Name: 創薬における多能性幹細胞由来肝細胞様細胞を誘導人間を使用して (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: 学ぶ、iPSCから肝細胞様細胞を誘導分化させる方法。高スループットスクリーニングを用いて肝疾患治療薬の候補化合物を探索する技術を習得し、創薬研究に応用する。

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この作品は、国立衛生研究所 (DK55743、DK087377、DK102716、S.A.D に HG006398) によって支えられました。彼らの貢献に対して博士 Behshad Pournasr、博士ジェームズ ・ ヘズロップ ・と蘭静に感謝したいと思います。

1. 人間の文化誘導多能性幹細胞
<ol><li>
組換えひと E カドヘリン Fc 融合タンパク質 (E-cad-Fc) または他の行列の hPSC 文化に適したコーティング6<ol>
<li>ダルベッコ Phosphate-Buffered 食塩カルシウムとマグネシウム (DPBS (+)) が含まれていると 15 μ g/mL に E-cad-Fc を希釈します。</li>
		<li>5 ml の希釈 E-cad-Fc の 100 mm サスペンション ティッシュの培養皿をコートし、少なくとも 1 h. 削除基板の 37 ° C で孵化させなさい媒体 (例えば、今後 M 媒体と呼ばれる mTeSR1) の 5 mL と交換7。 注:このプロトコルで使われる培養培地は、次の公開プロトコル7を用意しています。ただし、いくつかの他のメディアの準備が記載されている、または利用できる商業的に、プロシージャ可能性があります互換性のあります。</li>
		<li>液体窒素による凍結 Ips のバイアルを取得します。小さな氷の結晶が残っているまで、37 ° C で解凍します。優しく M 培地 4 mL を含む滅菌 15 mL の円錐管に細胞をピペットします。</li>
		<li>5 分は上澄みを除去し、やさしく再中断 5 ml の培、Rho 関連、コイルド コイル含む蛋白質キナーゼ (ロック) の選択的阻害剤の Y-27632 の 10 μ m の細胞のために、300 × g で遠心分離機します。</li>
		<li>1.1.2 のステップから M 媒体を取り外し、100 mm サスペンションの電子 cad Fc コーティング ティッシュの培養皿にステップ 1.1.4 からセルの 5 mL。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
人間 Ips の文化を維持します。
	<ol>
<li>Ips に達すれば周り 80% の confluency 培養培地を削除し、カルシウムで 1 回洗浄し、マグネシウム無料 DPBS (-)。DPBS (-) を吸引し、プレートをカバーし、室温で最大 3 分間インキュベート 0.02 %edta 溶液の十分な量を追加します。 注:80% の合流でプレートは約 2 × 107セルを含める必要があります。セルにはびこるにない細胞が未分化の形態を保持できるようにすることが重要です。細胞の多能性幹細胞のマーカー トラ-1-60 または同等の8との汚損によって決定できます。</li>
		<li>セルを解放し始める、0.02 %edta 溶液を削除、セルを解放する M 培地 10 mL で皿の洪水します。軽くピペッティングして Ips の分遣隊を支援します。 注:デタッチするセルの平均培養時間はおよそ 3 分、これは iPSC 行ごとに、経験的に決定する必要があります。セルの周りを含む小さなクラスターとして発表されるべきクラスターあたり 5-10 Ips。</li>
		<li>新鮮な E-cad-Fc コート 100 ミリメートル懸濁液培養皿 M 培地 5 mL を含むあたり浮遊細胞の 1/10 に転送します。37 ° C 下で 4 %o で文化を孵化させなさい25% CO2と日々 変化する媒体。 注:Ips は、多能性を促進するために酸素の生理学的な条件の下で日常的に培養、Ips は周囲の酸素を使用するもと成長します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 96 ウェル プレートでの肝細胞のような細胞に人間 Ips の分化
注:このセクションでは、スクリーニングと互換性のある形式で Ips の分化について説明します。このアプローチを使用すると、それは区別し、20 日間で肝細胞様細胞を形成する人間の Ips を誘導することが可能です。これはほとんどの試金のために適していますが、文化の長さは、細胞の成熟度を改善するために拡張できます。
<ol><li>
減らされた成長因子基底膜マトリックス 96-well ティッシュの培養皿をコーティング
	<ol>
<li>マトリックスを 2 mg/mL の氷冷滅菌 DMEM/F12 組織培養培地で希釈することによって在庫を準備します。250 μ 因数に行列を分割し、必要になるまで-80 ° C で保存します。DMEM/F12 30 分取得のため氷の上の 10 mL 250 μ 因数 2 mg/mL マトリックス株式と雪解けを冷やす氷の上。</li>
		<li>冷たい DMEM/F12 の 10 mL と優しく 0.05 mg/mL の最終的な集中にあらかじめ冷やしたピペットを使用して混合することによってマトリックスを組み合わせます。</li>
		<li>96 ウェル培養プレートの各ウェルに 100 μ L 希薄マトリックスを転送します。37 ° C で孵化させなさい、4% O25% CO2少なくとも 1 h. の行列を破棄し、ウェルあたり 50 μ L の M 中に置き換えます。37 ° c、4% O25% CO2必要になるまで格納します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
細胞分化の
	<ol>
<li>セル アプローチ 80% 合流まで 100 mm プレートに Ips の文化.プレートに約 2 x 10 の7セルが含まれていることを確認します。セル フローサイトまたは検定によって細胞の数を決定します。 注:顕微鏡での経験と、Ips 細胞の品質を判断できます。ただし、セルの 98% 近くは、TRA 1 60 エピトープ FACS や免疫染色法によって測定したときのような多能性マーカーを表現しなければなりません。細胞は積極的にわかれたまま、生えていないことが重要です。</li>
		<li>各 100 mm プレートから Ips を収穫するには、培養培地を吸引、DPBS (-) の 5 mL ですすいでください。細胞剥離液 (例えばaccutase) の 3 mL でリンスを置き換えるし、37 ° C、4% O25% CO2で約 2 分間インキュベートします。 注:顕微鏡による細胞の剥離を従うことが重要です。Accutase にダイジェストしすぎないでください。目標は最低限の治療で小さなクラスターとしてセルを解放するためです。</li>
		<li>セルをデタッチし始めると、すぐに M 中の 7 mL を追加して収穫します。周りの小さなクラスターに細胞のコロニーを分離するに数回のピペット 3 6 細胞 (図 1 a)。</li>
		<li>5 分、上清を除去し、再細胞ペレットを 5 mL M 培地にサスペンド 15 mL 滅菌遠心管 300 × g で遠心分離し、Ips を収集します。</li>
		<li>懸濁細胞分注 50 μ l を各ウェルに 96 ウェル マトリックス コーティング プレートの上にセルを均等に配る。各 96 ウェル プレートを設定するには、約 80% の confluency 分化をセットアップする約 5 x 10 の6セルが含まれているセルと Ips の 1 つの 100 mm の板を使用します。マルチ チャンネル ピペットを使用して、このプロセスをスピードアップします。37 ° C、4% O25% CO2で一晩培養します。 注:再現可能な分化を確保するため各ウェルに同じ数のセルを堆積ことが重要です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
細胞の分化を誘導します。
	<ol>
<li>細胞が個々 の表面の少なくとも 70% をよくカバーして顕微鏡による 96 ウェルのプレートを確認します。カバレッジが 70% 未満の場合新鮮な媒体、媒体に置き換えるし、37 ° C、4% O25% CO2で追加 24 時間孵化させなさい。 注:よく分化を誘導することがなくめっき後 48 時間以上のための細胞を培養分化の効率が低下します。分化も発生する周囲の酸素を使用して効率かもしれないが影響を受ける.
</li>
		<li>分化の日 2 日 1、置き換える培 RPMI 2 %b27 (インスリン) なしで 20 ng/mL FGF2、10 ng/mL、BMP4 100 ng/mL アクチビン A。100 μ L/ウェル中を追加し、37 ° C、アンビエント O25% CO2の 2 日間毎日中型の変更でインキュベートします。 注:96 ウェルのプレートの大きな数を扱う補助ピペットまたはロボットの使用が必要です。96 ch と 12 ch ピペットは毎日培地交換に最適です。</li>
		<li>分化の日 5 日 3、置換と RPMI 培 (インスリン) なし 2 %b27 と 100 ng/mL アクチビン a. 文化細胞周囲 O25% CO2と 3 日間の毎日の中型の変更で、37 ° C で補った。</li>
		<li>30 s、し削除、置換の 100 μ L 0.02 %edta 溶液とよく分化新鮮な培地、各治療を交換する前に 5 日目に新鮮な培養液中で。 注:内胚葉への分化が効率的な場合、分化細胞の単層がプレートから剥離しやすいです。0.02 %edta 溶液で簡単な治療は、細胞の剥離を軽減できます。この治療法は、肝細胞への分化には影響しません。</li>
		<li>10 日間 6 間の差別化、培 RPMI/2% (インスリン) B27 20 ng/mL BMP4 10 ng/mL FGF2 と補われ、37 ° C、4% O25% CO2毎日中型の変更と 5 日間のインキュベートを交換してください。この段階では、肝前駆細胞に分化する細胞を誘導します。</li>
		<li>15 日 11 の間の分化、20 ng/ml の HGF (インスリン) B27 添加培養液中 RPMI/2% と交換してください。37 ° C、4% O25% CO2毎日中型の変更で 5 日間で孵化させなさい。</li>
		<li>20 日 16 間の差別化、肝細胞細胞培地 (HCM) 20 ng/ml オンコスタチン M (OSM) の補足と培養液を交換してください。アンビエント O25% CO2と 5 日間の毎日の中型の変更で、37 ° C でセルを孵化させなさい。 注:個々 のウェル間の差別化の再現性は、アルブミン、afp 通信、または APOB elisa 法による媒体に分泌の相対的なレベルを測定することによって効率的に決定できます (3.2 を参照)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 小さな分子のスクリーニング
注:APOB の家族性高コレステロール血症 Ips 由来の肝細胞のような細胞の中でのレベルを下げて使用することができます化合物を特定するための手順を次に示します。モデルとコレステロール低下薬の同定での使い方の説明が記載されているでは以前5,9詳細。現在の例では、サウスカロライナ化合物コレクション (SC3) ライブラリから 1,000 化合物をスクリーニングしました。各化合物は、2 μ g/mL の濃度でテストされました。
<ol><li>
IPSC - 小分子と派生の肝の治療
	<ol>
<li>2 %dmso、-20 ° C で店で 20 μ g/mL の濃度で化合物と株式を働いているのプレートを生成するマスターの化合物ライブラリーを希釈します。</li>
		<li>テストするそれぞれの化合物を許可する iPSC 由来の肝細胞の十分な 96 ウェルのプレートを準備します。 注:上映される化合物の数は、必要とされる 96 ウェル プレートの数によって決定されます。一般に、単一も備える必要があります任意のコントロールのサンプルの各化合物は、プラス追加井戸。プレートの外側の井戸は一般的解釈を破損することができますエッジ効果の可能性を減らすために回避されます。ヒットは、複製を使用する必要とせず z スコア法を使用して識別できます。複製が含まれている場合は、t 検定を使用する適しています。</li>
		<li>分化 (日 20、参照 2.3.7) の完了、時に新鮮な HCM の 100 μ L 培養液に置き換えるオンコスタチン M の 20 ng/mL を添加しました。37 ° C で孵化させなさい、4% O25% CO2 24 時間正確には新鮮なの 96 ウェル プレート、-20 ° C でストアに培養培地を取得します。薬の付加の前に媒体の APOB のレベルを計算するのにには、このサンプルを使用します。</li>
		<li>20 ng/ml オンコスタチン M の各ウェルに補われる新鮮な HCM の 90 μ L を追加します。ピペッティングにより混合後在庫から各化合物の 10 μ L を追加します。アンビエント O25% CO2まさに 24 時間の培養液を収集し、-20 ° C で保存、処理された試料の最終濃度に一致し、37 ° C で孵化させなさい井戸を制御する 0.2 %dmso を追加します。このサンプルを使用して、化合物投与後 APOB のレベルを調べます。</li>
		<li>オプション - 免疫染色、細胞生存率、または標準的なアプローチを使用しての mRNA のレベルの解析の残りのセルを処理ことができます。 注:この画面は、APOB レベルの急速な効果があった薬を識別するために設計されました。ただし、病モデル、下流の試金、または薬物作用のメカニズムは、によっては複数日のサンプルの治療に有益ながあります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Elisa 法による APOB レベルを決定します。
	<ol>
<li>両方前と後の薬物治療のサンプルから次の製造元のプロトコル人間 APOB ELISA の開発キットを使ってアポリポ蛋白 B (APOB) 濃度を決定します。</li>
		<li>
次の解決策を準備します。
		<ol>
<li>洗浄バッファー、0.05% から成る PBS、pH 7.4 でトゥイーン 20。使用するまで 4 ° C で保存します。</li>
			<li>インキュベーション バッファーは、0.05% Tween 20 と 0.1% ウシ血清アルブミン (BSA) の PBS、pH 7.4 で構成されます。使用するまで 4 ° C で保存します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>Pbs は、pH 7.4 2 μ g/mL に希釈して APOB (mAB 20/17) 抗体を準備します。ウェルあたり希釈の 100 μ L を追加し、4 ° C で一晩インキュベートします。</li>
		<li>抗体をアッセイ プレートから外し、各 200 μ L の PBS、pH 7.4 で 2 回も洗います。</li>
		<li>200 μ L/ウェル 0.05% の追加トゥイーン 20、PBS、pH 7.4 で 0.1% ウシ血清アルブミン (BSA) し、常温で 1 h の動揺のプラットホームの間加温します。</li>
		<li>Pbs は、pH 7.4 APOB の下記の濃度 0.05% Tween 20 と 0.1 %bsa を使用して 8 ポイント標準曲線を準備: 300 ng/mL、200 ng/mL、175 ng/mL、150 ng/mL、125 ng/mL、100 ng/mL、75 ng/mL、50 ng/mL。</li>
		<li>Pbs は、pH 7.4 0.05% Tween 20 と 0.1 %bsa を用いたテスト サンプル 1:4 希釈します。</li>
		<li>インキュベーション バッファーによるブロックの 1 時間後バッファーを破棄し、0.05% の 200 μ L を 5 回アッセイ プレートを洗う PBS、pH 7.4 でトゥイーン 20。</li>
		<li>完全に残留洗浄バッファーを削除し、希釈したサンプルと APOB 基準の 90 μ L をアッセイ プレートに転送します。1 h のシェーカーで室温で孵化させなさい。</li>
		<li>サンプルを破棄し、200 μ 0.05% で洗って pbs は、ウェルあたり pH 7.4 トゥイーン 20。合計 5 回洗浄を繰り返します。Pbs は、pH 7.4 0.05% Tween 20 と 0.1 %bsa に mAB LDL 11 ビオチン希薄縮尺のウェルあたり 100 μ L を追加します。1 h の動揺のプラットホームの室温で孵化させなさい。</li>
		<li>試薬を破棄し、5 回も洗浄バッファー当たり 200 μ L で洗います。ストレプトアビジン-HRP 抗体のウェルあたり 100 μ L を追加 (1:1, 000 インキュベーション バッファーを使用して希釈)、1 h の動揺のプラットホームの室温でインキュベートし。</li>
		<li>試薬を破棄し、200 μ 0.05% で洗って pbs は、ウェルあたり pH 7.4 トゥイーン 20。合計 5 回洗浄を繰り返します。完全にアッセイ プレートから残留洗浄液を削除し Tetramethylbenzidin (TMB) 基板の解決のウェルあたり 100 μ L を追加し、8 分間室温でインキュベートします。</li>
		<li>TMB 基板を削除せず直接停止ソリューション (1N HCl) ウェルあたり 100 μ L を追加します。</li>
		<li>450 で吸光度を決定する nm プレート リーダーを使用しています。</li>
		<li>4 パラメータ ・ ロジスティック回帰法を使用して、各サンプル10APOB の濃度の定義に使用、標準曲線を確立できます。</li>
		<li>事前に薬を調べる: APOB を下げる可能性のある化合物を識別するために各サンプルの APOB の後薬剤比率レベル中。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

ターゲット ・ ベース創薬、小さい分子を識別する、特定の蛋白質の活動に影響を与える多くの既存のスクリーニングの努力の焦点となっています。このアプローチは、多数の医薬品、画面反転表現型, 古典的な薬理学に基づいてを提供して臨床的に効果がある1されているファーストクラスの化合物を識別するに成功されています。表現型創薬への不利な点はそれが適切な疾患モデルの可用性に依存していることです。病気の細胞モデルは利用できませんに挑戦であるまたは共通の研究動物種が臨床症状を要約する失敗したときこれあります。ただし、患者さんの体細胞から Ips を生成する機能は、モデル文化3のひと疾患への新しい機会を提供しています。まれな遺伝病など、いくつかの疾患患者番号、およびアクセスし、同意が困難のいくつかことができます。しかし、ゲノム工学の出現で、模型もまれな病気のたぐいまれなこと、iPSC ゲノムに原因となる突然変異を導入する比較的簡単です。
Ips が手にされたら、病気の症状をマニフェストの適切なセル型を生成する...

まれな疾患を対象とする使用ことができます薬を識別する成功はスクリーニングに使用することができるアッセイの開発に依存しています。仮説またはターゲット ベースの画面 (逆薬理学) は有用だが、疾患の分子基盤の解明を必要とします。表現型画面 (古典的な薬理学) 生化学的経路の詳細な理解の必要性を避けるが、疾患の病態生理を正確にミラー化モデルの開発に頼る。ターゲット ・ ベースのアプローチのための熱意にもかかわらずは、FDA のファーストクラスで医薬品の分析は、表現型の画面がはるかに成功した1をされている明らかにします。このメソッドの全体的な目標は、高スループット スクリーニングのためのプラットフォームを確立する代謝性肝疾患の治療のための小さい分子を識別するために使用することができますです。肝, 肝癌細胞と肝前駆細胞2を含むいくつかの生体外モデルを記載されています。しかし、これらのモデルのほとんどは、制限があります、文化肝代謝不足の病態を要約することができます正確に新しいモデルの必要性があります。最近では、ひと多能性幹細胞遺伝子編集と組み合わせるモデルもアクセス患者することがなく文化のまれな病気のたぐいまれな機会を提供している直接3。患者特有の Ips の使用は、まれな肝疾患の治療のための小分子を発見するツールは概念的には合理的なアプローチ4の可能性を示す報告は少ないがあります。ただし、iPSC 由来の肝細胞を正常に肝代謝5欠陥の治療のための用途に使用することができます薬を識別するために使用するプラットフォームを開設します。
このプロトコルは 96-well 版の肝細胞様細胞にヒトの Ips を区別し、低分子化合物のライブラリを選別するに使用するプロセスを説明します。代謝性肝疾患の例としてエンドポイントによる高コレステロール血症についても説明します。このアプローチは、役割と伝染性肝疾患、代謝性肝疾患、薬物の毒性、その他の肝疾患のコンテキストで小さな分子の応用に関する研究に役立つはずです。

<table><tbody><tr><td>100 mm x 20 mmの滅菌組織培養皿&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm 無菌懸濁培養皿</td><td>Corning</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル組織培養プレート&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト アルブミン</td><td>Dako</td><td>A 0001</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト FOXA2(6C12)</td><td>Novus Biological</td><td>H00003170-M12</td><td></td></tr><tr><td>反ヒト HNF4 α</td><td>サンタクルーズ</td><td>SC-6556</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト Oct-3/4 抗体</td><td>サンタクルス</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト SOX17</td><td>R&D</td><td>AF1924</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒトTRA-1-60 FITC標識</td><td>ミリポア</td><td>FCMAB115F</td><td></td></tr><tr><td>アクチビンA組換えヒトタンパク質&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9563</td><td></td></tr><tr><td>B-27サプリメント、インスリンを除いた&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>0050129SA</td><td></td></tr><tr><td>B-27サプリメント、無血清&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BMP4 Recombinant Human Protein&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9533</td><td></td></tr><tr><td>細胞解離試薬StemPro&nbsp;アキュターゼ&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 発光細胞生存率アッセイ&nbsp;</td><td>Promega</td><td>7572</td><td></td></tr><tr><td>DPBS+(カルシウム、マグネシウム)</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>DPBS-(カルシウム、マグネシウムなし)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>ELISA ヒト APOB ELISA 開発キット</td><td>Mabtech</td><td>3715-1H-20</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2)</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0023</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit)&nbsp;</td><td>ロンザ</td><td>CC-3198</td><td></td></tr><tr><td>肝細胞増殖因子&nbsp;(HGF)</td><td></td> L-グルタミンPHC0321<td></td>イン<td>ビトゲン</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸溶液</td><td>Invitrogen</td><td>11140076</td><td></td></tr><tr><td>Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC5015</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>Feeder free pluripotent 幹細胞培地:mTesR1&nbsp;</td><td>STEMCELL technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1413301</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, HEPES&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>22400105</td><td></td></tr><tr><td>StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc)</td><td>Primorigen Biosciences</td><td>S2071</td><td></td></tr><tr><td>TMB-ELISA Substrate Solution</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>34022</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-60 FITC 共役</td><td>ミリポア</td><td>FCMAB115F</td><td></td></tr><tr><td>Versene (EDTA) 0.02%&nbsp;</td><td>ロンザ</td><td>17-711E</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 ROCK阻害剤</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr></tbody></table>

創薬における多能性幹細胞由来肝細胞様細胞を誘導人間を使用して

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

ひと誘導多能性幹細胞 (Ips) を分化肝細胞様細胞 (HLCs) 能力は、先天性肝代謝を研究する新たな機会を提供します。ただし、肝疾患を治療するためにされる可能性がありますすることができます小さな分子の同定をサポートするプラットフォームを提供するためにプロシージャは何千もの化合物をスクリーニングと互換性のある文化形式を必要です。ここでは、完全に定義された培養条件、96-well ティッシュの培養皿の肝細胞様細胞に人間 Ips の再現性のある差別化をできるを使用してプロトコルについて述べる.家族性高コレステロール血症患者から生成された iPSC 由来肝細胞由来アポリポ蛋白 B (APOB) を下げるため画面化合物の機能のためにプラットフォームを使用する例もあります。創と互換性のあるプラットフォームの可用性は、肝臓に影響を与える病気の治療薬を識別するために研究者をようにします。

肝細胞の生成-細胞のような:図 1では、人間の Ips 細胞肝細胞様細胞への分化過程に発生する変更のタイム フレームについて説明します。E-Cad-Fc に Ips の文化提供します約 2 mm OCT4 多能性マーカーを表す直径植民地 (図 1 aB)。E-カドヘリンのマトリックス上に成長した細胞の形態は他のサーフェス上で培養したものをわずかに異なるになります。彼らは大きい細胞質表面領域 (図 1 a) とフラットな形態を持っている傾向があります。ひと多能性幹細胞は、数種類の行列11で効率的に培養することができます、E-カドヘリン行列に Ips の文化多能性細胞人口の同質性を高めると考えられている、により、酵素無...

ここで提示されたプロトコルでは、肝疾患の治療のための小さい分子を識別するためのプラットフォームについて説明します。ステップバイ ステップの説明は、96 ウェル プレートで肝細胞特性を持つ細胞に Ips を区別するために、潜在的な治療上の活動と小分子のスクリーニング、セルを使用する方法の詳細が表示されます。

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

この実験の全体的な目標は、ヒト人工多能性幹細胞を肝細胞様細胞に分化させることであり、ハイスループットスクリーニングに適した方法で作製することです。肝細胞は実験室で増殖するのが困難ですが、人工多能性幹細胞から作製することができ、肝疾患の治療法を特定するためのスクリーニングプラットフォームを提供します。この技術の主な利点は、実験室で疾患を再現する肝疾患の任意の患者から無制限の数の肝細胞を生成できることです。この手順は、幹細胞生物学の広範な知識がなくても、比較的簡単に確立できます。その再現性により、研究者は複雑なロボット工学を必要とせずに、何千もの化合物をスクリーニングすることができます。ポスドク研究員のRay Liu氏と大学院生のPaige Lamprecht氏が、本日、この手順を実演します。まず、融合タンパク質Ecadを、カルシウムとマグネシウムを含むダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で1ミリリットルあたり15マイクログラムに希釈します。100mm懸濁組織培養皿に5ミリリットルの希釈マトリックスをコーティングし、摂氏37度で少なくとも1時間インキュベートします。インキュベーション後、基質を取り出し、5ミリリットルのiPS細胞培地と交換します。凍結保存されたヒト人工多能性幹細胞のバイアルを液体窒素から回収します。37°Cで、小さな氷の結晶が残るまで解凍します。次に、細胞を4ミリリットルの培養培地を含む滅菌15ミリリットルの円錐チューブに静かにピペットで移します。細胞を300 Gで5分間遠心分離します。上清を除去し、Rho関連コイルコイル含有プロテインキナーゼの選択的阻害剤であるY-27632の10マイクロモルを補充した5ミリリットルの培地で細胞を穏やかに再懸濁します。次に、Ecadでコーティングされた10mm懸濁組織培養皿から培地を取り出し、5ミリリットルの細胞を加えます。iPS細胞が約80%のコンフルエント度に達したら、培地を取り出し、カルシウムおよびマグネシウムを含まないDPBSで一度洗浄します。DPBSを吸引し、皿を覆うのに十分な量の0.02%EDTA溶液を追加します。次に、細胞を室温で最大3分間インキュベートします。細胞が放出し始めたらすぐに、0.02%EDTA溶液を取り出し、皿に10ミリリットルのM培地を浸して細胞を放出します。iPS細胞の分離を穏やかなピペッティングで促進します。5ミリリットルのM培地を含む新鮮なEcadコーティング組織培養皿ごとに、懸濁細胞の1/10を移します。4%の酸素と5%の二酸化炭素の下で37°Cで培養物をインキュベートし、培地を毎日交換します。1ミリリットルあたり2ミリグラムの濃度の氷冷マトリックスストックの250マイクロリットルの1バイアルを取り出し、氷上で解凍します。次に、解凍したマトリックスと10ミリリットルの冷たくなったDMEM/F12を、あらかじめ冷やしたピペットで穏やかに混合し、最終濃度を0.05ミリグラム/ミリリットルにします。希釈したマトリックス100μリットルを96ウェル組織培養プレートの各ウェルに移します。プレートを摂氏37度で4%酸素と5%二酸化炭素の下で少なくとも1時間インキュベートします。インキュベーション後、マトリックスを廃棄し、ウェルあたり50マイクロリットルのM培地と交換し、残りのプレートと同じコーティング手順を繰り返します。次に、細胞が80%の密度に近づくまで、100mmの皿でiPS細胞を培養します。各100mmプレートからiPS細胞を採取するには、培地を吸引し、5ミリリットルのDPBSですすいでください。すすぎ液を、Accutaseなどの3ミリリットルの細胞剥離液と交換します。次に、4%の酸素と5%の二酸化炭素の下で摂氏37度で約2分間インキュベートします。細胞が剥離し始めたらすぐに、7ミリリットルのM培地を追加して収穫します。ピペットを数回使用して、細胞コロニーを約3〜6個の細胞の小さなクラスターに解離します。次に、iPS細胞を15ミリリットルの滅菌遠心チューブに集め、300Gで5分間遠心分離します。終了したら、上清を取り除き、細胞ペレットを5ミリリットルのM培地に再懸濁します。マルチチャンネルピペットを使用して50マイクロリットルの懸濁細胞を各ウェルにピペッティングすることにより、細胞を96ウェルマトリックスコーティングプレートに均一に分配します。次に、細胞を摂氏37度で4%の酸素と5%の二酸化炭素の下で一晩培養し、残りのプレートで細胞播種手順を繰り返します。96ウェルプレートを顕微鏡で調べて、細胞が各個々のウェルの表面の少なくとも70%を覆っていることを確認します。分化の1日目から2日目までは、培養液をウェルあたり100マイクロリットルのRPMIベースの分化培地と交換します。次に、細胞を周囲酸素と5%二酸化炭素中で摂氏37度で2日間インキュベートし、毎日培地を交換します。分化の3日目から5日目には、培養培地を100マイクロリットルのRPMIベースの分化培地に2%B27と1ミリリットルあたり100ナノグラムの活性NAを補充して交換します。細胞を摂氏37度で周囲酸素と5%二酸化炭素中で3日間培養し、毎日培地を交換します。分化5日目に、各ウェルを100マイクロリットルの0.02%EDTA溶液で30秒間処理し、すぐに溶液を取り出します。100マイクロリットルの新鮮なRPMIベースの分化培地を追加し、残りのプレートについても同じ手順を繰り返します。6日目から10日目までの分化のために、培地を100マイクロリットルのRPMIベースの分化培地と交換します。細胞を摂氏37度で4%酸素と5%二酸化炭素の下で5日間インキュベートし、毎日培地を交換します。11日目から15日目までの分化のために、培養培地を100マイクロリットルのRPMIベースの分化培地に交換し、HGFの2%B27と1ミリリットルあたり20ナノグラムを補充します。細胞を摂氏37度で4%酸素と5%二酸化炭素の下で5日間インキュベートし、毎日培地を交換します。16日目から20日目までの分化のために、培養液を、オンコスタチン-Mのミリリットルあたり20ナノグラムを補充した肝細胞培養培地と交換します。細胞を周囲酸素と5%二酸化炭素中で摂氏37度で5日間インキュベートし、毎日培地を交換します。20日目の分化完了時に、培養培地を100マイクロリットルの新鮮な肝細胞培養培地に1ミリリットルあたり20ナノグラムのオンコスタチン-Mを補充して交換します。24時間インキュベートした後、培地を新鮮な96ウェルプレートに取り出し、摂氏20度で保存します。残りのプレートについても同じ収集手順を繰り返します。オンコスタチン-Mを添加した90マイクロリットルの新鮮な肝細胞培養培地を96ウェルプレートの各ウェルに加えます。選択した各化合物を、事前に調製した作業用ストック溶液から10マイクロリットル加えます。DMSOをコントロールウェルに0.2%添加して、処理したサンプルの最終濃度に一致させます。24時間インキュベートした後、培地を新鮮な96ウェルプレートに集め、摂氏20度で保存します。残りのプレートについても同じ収集手順を繰り返します。5日間の治療後、細胞はDefinitive Endodermで特徴的に発現するタンパク質を発現します。さらに5日間の分化後、内胚葉は肝運命に変換され、細胞はFOXA2とHNF4aを発現します。HGF添加後、細胞は胎児の肝細胞に見られるタンパク質を発現し、分化が完了すると、細胞は顕著な核小体を含む核と複数の脂肪滴を持つ大きな細胞質を持つ立方体形態を採用します。分化の20日目にHNF 4aとアルブミンを検出するための免疫染色は、これらの肝細胞タンパク質の分布がすべてのウェルで類似していることを示しています。iPS細胞を使用してAPOB低下化合物をスクリーニングし、iPS細胞由来の肝細胞を低分子スクリーニングに使用する例を提供しました。APOBアッセイのzファクターは0.73であり、創薬にプラットフォームを使用することの適合性が確認されています。APOBの薬剤後、薬剤前比は、各化合物について決定しました。ヒットの特定は、zスコア分析によって達成されました。APOB比が0.86から0.44の24の潜在的なヒットが特定されました。細胞生存率に悪影響を及ぼす化合物を除外したところ、2つの化合物がAPOBの低下に対して再現性があることがわかりました。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば25日で完了します。この手順を試みるときは、毎日新鮮な培地を準備することを忘れないでください。劣化による成分の濃度が間違っていると、細胞の分化能力が変わってしまいます。この技術は、その開発後、創薬分野の研究者がヒト人工多能性幹細胞を用いた肝疾患の治療研究を探求する道を開きました。このビデオを見れば、ヒト人工多能性幹細胞を培養および維持する方法、およびハイスループットスクリーニングのための小さな表面プレス形状で肝臓分化を行う方法について十分に理解できるはずです。ヒト人工多能性幹細胞の取り扱いは非常に危険であり、この手順を実行するときは、手袋や白衣などの個人用保護具を常に着用する必要があることを忘れないでください。

using-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived-hepatocyte-like

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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