コレクションと RNA 解析のための大型動物からリンパ節の処理: リンパ節トランスクリプトーム研究大型動物種のための準備

こんにちは、私の名前はロバート・ショー博士で、アイオワ州エイムズにある国立動物病センターの科学者です。このJoVEビデオでは、下流のRNA実験で使用するための大型動物からのリンパ節の収集と処理に関する情報を共有します。例えば、これらの実験には、逆転写産物の定量的PCRやトランスクリプトームのRNAシーケンシング研究などがあります。

リンパ節は、宿主の免疫応答の評価に有用なサンプルですが、リンパ節内の免疫細胞に存在する細胞内病原体の場合など、研究用の病原体RNAの供給源にもなります。家畜と野生生物の両方の種を含む大型動物のサンプルは、人獣共通感染症の研究に興味深いものです。ここ国立動物病センターでは、牛やバイソンにブルセラ症を引き起こすブルセラ・アバンタスや、牛の腸管から排出される大腸菌O157:H7などの家畜の感染について研究しています。

また、シカやヘラジカなどの野生生物種から組織サンプルを回収します。さまざまな病気に感染した動物からさまざまなリンパ節を採取できます。これらの天然宿主種の組織研究は、一般にマウスモデルよりも疾患の自然な進行に関連しています。

しかし、大型種からの組織採取のプロセスは、安楽死から組織採取までの遅延が長く、リンパ節のサイズが大きいなど、マウスよりも必然的に複雑です。ここでは、大型動物感染症のトランスクリプトーム研究に関与する分子生物学者や、トランスクリプトーム研究を開始する獣医学研究者にとって有益なRNA研究のための大型動物リンパ節の単離のためのプロトコルを紹介します。このビデオでは、牛のリンパ節の手順を実演します。

剖検の前に、組織分離手順に固有の以下の消耗品を組み立てることをお勧めします。RNAlater、使い捨てメス、清潔でオートクレーブの鉗子、生検針、使用済みのメスや針用の鋭利物容器、まな板や使い捨てトレイなど、約1mlのRNA組織防腐剤を充填したマイクロチューブは、関連する材料の感染力のレベルに応じてます。この場合、一般的に牛から採取するリンパ節を使用して、手順の主要な要素を示します。

彼らはブルセラ症を引き起こす細菌に感染しています。これらは肩甲骨前リンパ節と耳下腺リンパ節です。RNA回収のために大型動物の剖検を行う場合、少なくとも3人の参加者が動物の組織に取り組むことが有用です。

ディセクター 1 は、動物のさまざまな部分の大型動物の切片化を担当し、ディセクター 2 は、メインの剖検テーブルでさまざまな動物切片からリンパ節を回復し、ディセクター 3 は別のテーブルで作業して、各リンパ節から切片を分離し、それらを防腐剤溶液でチューブに移します。肩甲骨前リンパ節の特定と切除から始めます。理想的には、解剖前のリンパ節の触診は、リンパ節の位置を特定するのに役立ちます。

常に検出できるわけではありませんが、肩甲骨前リンパ節は通常、健康な動物で触診できます。動物を横臥位に置くことから始めます。前肢を膝の高さで後ろに動かして、肩を伸ばします。

この動きにより、肩が後ろに下がり、リンパ節の触診が容易になります。図のようにリンパ節の存在を感じてください。位置を特定し、肩を伸ばしたまま、メスまたは剖検ナイフを使用して、肩の輪郭に沿って皮膚を切開します。

皮膚を引っ込めて、肩と首の筋肉組織の先端を明らかにします。皮下脂肪の一部は、特に過剰にコンディショニングされた動物で観察されることがあります。肩甲骨前リンパ節は、皮下脂肪の切片を伴ってよく見られます。

ここでは、皮膚・筋肉・皮下脂肪の3つの層を見ることができます。もう一度、リンパ節の位置を触診します。皮下脂肪とは異なり、リンパ節は触診時にその形状を保持します。

肩甲骨前リンパ節の位置を特定した後、皮下脂肪を慎重に解剖し、リンパ節を解剖します。バイソンのこれらのリンパ節の外観は、グレーターイエローストーン地域のバイソンがブルセラに感受性があるため、ブルセラ症の研究で使用しましたが、似ています。ここでは、アメリカバイソンの右肩から解剖された肩甲骨前リンパ節の外観を示します。

次に、耳下腺リンパ節の分離に移ります。動物が横臥位になった状態で、顎関節の位置を特定します。メスまたは剖検ナイフを使用して、皮膚を慎重に切開します。

関節の背側から始まり、顎のラインに沿って垂直に伸びます。皮膚を解剖して皮下組織を明らかにします。耳下腺の唾液腺は、最初に、その大きいサイズ、小葉状の表面の外観、および赤い着色のために見えます。

鉗子とメスを使用して、耳下腺唾液腺を脇に動かして、唾液腺のすぐ頭蓋と内側に座っている耳下腺リンパ節を見つけます。耳下腺リンパ節を分離するときは、耳下腺唾液腺の組織からリンパ節組織を分離することが重要です。組織の種類は、組織の断面内を含め、明確に見えます。

これは、耳下腺リンパ節が左側にあり、耳下腺唾液腺が右側にあることで観察できます。さらに処理する前に、耳下腺リンパ節組織のテクスチャーを注意深く調べてください。場合によっては、耳下腺リンパ節を見つけるために耳下腺唾液腺を切除する必要があるかもしれません。

これは、去勢牛から切除された耳下腺の例で、リンパ節が唾液腺内に埋め込まれており、腺の除去前には見えませんでした。選択したリンパ節の同定に関する追加情報は、メイン原稿に記載されています。リンパ節が採取されたら、保存のために切片を切除する準備が整います。

メスまたは剖検ナイフを使用して、リンパ節の一部を切除し、矢状切開を行ってリンパ節を開きます。リンパ節の内部、特に感染した動物の標本で、非対称性、病変、色の違いなどを探します。このウシの肩甲骨前リンパ節では、肉眼で複数の特徴が見えます。

これらには、Bリンパ球の本拠地である卵胞と、T細胞の本拠地である深部皮質ユニットが含まれます。これらの理由は、明るい髄質洞よりも暗く見えます。ここでは、感染していないリンパ節の別の例が示されています。

このリンパ節は若いバイソンのものです。この例では、卵胞があまり明確でないことに注意してください。組織を切片にして処理するために、1つのオプションは、その後のRNA回収のためにメスで各リンパ節から小さな組織片を収集することです。

しかし、サンプル間の発現プロファイルを比較する際の大きな課題の1つは、RNA抽出のために簡単に全体を抽出できるマウスリンパ節と比較して、大型動物のリンパ節のサイズが大きいことです。その結果、小さな組織切片はリンパ節全体の細胞のプロファイルを均等に捉えることができません。代わりに、リンパ節のプロファイル全体で細胞を捕捉するには、リンパ節からパイ型のくさびを切り出し、厚さ5mm以下の小片に切断し、鉗子でRNAlaterを含むチューブに挿入します。

あるいは、生検法を利用して、各リンパ節から組織切片を切除します。リンパ節から特定の卵胞などの特定の切片を採取し、鉗子を使用してRNAlaterに移植する場合は、パンチ生検ツールを選択します。サンプルをRNAlaterに移した後、それらをラボに戻し、組織への浸透を可能にするために摂氏4度で一晩保存します。

その後、余分なRNAlaterを貧弱にし、組織サンプルを摂氏80度で保存します。RNA防腐剤溶液を使用する利点は、剖検時や野外からのサンプル採取時に液体窒素が不要であることです。サンプルにアクセスする前に、トリゾール試薬をチューブに事前に分注して均質化します。

サンプルを冷凍庫から取り出したら、メーカーの推奨に基づいて、すぐにTrizol試薬に移し、その後の処理を行います。ここでは、50〜100mgの組織片をTrizol試薬に移します。トリゾール添加前の解凍をできるだけ制限してください。

ドライアイスでの保存は、複数のサンプルを冷凍庫から取り出して処理する場合に使用できます。ホモジナイザーにチューブを置き、Trizol試薬でホモジナイズします。ここでは、2分間のRNA抽出設定を使用します。

完了したら、曇りの外観を確認します。必要に応じて繰り返します。メーカーのプロトコルに従って、各サンプルの水性層と有機層を生成します。

上部透明水相をピペットチップで取り除きます。新しい微量遠心チューブに移します。次に、等量の100%エタノールと混合します。

よく混ぜます。チューブはしばしば曇って見えます。マイクロピペットチップを使用して、液体をシリカベースの市販スピンカラムに移し、RNAをさらに精製して溶出します。

RNAの品質を評価するには、溶出したRNAサンプルの1〜2 lを分光光度計にロードして分析します。手順完了後、260-280比と260-230比で約2の吸光度比が観察され、薬品のキャリーオーバーが最小限に抑えられた高純度であることを示しています。フェノール汚染は、260-230nmの吸光度比の低下から観察できます。

バイソンのような動物の場合の剖検手順では、安楽死から最初の組織サンプルが防腐剤に移されるまでに少なくとも20分の時間が経過しました。対照的に、マウスのリンパ節は、安楽死後も数分で除去および保存できます。したがって、私たちは、経時的なリンパ節の分解プロファイルを特徴付けることに興味を持っていました。

メインの原稿では、他の出版物で検証された他のさまざまな組織タイプにおけるRNA安定性プロファイルの要約もまとめました。バイソンリンパ節で実施された代表的な実験では、安楽死後1時間にわたってRNAの安定性は比較的一貫していました。ここでは、アメリカバイソンの乳房上リンパ節組織の断片から精製された全RNAのゲル像を示しています。

この知見は、文献からまとめられた他の組織タイプに関する以前のデータと一致している。このことは、遺伝子発現の下流解析に許容できる品質のサンプルを、バイソンやヘラジカのようなより困難な種からでも収集できることを示唆しています。ただし、死からサンプル保存までの時間が長くなると、mRNA転写産物の3つの主要な末端からの分解が増加するなど、RNA発現プロファイルが変化する可能性があることを理解することが重要です。

したがって、動物が剖検に利用可能になった後のさらなる遅延を減らすために、組織回復のための迅速で合理化されたワークフローを利用することは依然として重要であり、最も生物学的に有効なRNAプロファイルを達成します。さらに、プロセス全体を通して、組織内にすでに存在するものを超えて、サンプルにRNA汚染物質が混入しないように、手順全体を通して注意を払う必要があることに注意してください。これには、他の必要な個人用保護具の一部として手袋を使用することが含まれます。

また、RNAサンプルのフリーストールを可能な限り抑えるために、最終的なRNA産物を複数のチューブに分注します。たとえば、品質管理テストで使用するために、別々のアリコートを保存できます。要約すると、このビデオでは、ダウンストリームの遺伝子発現解析のためのリンパ節の同定、収集、代表サンプリング、および処理に使用するための重要な情報を提供しました。

私たちの代表的なビデオは、牛やバイソンの例でデモンストレーションされていますが、ヤギやヘラジカなど、他の大型種のリンパ節も扱っています。トランスクリプトーム法の使用を検討している獣医学者であろうと、大型動物科学の分野に進出することに関心のある分子生物学者であろうと、このビデオがあなたの仕事に役立つことを願っています。