創薬における多能性幹細胞由来肝細胞様細胞を誘導人間を使用して

この実験の全体的な目標は、ヒト人工多能性幹細胞を肝細胞様細胞に分化させることであり、ハイスループットスクリーニングに適した方法で作製することです。肝細胞は実験室で増殖するのが困難ですが、人工多能性幹細胞から作製することができ、肝疾患の治療法を特定するためのスクリーニングプラットフォームを提供します。この技術の主な利点は、実験室で疾患を再現する肝疾患の任意の患者から無制限の数の肝細胞を生成できることです。

この手順は、幹細胞生物学の広範な知識がなくても、比較的簡単に確立できます。その再現性により、研究者は複雑なロボット工学を必要とせずに、何千もの化合物をスクリーニングすることができます。ポスドク研究員のRay Liu氏と大学院生のPaige Lamprecht氏が、本日、この手順を実演します。

まず、融合タンパク質Ecadを、カルシウムとマグネシウムを含むダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で1ミリリットルあたり15マイクログラムに希釈します。100mm懸濁組織培養皿に5ミリリットルの希釈マトリックスをコーティングし、摂氏37度で少なくとも1時間インキュベートします。インキュベーション後、基質を取り出し、5ミリリットルのiPS細胞培地と交換します。

凍結保存されたヒト人工多能性幹細胞のバイアルを液体窒素から回収します。37°Cで、小さな氷の結晶が残るまで解凍します。次に、細胞を4ミリリットルの培養培地を含む滅菌15ミリリットルの円錐チューブに静かにピペットで移します。

細胞を300 Gで5分間遠心分離します。上清を除去し、Rho関連コイルコイル含有プロテインキナーゼの選択的阻害剤であるY-27632の10マイクロモルを補充した5ミリリットルの培地で細胞を穏やかに再懸濁します。次に、Ecadでコーティングされた10mm懸濁組織培養皿から培地を取り出し、5ミリリットルの細胞を加えます。

iPS細胞が約80%のコンフルエント度に達したら、培地を取り出し、カルシウムおよびマグネシウムを含まないDPBSで一度洗浄します。DPBSを吸引し、皿を覆うのに十分な量の0.02%EDTA溶液を追加します。次に、細胞を室温で最大3分間インキュベートします。

細胞が放出し始めたらすぐに、0.02%EDTA溶液を取り出し、皿に10ミリリットルのM培地を浸して細胞を放出します。iPS細胞の分離を穏やかなピペッティングで促進します。5ミリリットルのM培地を含む新鮮なEcadコーティング組織培養皿ごとに、懸濁細胞の1/10を移します。

4%の酸素と5%の二酸化炭素の下で37°Cで培養物をインキュベートし、培地を毎日交換します。1ミリリットルあたり2ミリグラムの濃度の氷冷マトリックスストックの250マイクロリットルの1バイアルを取り出し、氷上で解凍します。次に、解凍したマトリックスと10ミリリットルの冷たくなったDMEM/F12を、あらかじめ冷やしたピペットで穏やかに混合し、最終濃度を0.05ミリグラム/ミリリットルにします。

希釈したマトリックス100μリットルを96ウェル組織培養プレートの各ウェルに移します。プレートを摂氏37度で4%酸素と5%二酸化炭素の下で少なくとも1時間インキュベートします。インキュベーション後、マトリックスを廃棄し、ウェルあたり50マイクロリットルのM培地と交換し、残りのプレートと同じコーティング手順を繰り返します。

次に、細胞が80%の密度に近づくまで、100mmの皿でiPS細胞を培養します。各100mmプレートからiPS細胞を採取するには、培地を吸引し、5ミリリットルのDPBSですすいでください。すすぎ液を、Accutaseなどの3ミリリットルの細胞剥離液と交換します。

次に、4%の酸素と5%の二酸化炭素の下で摂氏37度で約2分間インキュベートします。細胞が剥離し始めたらすぐに、7ミリリットルのM培地を追加して収穫します。ピペットを数回使用して、細胞コロニーを約3〜6個の細胞の小さなクラスターに解離します。

次に、iPS細胞を15ミリリットルの滅菌遠心チューブに集め、300Gで5分間遠心分離します。終了したら、上清を取り除き、細胞ペレットを5ミリリットルのM培地に再懸濁します。マルチチャンネルピペットを使用して50マイクロリットルの懸濁細胞を各ウェルにピペッティングすることにより、細胞を96ウェルマトリックスコーティングプレートに均一に分配します。

次に、細胞を摂氏37度で4%の酸素と5%の二酸化炭素の下で一晩培養し、残りのプレートで細胞播種手順を繰り返します。96ウェルプレートを顕微鏡で調べて、細胞が各個々のウェルの表面の少なくとも70%を覆っていることを確認します。分化の1日目から2日目までは、培養液をウェルあたり100マイクロリットルのRPMIベースの分化培地と交換します。

次に、細胞を周囲酸素と5%二酸化炭素中で摂氏37度で2日間インキュベートし、毎日培地を交換します。分化の3日目から5日目には、培養培地を100マイクロリットルのRPMIベースの分化培地に2%B27と1ミリリットルあたり100ナノグラムの活性NAを補充して交換します。細胞を摂氏37度で周囲酸素と5%二酸化炭素中で3日間培養し、毎日培地を交換します。分化5日目に、各ウェルを100マイクロリットルの0.02%EDTA溶液で30秒間処理し、すぐに溶液を取り出します。

100マイクロリットルの新鮮なRPMIベースの分化培地を追加し、残りのプレートについても同じ手順を繰り返します。6日目から10日目までの分化のために、培地を100マイクロリットルのRPMIベースの分化培地と交換します。細胞を摂氏37度で4%酸素と5%二酸化炭素の下で5日間インキュベートし、毎日培地を交換します。

11日目から15日目までの分化のために、培養培地を100マイクロリットルのRPMIベースの分化培地に交換し、HGFの2%B27と1ミリリットルあたり20ナノグラムを補充します。細胞を摂氏37度で4%酸素と5%二酸化炭素の下で5日間インキュベートし、毎日培地を交換します。16日目から20日目までの分化のために、培養液を、オンコスタチン-Mのミリリットルあたり20ナノグラムを補充した肝細胞培養培地と交換します。

細胞を周囲酸素と5%二酸化炭素中で摂氏37度で5日間インキュベートし、毎日培地を交換します。20日目の分化完了時に、培養培地を100マイクロリットルの新鮮な肝細胞培養培地に1ミリリットルあたり20ナノグラムのオンコスタチン-Mを補充して交換します。24時間インキュベートした後、培地を新鮮な96ウェルプレートに取り出し、摂氏20度で保存します。

残りのプレートについても同じ収集手順を繰り返します。オンコスタチン-Mを添加した90マイクロリットルの新鮮な肝細胞培養培地を96ウェルプレートの各ウェルに加えます。選択した各化合物を、事前に調製した作業用ストック溶液から10マイクロリットル加えます。

DMSOをコントロールウェルに0.2%添加して、処理したサンプルの最終濃度に一致させます。24時間インキュベートした後、培地を新鮮な96ウェルプレートに集め、摂氏20度で保存します。残りのプレートについても同じ収集手順を繰り返します。

5日間の治療後、細胞はDefinitive Endodermで特徴的に発現するタンパク質を発現します。さらに5日間の分化後、内胚葉は肝運命に変換され、細胞はFOXA2とHNF4aを発現します。HGF添加後、細胞は胎児の肝細胞に見られるタンパク質を発現し、分化が完了すると、細胞は顕著な核小体を含む核と複数の脂肪滴を持つ大きな細胞質を持つ立方体形態を採用します。

分化の20日目にHNF 4aとアルブミンを検出するための免疫染色は、これらの肝細胞タンパク質の分布がすべてのウェルで類似していることを示しています。iPS細胞を使用してAPOB低下化合物をスクリーニングし、iPS細胞由来の肝細胞を低分子スクリーニングに使用する例を提供しました。APOBアッセイのzファクターは0.73であり、創薬にプラットフォームを使用することの適合性が確認されています。

APOBの薬剤後、薬剤前比は、各化合物について決定しました。ヒットの特定は、zスコア分析によって達成されました。APOB比が0.86から0.44の24の潜在的なヒットが特定されました。

細胞生存率に悪影響を及ぼす化合物を除外したところ、2つの化合物がAPOBの低下に対して再現性があることがわかりました。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば25日で完了します。この手順を試みるときは、毎日新鮮な培地を準備することを忘れないでください。

劣化による成分の濃度が間違っていると、細胞の分化能力が変わってしまいます。この技術は、その開発後、創薬分野の研究者がヒト人工多能性幹細胞を用いた肝疾患の治療研究を探求する道を開きました。このビデオを見れば、ヒト人工多能性幹細胞を培養および維持する方法、およびハイスループットスクリーニングのための小さな表面プレス形状で肝臓分化を行う方法について十分に理解できるはずです。

ヒト人工多能性幹細胞の取り扱いは非常に危険であり、この手順を実行するときは、手袋や白衣などの個人用保護具を常に着用する必要があることを忘れないでください。