Name: 創薬における多能性幹細胞由来肝細胞様細胞を誘導人間を使用して (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: 学ぶ、iPSCから肝細胞様細胞を誘導分化させる方法。高スループットスクリーニングを用いて肝疾患治療薬の候補化合物を探索する技術を習得し、創薬研究に応用する。

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この作品は、国立衛生研究所 (DK55743、DK087377、DK102716、S.A.D に HG006398) によって支えられました。彼らの貢献に対して博士 Behshad Pournasr、博士ジェームズ ・ ヘズロップ ・と蘭静に感謝したいと思います。

1. 人間の文化誘導多能性幹細胞
<ol><li>
組換えひと E カドヘリン Fc 融合タンパク質 (E-cad-Fc) または他の行列の hPSC 文化に適したコーティング6<ol>
<li>ダルベッコ Phosphate-Buffered 食塩カルシウムとマグネシウム (DPBS (+)) が含まれていると 15 μ g/mL に E-cad-Fc を希釈します。</li>
		<li>5 ml の希釈 E-cad-Fc の 100 mm サスペンション ティッシュの培養皿をコートし、少なくとも 1 h. 削除基板の 37 ° C で孵化させなさい媒体 (例えば、今後 M 媒体と呼ばれる mTeSR1) の 5 mL と交換7。 注:このプロトコルで使われる培養培地は、次の公開プロトコル7を用意しています。ただし、いくつかの他のメディアの準備が記載されている、または利用できる商業的に、プロシージャ可能性があります互換性のあります。</li>
		<li>液体窒素による凍結 Ips のバイアルを取得します。小さな氷の結晶が残っているまで、37 ° C で解凍します。優しく M 培地 4 mL を含む滅菌 15 mL の円錐管に細胞をピペットします。</li>
		<li>5 分は上澄みを除去し、やさしく再中断 5 ml の培、Rho 関連、コイルド コイル含む蛋白質キナーゼ (ロック) の選択的阻害剤の Y-27632 の 10 μ m の細胞のために、300 × g で遠心分離機します。</li>
		<li>1.1.2 のステップから M 媒体を取り外し、100 mm サスペンションの電子 cad Fc コーティング ティッシュの培養皿にステップ 1.1.4 からセルの 5 mL。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
人間 Ips の文化を維持します。
	<ol>
<li>Ips に達すれば周り 80% の confluency 培養培地を削除し、カルシウムで 1 回洗浄し、マグネシウム無料 DPBS (-)。DPBS (-) を吸引し、プレートをカバーし、室温で最大 3 分間インキュベート 0.02 %edta 溶液の十分な量を追加します。 注:80% の合流でプレートは約 2 × 107セルを含める必要があります。セルにはびこるにない細胞が未分化の形態を保持できるようにすることが重要です。細胞の多能性幹細胞のマーカー トラ-1-60 または同等の8との汚損によって決定できます。</li>
		<li>セルを解放し始める、0.02 %edta 溶液を削除、セルを解放する M 培地 10 mL で皿の洪水します。軽くピペッティングして Ips の分遣隊を支援します。 注:デタッチするセルの平均培養時間はおよそ 3 分、これは iPSC 行ごとに、経験的に決定する必要があります。セルの周りを含む小さなクラスターとして発表されるべきクラスターあたり 5-10 Ips。</li>
		<li>新鮮な E-cad-Fc コート 100 ミリメートル懸濁液培養皿 M 培地 5 mL を含むあたり浮遊細胞の 1/10 に転送します。37 ° C 下で 4 %o で文化を孵化させなさい25% CO2と日々 変化する媒体。 注:Ips は、多能性を促進するために酸素の生理学的な条件の下で日常的に培養、Ips は周囲の酸素を使用するもと成長します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 96 ウェル プレートでの肝細胞のような細胞に人間 Ips の分化
注:このセクションでは、スクリーニングと互換性のある形式で Ips の分化について説明します。このアプローチを使用すると、それは区別し、20 日間で肝細胞様細胞を形成する人間の Ips を誘導することが可能です。これはほとんどの試金のために適していますが、文化の長さは、細胞の成熟度を改善するために拡張できます。
<ol><li>
減らされた成長因子基底膜マトリックス 96-well ティッシュの培養皿をコーティング
	<ol>
<li>マトリックスを 2 mg/mL の氷冷滅菌 DMEM/F12 組織培養培地で希釈することによって在庫を準備します。250 μ 因数に行列を分割し、必要になるまで-80 ° C で保存します。DMEM/F12 30 分取得のため氷の上の 10 mL 250 μ 因数 2 mg/mL マトリックス株式と雪解けを冷やす氷の上。</li>
		<li>冷たい DMEM/F12 の 10 mL と優しく 0.05 mg/mL の最終的な集中にあらかじめ冷やしたピペットを使用して混合することによってマトリックスを組み合わせます。</li>
		<li>96 ウェル培養プレートの各ウェルに 100 μ L 希薄マトリックスを転送します。37 ° C で孵化させなさい、4% O25% CO2少なくとも 1 h. の行列を破棄し、ウェルあたり 50 μ L の M 中に置き換えます。37 ° c、4% O25% CO2必要になるまで格納します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
細胞分化の
	<ol>
<li>セル アプローチ 80% 合流まで 100 mm プレートに Ips の文化.プレートに約 2 x 10 の7セルが含まれていることを確認します。セル フローサイトまたは検定によって細胞の数を決定します。 注:顕微鏡での経験と、Ips 細胞の品質を判断できます。ただし、セルの 98% 近くは、TRA 1 60 エピトープ FACS や免疫染色法によって測定したときのような多能性マーカーを表現しなければなりません。細胞は積極的にわかれたまま、生えていないことが重要です。</li>
		<li>各 100 mm プレートから Ips を収穫するには、培養培地を吸引、DPBS (-) の 5 mL ですすいでください。細胞剥離液 (例えばaccutase) の 3 mL でリンスを置き換えるし、37 ° C、4% O25% CO2で約 2 分間インキュベートします。 注:顕微鏡による細胞の剥離を従うことが重要です。Accutase にダイジェストしすぎないでください。目標は最低限の治療で小さなクラスターとしてセルを解放するためです。</li>
		<li>セルをデタッチし始めると、すぐに M 中の 7 mL を追加して収穫します。周りの小さなクラスターに細胞のコロニーを分離するに数回のピペット 3 6 細胞 (図 1 a)。</li>
		<li>5 分、上清を除去し、再細胞ペレットを 5 mL M 培地にサスペンド 15 mL 滅菌遠心管 300 × g で遠心分離し、Ips を収集します。</li>
		<li>懸濁細胞分注 50 μ l を各ウェルに 96 ウェル マトリックス コーティング プレートの上にセルを均等に配る。各 96 ウェル プレートを設定するには、約 80% の confluency 分化をセットアップする約 5 x 10 の6セルが含まれているセルと Ips の 1 つの 100 mm の板を使用します。マルチ チャンネル ピペットを使用して、このプロセスをスピードアップします。37 ° C、4% O25% CO2で一晩培養します。 注:再現可能な分化を確保するため各ウェルに同じ数のセルを堆積ことが重要です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
細胞の分化を誘導します。
	<ol>
<li>細胞が個々 の表面の少なくとも 70% をよくカバーして顕微鏡による 96 ウェルのプレートを確認します。カバレッジが 70% 未満の場合新鮮な媒体、媒体に置き換えるし、37 ° C、4% O25% CO2で追加 24 時間孵化させなさい。 注:よく分化を誘導することがなくめっき後 48 時間以上のための細胞を培養分化の効率が低下します。分化も発生する周囲の酸素を使用して効率かもしれないが影響を受ける.
</li>
		<li>分化の日 2 日 1、置き換える培 RPMI 2 %b27 (インスリン) なしで 20 ng/mL FGF2、10 ng/mL、BMP4 100 ng/mL アクチビン A。100 μ L/ウェル中を追加し、37 ° C、アンビエント O25% CO2の 2 日間毎日中型の変更でインキュベートします。 注:96 ウェルのプレートの大きな数を扱う補助ピペットまたはロボットの使用が必要です。96 ch と 12 ch ピペットは毎日培地交換に最適です。</li>
		<li>分化の日 5 日 3、置換と RPMI 培 (インスリン) なし 2 %b27 と 100 ng/mL アクチビン a. 文化細胞周囲 O25% CO2と 3 日間の毎日の中型の変更で、37 ° C で補った。</li>
		<li>30 s、し削除、置換の 100 μ L 0.02 %edta 溶液とよく分化新鮮な培地、各治療を交換する前に 5 日目に新鮮な培養液中で。 注:内胚葉への分化が効率的な場合、分化細胞の単層がプレートから剥離しやすいです。0.02 %edta 溶液で簡単な治療は、細胞の剥離を軽減できます。この治療法は、肝細胞への分化には影響しません。</li>
		<li>10 日間 6 間の差別化、培 RPMI/2% (インスリン) B27 20 ng/mL BMP4 10 ng/mL FGF2 と補われ、37 ° C、4% O25% CO2毎日中型の変更と 5 日間のインキュベートを交換してください。この段階では、肝前駆細胞に分化する細胞を誘導します。</li>
		<li>15 日 11 の間の分化、20 ng/ml の HGF (インスリン) B27 添加培養液中 RPMI/2% と交換してください。37 ° C、4% O25% CO2毎日中型の変更で 5 日間で孵化させなさい。</li>
		<li>20 日 16 間の差別化、肝細胞細胞培地 (HCM) 20 ng/ml オンコスタチン M (OSM) の補足と培養液を交換してください。アンビエント O25% CO2と 5 日間の毎日の中型の変更で、37 ° C でセルを孵化させなさい。 注:個々 のウェル間の差別化の再現性は、アルブミン、afp 通信、または APOB elisa 法による媒体に分泌の相対的なレベルを測定することによって効率的に決定できます (3.2 を参照)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 小さな分子のスクリーニング
注:APOB の家族性高コレステロール血症 Ips 由来の肝細胞のような細胞の中でのレベルを下げて使用することができます化合物を特定するための手順を次に示します。モデルとコレステロール低下薬の同定での使い方の説明が記載されているでは以前5,9詳細。現在の例では、サウスカロライナ化合物コレクション (SC3) ライブラリから 1,000 化合物をスクリーニングしました。各化合物は、2 μ g/mL の濃度でテストされました。
<ol><li>
IPSC - 小分子と派生の肝の治療
	<ol>
<li>2 %dmso、-20 ° C で店で 20 μ g/mL の濃度で化合物と株式を働いているのプレートを生成するマスターの化合物ライブラリーを希釈します。</li>
		<li>テストするそれぞれの化合物を許可する iPSC 由来の肝細胞の十分な 96 ウェルのプレートを準備します。 注:上映される化合物の数は、必要とされる 96 ウェル プレートの数によって決定されます。一般に、単一も備える必要があります任意のコントロールのサンプルの各化合物は、プラス追加井戸。プレートの外側の井戸は一般的解釈を破損することができますエッジ効果の可能性を減らすために回避されます。ヒットは、複製を使用する必要とせず z スコア法を使用して識別できます。複製が含まれている場合は、t 検定を使用する適しています。</li>
		<li>分化 (日 20、参照 2.3.7) の完了、時に新鮮な HCM の 100 μ L 培養液に置き換えるオンコスタチン M の 20 ng/mL を添加しました。37 ° C で孵化させなさい、4% O25% CO2 24 時間正確には新鮮なの 96 ウェル プレート、-20 ° C でストアに培養培地を取得します。薬の付加の前に媒体の APOB のレベルを計算するのにには、このサンプルを使用します。</li>
		<li>20 ng/ml オンコスタチン M の各ウェルに補われる新鮮な HCM の 90 μ L を追加します。ピペッティングにより混合後在庫から各化合物の 10 μ L を追加します。アンビエント O25% CO2まさに 24 時間の培養液を収集し、-20 ° C で保存、処理された試料の最終濃度に一致し、37 ° C で孵化させなさい井戸を制御する 0.2 %dmso を追加します。このサンプルを使用して、化合物投与後 APOB のレベルを調べます。</li>
		<li>オプション - 免疫染色、細胞生存率、または標準的なアプローチを使用しての mRNA のレベルの解析の残りのセルを処理ことができます。 注:この画面は、APOB レベルの急速な効果があった薬を識別するために設計されました。ただし、病モデル、下流の試金、または薬物作用のメカニズムは、によっては複数日のサンプルの治療に有益ながあります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Elisa 法による APOB レベルを決定します。
	<ol>
<li>両方前と後の薬物治療のサンプルから次の製造元のプロトコル人間 APOB ELISA の開発キットを使ってアポリポ蛋白 B (APOB) 濃度を決定します。</li>
		<li>
次の解決策を準備します。
		<ol>
<li>洗浄バッファー、0.05% から成る PBS、pH 7.4 でトゥイーン 20。使用するまで 4 ° C で保存します。</li>
			<li>インキュベーション バッファーは、0.05% Tween 20 と 0.1% ウシ血清アルブミン (BSA) の PBS、pH 7.4 で構成されます。使用するまで 4 ° C で保存します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>Pbs は、pH 7.4 2 μ g/mL に希釈して APOB (mAB 20/17) 抗体を準備します。ウェルあたり希釈の 100 μ L を追加し、4 ° C で一晩インキュベートします。</li>
		<li>抗体をアッセイ プレートから外し、各 200 μ L の PBS、pH 7.4 で 2 回も洗います。</li>
		<li>200 μ L/ウェル 0.05% の追加トゥイーン 20、PBS、pH 7.4 で 0.1% ウシ血清アルブミン (BSA) し、常温で 1 h の動揺のプラットホームの間加温します。</li>
		<li>Pbs は、pH 7.4 APOB の下記の濃度 0.05% Tween 20 と 0.1 %bsa を使用して 8 ポイント標準曲線を準備: 300 ng/mL、200 ng/mL、175 ng/mL、150 ng/mL、125 ng/mL、100 ng/mL、75 ng/mL、50 ng/mL。</li>
		<li>Pbs は、pH 7.4 0.05% Tween 20 と 0.1 %bsa を用いたテスト サンプル 1:4 希釈します。</li>
		<li>インキュベーション バッファーによるブロックの 1 時間後バッファーを破棄し、0.05% の 200 μ L を 5 回アッセイ プレートを洗う PBS、pH 7.4 でトゥイーン 20。</li>
		<li>完全に残留洗浄バッファーを削除し、希釈したサンプルと APOB 基準の 90 μ L をアッセイ プレートに転送します。1 h のシェーカーで室温で孵化させなさい。</li>
		<li>サンプルを破棄し、200 μ 0.05% で洗って pbs は、ウェルあたり pH 7.4 トゥイーン 20。合計 5 回洗浄を繰り返します。Pbs は、pH 7.4 0.05% Tween 20 と 0.1 %bsa に mAB LDL 11 ビオチン希薄縮尺のウェルあたり 100 μ L を追加します。1 h の動揺のプラットホームの室温で孵化させなさい。</li>
		<li>試薬を破棄し、5 回も洗浄バッファー当たり 200 μ L で洗います。ストレプトアビジン-HRP 抗体のウェルあたり 100 μ L を追加 (1:1, 000 インキュベーション バッファーを使用して希釈)、1 h の動揺のプラットホームの室温でインキュベートし。</li>
		<li>試薬を破棄し、200 μ 0.05% で洗って pbs は、ウェルあたり pH 7.4 トゥイーン 20。合計 5 回洗浄を繰り返します。完全にアッセイ プレートから残留洗浄液を削除し Tetramethylbenzidin (TMB) 基板の解決のウェルあたり 100 μ L を追加し、8 分間室温でインキュベートします。</li>
		<li>TMB 基板を削除せず直接停止ソリューション (1N HCl) ウェルあたり 100 μ L を追加します。</li>
		<li>450 で吸光度を決定する nm プレート リーダーを使用しています。</li>
		<li>4 パラメータ ・ ロジスティック回帰法を使用して、各サンプル10APOB の濃度の定義に使用、標準曲線を確立できます。</li>
		<li>事前に薬を調べる: APOB を下げる可能性のある化合物を識別するために各サンプルの APOB の後薬剤比率レベル中。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

ターゲット ・ ベース創薬、小さい分子を識別する、特定の蛋白質の活動に影響を与える多くの既存のスクリーニングの努力の焦点となっています。このアプローチは、多数の医薬品、画面反転表現型, 古典的な薬理学に基づいてを提供して臨床的に効果がある1されているファーストクラスの化合物を識別するに成功されています。表現型創薬への不利な点はそれが適切な疾患モデルの可用性に依存していることです。病気の細胞モデルは利用できませんに挑戦であるまたは共通の研究動物種が臨床症状を要約する失敗したときこれあります。ただし、患者さんの体細胞から Ips を生成する機能は、モデル文化3のひと疾患への新しい機会を提供しています。まれな遺伝病など、いくつかの疾患患者番号、およびアクセスし、同意が困難のいくつかことができます。しかし、ゲノム工学の出現で、模型もまれな病気のたぐいまれなこと、iPSC ゲノムに原因となる突然変異を導入する比較的簡単です。
Ips が手にされたら、病気の症状をマニフェストの適切なセル型を生成する...

まれな疾患を対象とする使用ことができます薬を識別する成功はスクリーニングに使用することができるアッセイの開発に依存しています。仮説またはターゲット ベースの画面 (逆薬理学) は有用だが、疾患の分子基盤の解明を必要とします。表現型画面 (古典的な薬理学) 生化学的経路の詳細な理解の必要性を避けるが、疾患の病態生理を正確にミラー化モデルの開発に頼る。ターゲット ・ ベースのアプローチのための熱意にもかかわらずは、FDA のファーストクラスで医薬品の分析は、表現型の画面がはるかに成功した1をされている明らかにします。このメソッドの全体的な目標は、高スループット スクリーニングのためのプラットフォームを確立する代謝性肝疾患の治療のための小さい分子を識別するために使用することができますです。肝, 肝癌細胞と肝前駆細胞2を含むいくつかの生体外モデルを記載されています。しかし、これらのモデルのほとんどは、制限があります、文化肝代謝不足の病態を要約することができます正確に新しいモデルの必要性があります。最近では、ひと多能性幹細胞遺伝子編集と組み合わせるモデルもアクセス患者することがなく文化のまれな病気のたぐいまれな機会を提供している直接3。患者特有の Ips の使用は、まれな肝疾患の治療のための小分子を発見するツールは概念的には合理的なアプローチ4の可能性を示す報告は少ないがあります。ただし、iPSC 由来の肝細胞を正常に肝代謝5欠陥の治療のための用途に使用することができます薬を識別するために使用するプラットフォームを開設します。
このプロトコルは 96-well 版の肝細胞様細胞にヒトの Ips を区別し、低分子化合物のライブラリを選別するに使用するプロセスを説明します。代謝性肝疾患の例としてエンドポイントによる高コレステロール血症についても説明します。このアプローチは、役割と伝染性肝疾患、代謝性肝疾患、薬物の毒性、その他の肝疾患のコンテキストで小さな分子の応用に関する研究に役立つはずです。

<table><tbody><tr><td>100 mm x 20 mmの滅菌組織培養皿&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm 無菌懸濁培養皿</td><td>Corning</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル組織培養プレート&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト アルブミン</td><td>Dako</td><td>A 0001</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト FOXA2(6C12)</td><td>Novus Biological</td><td>H00003170-M12</td><td></td></tr><tr><td>反ヒト HNF4 α</td><td>サンタクルーズ</td><td>SC-6556</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト Oct-3/4 抗体</td><td>サンタクルス</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト SOX17</td><td>R&D</td><td>AF1924</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒトTRA-1-60 FITC標識</td><td>ミリポア</td><td>FCMAB115F</td><td></td></tr><tr><td>アクチビンA組換えヒトタンパク質&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9563</td><td></td></tr><tr><td>B-27サプリメント、インスリンを除いた&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>0050129SA</td><td></td></tr><tr><td>B-27サプリメント、無血清&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BMP4 Recombinant Human Protein&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9533</td><td></td></tr><tr><td>細胞解離試薬StemPro&nbsp;アキュターゼ&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 発光細胞生存率アッセイ&nbsp;</td><td>Promega</td><td>7572</td><td></td></tr><tr><td>DPBS+(カルシウム、マグネシウム)</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>DPBS-(カルシウム、マグネシウムなし)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>ELISA ヒト APOB ELISA 開発キット</td><td>Mabtech</td><td>3715-1H-20</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2)</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0023</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit)&nbsp;</td><td>ロンザ</td><td>CC-3198</td><td></td></tr><tr><td>肝細胞増殖因子&nbsp;(HGF)</td><td></td> L-グルタミンPHC0321<td></td>イン<td>ビトゲン</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸溶液</td><td>Invitrogen</td><td>11140076</td><td></td></tr><tr><td>Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC5015</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>Feeder free pluripotent 幹細胞培地:mTesR1&nbsp;</td><td>STEMCELL technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1413301</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, HEPES&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>22400105</td><td></td></tr><tr><td>StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc)</td><td>Primorigen Biosciences</td><td>S2071</td><td></td></tr><tr><td>TMB-ELISA Substrate Solution</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>34022</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-60 FITC 共役</td><td>ミリポア</td><td>FCMAB115F</td><td></td></tr><tr><td>Versene (EDTA) 0.02%&nbsp;</td><td>ロンザ</td><td>17-711E</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 ROCK阻害剤</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr></tbody></table>

創薬における多能性幹細胞由来肝細胞様細胞を誘導人間を使用して

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

ひと誘導多能性幹細胞 (Ips) を分化肝細胞様細胞 (HLCs) 能力は、先天性肝代謝を研究する新たな機会を提供します。ただし、肝疾患を治療するためにされる可能性がありますすることができます小さな分子の同定をサポートするプラットフォームを提供するためにプロシージャは何千もの化合物をスクリーニングと互換性のある文化形式を必要です。ここでは、完全に定義された培養条件、96-well ティッシュの培養皿の肝細胞様細胞に人間 Ips の再現性のある差別化をできるを使用してプロトコルについて述べる.家族性高コレステロール血症患者から生成された iPSC 由来肝細胞由来アポリポ蛋白 B (APOB) を下げるため画面化合物の機能のためにプラットフォームを使用する例もあります。創と互換性のあるプラットフォームの可用性は、肝臓に影響を与える病気の治療薬を識別するために研究者をようにします。

肝細胞の生成-細胞のような:図 1では、人間の Ips 細胞肝細胞様細胞への分化過程に発生する変更のタイム フレームについて説明します。E-Cad-Fc に Ips の文化提供します約 2 mm OCT4 多能性マーカーを表す直径植民地 (図 1 aB)。E-カドヘリンのマトリックス上に成長した細胞の形態は他のサーフェス上で培養したものをわずかに異なるになります。彼らは大きい細胞質表面領域 (図 1 a) とフラットな形態を持っている傾向があります。ひと多能性幹細胞は、数種類の行列11で効率的に培養することができます、E-カドヘリン行列に Ips の文化多能性細胞人口の同質性を高めると考えられている、により、酵素無...

ここで提示されたプロトコルでは、肝疾患の治療のための小さい分子を識別するためのプラットフォームについて説明します。ステップバイ ステップの説明は、96 ウェル プレートで肝細胞特性を持つ細胞に Ips を区別するために、潜在的な治療上の活動と小分子のスクリーニング、セルを使用する方法の詳細が表示されます。

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

この実験の全体的な目標は、ヒト人工多能性幹細胞を肝細胞様細胞に分化させることであり、ハイスループットスクリーニングに適した方法で作製することです。肝細胞は実験室で増殖するのが困難ですが、人工多能性幹細胞から作製することができ、肝疾患の治療法を特定するためのスクリーニングプラットフォームを提供します。この技術の主な利点は、実験室で疾患を再現する肝疾患の任意の患者から無制限の数の肝細胞を生成できることです。この手順は、幹細胞生物学の広範な知識がなくても、比較的簡単に確立できます。その再現性により、研究者は複雑なロボット工学を必要とせずに、何千もの化合物をスクリーニングすることができます。ポスドク研究員のRay Liu氏と大学院生のPaige Lamprecht氏が、本日、この手順を実演します。まず、融合タンパク質Ecadを、カルシウムとマグネシウムを含むダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で1ミリリットルあたり15マイクログラムに希釈します。100mm懸濁組織培養皿に5ミリリットルの希釈マトリックスをコーティングし、摂氏37度で少なくとも1時間インキュベートします。インキュベーション後、基質を取り出し、5ミリリットルのiPS細胞培地と交換します。凍結保存されたヒト人工多能性幹細胞のバイアルを液体窒素から回収します。37°Cで、小さな氷の結晶が残るまで解凍します。次に、細胞を4ミリリットルの培養培地を含む滅菌15ミリリットルの円錐チューブに静かにピペットで移します。細胞を300 Gで5分間遠心分離します。上清を除去し、Rho関連コイルコイル含有プロテインキナーゼの選択的阻害剤であるY-27632の10マイクロモルを補充した5ミリリットルの培地で細胞を穏やかに再懸濁します。次に、Ecadでコーティングされた10mm懸濁組織培養皿から培地を取り出し、5ミリリットルの細胞を加えます。iPS細胞が約80%のコンフルエント度に達したら、培地を取り出し、カルシウムおよびマグネシウムを含まないDPBSで一度洗浄します。DPBSを吸引し、皿を覆うのに十分な量の0.02%EDTA溶液を追加します。次に、細胞を室温で最大3分間インキュベートします。細胞が放出し始めたらすぐに、0.02%EDTA溶液を取り出し、皿に10ミリリットルのM培地を浸して細胞を放出します。iPS細胞の分離を穏やかなピペッティングで促進します。5ミリリットルのM培地を含む新鮮なEcadコーティング組織培養皿ごとに、懸濁細胞の1/10を移します。4%の酸素と5%の二酸化炭素の下で37°Cで培養物をインキュベートし、培地を毎日交換します。1ミリリットルあたり2ミリグラムの濃度の氷冷マトリックスストックの250マイクロリットルの1バイアルを取り出し、氷上で解凍します。次に、解凍したマトリックスと10ミリリットル

using-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived-hepatocyte-like

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

この記事では、ヒト胚性幹細胞集団からヒト肝内胚葉の発生に焦点を当てます。...

ヒト胚性幹細胞集団から肝細胞様細胞の堅牢な生成

ここで紹介する方法は、多能性幹細胞からのヒト肝細胞様細胞を生成するための拡張性と優れた製造基準（GMP）-Readyビデオ分化システムを記載しています。これは、基礎および応用ヒト肝臓研究のためのヒト肝細胞様細胞を生成するために、費用対効果の高い標準化されたシステムとして機能します。...

ヒト多能性幹細胞から肝細胞様細胞の定義され、スケーラブルな世代

多能性幹細胞からの細胞のような肝細胞の半自動化生産

このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞(hPSC)から肝細胞様細胞を18日間で効率的に生成する単層、血清フリー法を詳細に述べている。これは、hPSCが肝細胞様細胞を形成する前に、原始的な筋、決定的な内因性内因性、後部前腸および肝芽前駆体のような中間細胞型に順次分化するように6つのステップを伴う。...

ヒト多能性幹細胞の肝細胞への効率的な分化

このプロトコルは、定義された培養システムおよび細胞自己組織化を用いてヒト多能性幹細胞から肝球を産生するアプローチを記述する。このプロトコルは、多くの細胞株で再現可能であり、費用対効果が高く、生物医学的応用のための安定したヒト肝圏の生産を可能にする。...

多能性幹細胞からの3次元ヒト肝球の血清自由産生

本稿の目的は、多能性幹細胞からのヒト肝前駆物質分化を誘導する標準化されたアプローチを提供することです。すぐに使用できるメディア製剤を用いたこの手順の開発は、生物医学の研究と翻訳のためのヒト肝細胞を生成する容易なシステムをユーザーに提供する。...

定義された分化系を用いた多能性幹細胞からの肝前駆体仕様

本稿では、ヒト胚性幹細胞(hESC)を、hESC分化中にアクチビンAおよびCHIR99021を確実なエンドドーム(DE)に継続的に補い、機能性肝細胞様細胞(HLC)に分化するための詳細なプロトコルを記述する。...

ヒト胚性幹細胞からの肝細胞様細胞誘導の効率的な方法

ここでは、定常状態の末梢血から単核球を単離した単核球を用いてヒト自家肝スフェロイドを作製する非遺伝的方法を紹介します。...

肝疾患研究のための末梢血からのヒト肝スフェロイド

このプロトコールでは、迅速で再現性の高い内胚葉性肝オルガノイド(eHEPO)の生成について説明します。このプロトコルにより、eHEPOは2週間以内に産生され、その差別化と機能を失うことなく長期(1年以上)に拡大することができます。...

機能的肝内胚葉オルガノイドの作製

多能性幹細胞に由来する肝細胞は、ミトコンドリアと活性化白血球細胞接着分子(ALCAM、CD166)染色の組み合わせを使用して、細胞選別によって精製できます。...

ヒト人工多能性幹細胞由来肝細胞の精製のための細胞選別における生ミトコンドリア染色の応用

学ぶ、iPSCから肝細胞様細胞を誘導分化させる方法。高スループットスクリーニングを用いて肝疾患治療薬の候補化合物を探索する技術を習得し、創薬研究に応用する。

創薬における多能性幹細胞由来肝細胞様細胞を誘導人間を使用して

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