血球の遊走に各種の試薬処理の有効性を決定するこのメソッドが利用されることを期待しています。

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

この手順の全体的な目標は、敗血症性ショック中に肝臓内の白血球の形態と機能を観察することです。この手法の主な利点は、肝臓内の白血球の直接ビデオを取得できることです。手術前に、70%エタノールを使用して手術台とすべての器具を消毒してください。次に、肝臓手術用のツールをセットアップし、加熱プレートを摂氏37度に調整します。テキストプロトコルに従ってLPSまたはPBSを注射したマウスに麻酔をかけた後、網膜の乾燥を防ぐために少量の眼軟膏を塗布します。カミソリと脱毛クリームを使って、腹部の周りの毛を取り除きます。次に、濡れたガーゼを使用して腹部をきれいにします。インスリン注射器を使用して眼窩後注射を行いながら、200マイクロリットルのテキサスレッドデキストラン溶液を注入します。マーカーを使用して、キシフス突起から肋骨の端までの右肋骨下領域をマークします。その後、ポビドンヨウ素をマウスの腹部に塗布して、二次感染を防ぎます。鉗子とハサミを使って表皮をカットします。次に、マイクロハサミや鉗子を使って腹腔を開き、肝臓を丁寧に露出させます。綿棒を使用して、左側葉を広げます。次に、肝臓が乾燥するのを防ぐために、腹腔に500マイクロリットルの滅菌PBSを注ぎます。マウスをカスタム設計のチャンバー内の正しい褥瘡位置に置き、シリコンベッドに少量のティッシュ接着剤を塗布します。次に、綿棒を使用して肝臓を慎重に取り付けます。肝臓組織は非常にもろいです。肝臓を露出させて保持するときは、鋭利な工具や重い工具を使用しないでください。数秒後、肝臓が乾燥するのを防ぐために、肝臓を500マイクロリットルの滅菌PBSで再び濡らします。次に、金属フレームを肝臓に置き、ナットを使用してしっかりと固定します。金属フレームを配置する前に、必ずサポートナットを配置してください。これにより、金属フレームの圧力が軽減されます。肝臓の生体内イメージングを実行するには、Zenソフトウェアを実行してレーザーをオンにします。波長を880ナノメートルに設定し、緑と赤のチャンネルを設定します。次に、蛍光強度に応じてレーザー出力を調整します。チャンバーをイメージングステージに置き、20パワー水浸対物レンズをカバーガラスの近くに配置します。シリコンラバーヒーターをマウス本体の下に固定して、体温を維持します。次に、金属フレームに500マイクロリットルの蒸留水を汲み上げます。次に、対物レンズを肝臓の近くに配置します。ピントを調整し、撮像領域の深さと時間を決定します。長期イメージングの場合は、倫理的な理由から、イメージング中に 1 時間ごとに、以前に調製した Zoletil と Rompun 麻酔薬の混合物の半分の用量を注入します。体温を摂氏37度に保ち、麻酔時間はマウスごとに異なるため、常にマウスに注意してください。データを分析するには、Velocity を開き、ライブラリから生データをインポートします。次に、画像からノイズを取り除き、スナップショットを撮ります。最後に、編集したアイテムを100%に合わせ、スナップショット画像の場合はJPEGまたはTIFファイル、ムービーの場合はAVIファイルとしてファイルをエクスポートします。対照マウスの生体内イメージング解析により、血管内を循環する好中球が少数であることが示されました。一方、好中球の数はLPSで治療されたマウスで有意に増加しました。LPS状態では、多くの好中球が血流内を循環していましたが、血管外には移動しませんでした。これらの動画に見られるように、LPS処理マウスは対照マウスに比べて好中球が管腔表面にしっかりと付着していたため、好中球が血管内で検出されやすくなっていました。好中球の運動性とは別に、CX3CR1-GFPマウスの肝臓被膜マクロファージ(LCM)は、肝臓組織の深部ではなく表面で観察されました。さらに、LCMはLPSで治療したマウスでも肝臓での動きや活性化をほとんど示さなかった。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば30分で完了できます。この手順を試行するときは、剣状突起から右肋骨下腹部の端までの切開線を設定することを忘れないでください。この手順に続いて、肝臓が損傷や感染からどのように回復するかなどの追加の質問に答えるために、治療注射などの他の方法を実行できます。この技術の開発後、この技術は、医学分野の研究者が敗血症中の白血球の反応を調査し、潜在的な薬剤をテストするための道を開きました。このビデオを見た後、腹部の切開を最小限に抑えて肝臓を露出させる方法をよく理解しているはずです。リポ多糖類での作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には滅菌や手洗いなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

two-photon-intravital-imaging-leukocytes-during-immune-response

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ここで、我々は、マウスの足蹠にホーミング白血球を研究する非侵襲的二光子（2P）顕微鏡のアプローチを説明します。私たちは、組織イメージングの準備の技術的側面を議論し、実行してデータ収集するための初期設定から典型的な実験を通してリーダーを歩く。...

白血球ホーミングと移行の非侵襲的イメージング in vivoで</em

2光子顕微鏡の最近の進歩により、リアルタイムを有効にしている...

マウス膝窩リンパ節の生体内イメージング

この記事では、画像取得と分析のための特定の方法論と組み合わせて、生体内顕微鏡イメージングを使用して、マウスの肝臓血管系の個々の血管内の血流速度の動的測定と定量化の詳細な方法について報告します。...

以下の肝臓の生体顕微鏡イメージング<em&gt;リーシュマニア</em&gt;感染症：肝血行動態の評価

肝臓の免疫細胞の安定した生体内高解像度イメージングは困難です。ここでは、マウス肝臓内の免疫細胞の遊走と細胞間相互作用を、インテンシブケアモニタリングと組み合わせた生体内多光子レーザー走査型顕微鏡法と組み合わせた長時間(約6時間)にわたって研究するための高感度で信頼性の高い方法を提供します。...

CXCR6.Gfpレポーターマウスを使用して、健康で罹患肝臓における免疫細胞の長期生体内多光子顕微鏡イメージング

この簡略化されたマウスの腸間膜静脈の生体内顕微鏡検査は、白血球-内皮および血小板-白血球の相互作用を観察するためのさまざまな炎症モデルで使用できます。...

マウスの腸間膜静脈内の生体顕微鏡白血球 - 内皮及び血小板 - 白血球の相互作用

私たちは、麻酔をかけたマウスの生体内共焦点顕微鏡を使用して、定常状態および炎症条件下で腸間膜静脈の好中球と単球の挙動を監視するためのプロトコルを詳述しています。...

リアルタイムで麻酔したマウスに生体顕微鏡により腸間膜静脈に好中球および単球のイメージング

ここでは、CD11c.DTRマウスの気管内ジフテリア毒素処理によって誘発される、無菌性劇症性心筋炎のネズミモデルにおける心臓のCD45 +白血球浸潤を視覚化するための薄片顕微鏡法を説明する。...

光シート顕微鏡による劇症心筋炎のマウスモデルにおける白血球浸潤の定量的可視化

プローブに細菌の病原体を用いた細胞・生体レベルのホスト応答

逆紡糸円盤共焦点顕微鏡によるマウス小腸のインビタルイメージングを用いてGFP標識γΔ...

マウス小腸における上皮内リンパ球の分体イメージング

ここでは、移植したマウスの左肺を2光子顕微鏡で生体内イメージングするプロトコールを紹介します。これは、マウス肺移植後の細胞動態と相互作用をリアルタイムで研究するための貴重なツールです。...

移植されたマウス肺の生体内2光子顕微鏡検査

学ぶ 二光子励起生体イメージングを用いて、リポ多糖投与マウス肝臓における白血球の動態と形態をリアルタイムで観察する方法。最小侵襲の外科手技で敗血症時の免疫応答を可視化し、肝臓免疫学の理解と治療評価に貢献します。

リポ多糖投与マウス肝臓における免疫応答時に白血球の二光子励起生体イメージング

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