リポ多糖投与マウス肝臓における免疫応答時に白血球の二光子励起生体イメージング
2018年2月6日
最小の侵入と生きたマウス肝臓の二光子励起イメージングのための新しい外科プロトコルを設立しました。この手法は、リポポリサッカライド誘起ブタエンドトキシン肝臓の微細構造を確認できた。肝の白血球の遊走に各種の試薬処理の有効性を決定するこのメソッドが利用されることを期待しています。
この手順の全体的な目標は、敗血症性ショック中に肝臓内の白血球の形態と機能を観察することです。この手法の主な利点は、肝臓内の白血球の直接ビデオを取得できることです。手術前に、70%エタノールを使用して手術台とすべての器具を消毒してください。
次に、肝臓手術用のツールをセットアップし、加熱プレートを摂氏37度に調整します。テキストプロトコルに従ってLPSまたはPBSを注射したマウスに麻酔をかけた後、網膜の乾燥を防ぐために少量の眼軟膏を塗布します。カミソリと脱毛クリームを使って、腹部の周りの毛を取り除きます。
次に、濡れたガーゼを使用して腹部をきれいにします。インスリン注射器を使用して眼窩後注射を行いながら、200マイクロリットルのテキサスレッドデキストラン溶液を注入します。マーカーを使用して、キシフス突起から肋骨の端までの右肋骨下領域をマークします。
その後、ポビドンヨウ素をマウスの腹部に塗布して、二次感染を防ぎます。鉗子とハサミを使って表皮をカットします。次に、マイクロハサミや鉗子を使って腹腔を開き、肝臓を丁寧に露出させます。
綿棒を使用して、左側葉を広げます。次に、肝臓が乾燥するのを防ぐために、腹腔に500マイクロリットルの滅菌PBSを注ぎます。マウスをカスタム設計のチャンバー内の正しい褥瘡位置に置き、シリコンベッドに少量のティッシュ接着剤を塗布します。
次に、綿棒を使用して肝臓を慎重に取り付けます。肝臓組織は非常にもろいです。肝臓を露出させて保持するときは、鋭利な工具や重い工具を使用しないでください。
数秒後、肝臓が乾燥するのを防ぐために、肝臓を500マイクロリットルの滅菌PBSで再び濡らします。次に、金属フレームを肝臓に置き、ナットを使用してしっかりと固定します。金属フレームを配置する前に、必ずサポートナットを配置してください。
これにより、金属フレームの圧力が軽減されます。肝臓の生体内イメージングを実行するには、Zenソフトウェアを実行してレーザーをオンにします。波長を880ナノメートルに設定し、緑と赤のチャンネルを設定します。
次に、蛍光強度に応じてレーザー出力を調整します。チャンバーをイメージングステージに置き、20パワー水浸対物レンズをカバーガラスの近くに配置します。シリコンラバーヒーターをマウス本体の下に固定して、体温を維持します。
次に、金属フレームに500マイクロリットルの蒸留水を汲み上げます。次に、対物レンズを肝臓の近くに配置します。ピントを調整し、撮像領域の深さと時間を決定します。
長期イメージングの場合は、倫理的な理由から、イメージング中に 1 時間ごとに、以前に調製した Zoletil と Rompun 麻酔薬の混合物の半分の用量を注入します。体温を摂氏37度に保ち、麻酔時間はマウスごとに異なるため、常にマウスに注意してください。データを分析するには、Velocity を開き、ライブラリから生データをインポートします。
次に、画像からノイズを取り除き、スナップショットを撮ります。最後に、編集したアイテムを100%に合わせ、スナップショット画像の場合はJPEGまたはTIFファイル、ムービーの場合はAVIファイルとしてファイルをエクスポートします。対照マウスの生体内イメージング解析により、血管内を循環する好中球が少数であることが示されました。
一方、好中球の数はLPSで治療されたマウスで有意に増加しました。LPS状態では、多くの好中球が血流内を循環していましたが、血管外には移動しませんでした。これらの動画に見られるように、LPS処理マウスは対照マウスに比べて好中球が管腔表面にしっかりと付着していたため、好中球が血管内で検出されやすくなっていました。
好中球の運動性とは別に、CX3CR1-GFPマウスの肝臓被膜マクロファージ(LCM)は、肝臓組織の深部ではなく表面で観察されました。さらに、LCMはLPSで治療したマウスでも肝臓での動きや活性化をほとんど示さなかった。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば30分で完了できます。
この手順を試行するときは、剣状突起から右肋骨下腹部の端までの切開線を設定することを忘れないでください。この手順に続いて、肝臓が損傷や感染からどのように回復するかなどの追加の質問に答えるために、治療注射などの他の方法を実行できます。この技術の開発後、この技術は、医学分野の研究者が敗血症中の白血球の反応を調査し、潜在的な薬剤をテストするための道を開きました。
このビデオを見た後、腹部の切開を最小限に抑えて肝臓を露出させる方法をよく理解しているはずです。リポ多糖類での作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には滅菌や手洗いなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。
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概要
本研究では、低侵襲で生体マウス肝臓の2光子イメージングを行うための新しい手術プロトコルを提示します。この技術により、リポ多糖誘発性エンドトキシン血症における白血球の挙動を観察することが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 免疫学
- ライブイメージング技術
背景
- 敗血性ショック時における肝臓の反応を理解することは極めて重要である。
- 白血球の遊走は、肝炎症において重要な役割を果たす。
- 従来のイメージング手法では、リアルタイムの知見が得られない可能性がある。
- 2光子イメージングは、生体組織の高解像度可視化を可能にする。
研究目的
- 肝臓における白血球の形態および機能を観察する。
- エンドトキシン血症が肝白血球の挙動に及ぼす影響を評価する。
- 生体組織のための低侵襲イメージング技術を開発する。
使用方法
- 手術器具の準備および消毒。
- イメージング前のマウスへの麻酔剤の使用。
- 網膜を保護するための眼軟膏の塗布。
- 手術部位へのアクセスを目的とした腹部周囲の除毛。
主要な結果
- 肝臓における白血球ダイナミクスのイメージングに成功。
- エンドトキシン血症における構造的変化の特定。
- 白血球の挙動をリアルタイム動画でキャプチャ。
- 治療的介入を評価するための応用の可能性。
結論
- この新しいイメージング技術は、肝臓の免疫学に関する理解を深めるものです。
- 本技術は、肝白血球の遊走に関する今後の研究のためのプラットフォームを提供します。
- この手法は、肝炎症に対する治療法の評価を促進する可能性があります。
よくある質問
業界における重要性
LPS処理したマウス肝臓における白血球動態のリアルタイム二光子生体内イメージングにより、急性炎症反応中の免疫細胞の挙動を直接可視化することが可能になります。この能力は、免疫学および炎症研究の初期段階におけるメカニズムのリスク低減と予測の信頼性を向上させます。本アプローチは、敗血症および臓器不全モデルにおける標的バリデーションおよび治療仮説の検証に役立つ戦略的な手法として位置づけられています。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- エンドトキシン血症に反応して動員および接着する白血球を直接的に可視化します。
- 疾患に関連する肝臓の微小環境における免疫細胞の局在と運動性を明らかにします。
- 敗血症誘発性の臓器障害に関与する免疫標的の機能的検証を可能にします。
- 免疫調節介入の優先順位を決定するための予測的な信頼性をサポートします。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 免疫細胞のダイナミクスの定量的評価に向けた、検証済みのin vivoイメージングシステムを構築します。
- 候補化合物に対する好中球およびマクロファージの応答について、再現性のある測定を可能にします。
- 研究間およびチーム間での比較が可能な、標準化されたイメージング出力を提供します。
- 白血球の運動性と形態をin situで調節する試薬のスクリーニングを可能にします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 敗血症および急性肝炎症の疾患関連モデルと整合しています。
- 細胞レベルの挙動を臓器レベルの結果に結びつけることで、トランスレーショナルな連続性をサポートします。
- 白血球主導の組織損傷を標的とした免疫調節療法の、リスク調整済み進展に情報を供します。
- 治療効果の前臨床評価のためのメカニズム的な洞察を提供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このイメージングプロトコルは、生体組織における免疫細胞の挙動を仮説に基づいて検証することを可能にし、基礎研究から前臨床研究への継続的な流れに統合されます。これにより、初期のメカニズム研究と、疾患モデルにおける下流の効果検証との橋渡しが行われます。
- 探索生物学：エンドトキシン刺激に対する免疫細胞の動員および活性化に関する帰無仮説検定をサポートします。
- スクリーニング：白血球のダイナミクスに対する化合物の影響を評価するための、定量的で再現性のあるイメージング出力を提供します。
- 分析：異なる条件下での免疫応答を統計的に比較するための、ハイコンテントなビデオおよび画像データを提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：生体内での急性炎症反応をモデル化することで、疾患との関連性を維持します。
- エンタープライズ再利用：多様な免疫標的リサーチおよび薬剤評価に利用可能な、再利用可能なプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 免疫応答研究における予測の信頼性を高め、メカニズムの曖昧さを低減する。
- 運用の価値： 生体内イメージングのワークフローを標準化し、再現性と拡張性を向上させる。
- 戦略的価値： 直接的な機能的リードアウトを提供することで、免疫調節候補物質のゴー/ノーゴー判定を改善する。
- ポートフォリオへの影響： 免疫細胞のリアルタイムの挙動に基づき、リスク調整後のターゲットおよび化合物の優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- 低侵襲手術および二光子顕微鏡法の専門知識が必要です。
- 高度なイメージング装置および解析ソフトウェアへのアクセスが求められます。
- 手術およびイメージングプロトコルについて、チーム間での厳格な標準化が必要です。
- 異なるマウス系統や免疫細胞マーカーに応じて、調整が必要になる場合があります。
- 実用上の制限として、動物福祉への配慮および生体イメージングの技術的複雑さが挙げられます。
