Name: サイズ制御されたポリ (エチレング リコール) レート液滴を介して半 3 次元流れ焦点マイクロ流体デバイスの生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: 学ぶ半3次元流れ焦点マイクロ流体デバイスの作製法とPGD液滴生成技術。PDMSチップを用いて生化学応用向けに表面積対体積比を高め、少量サンプルで大規模分析を可能にする手法です。

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この作品は、深セン研究グラント号の資金によって支えられました。JCYJ 20150630170146829、JCYJ20160531195439665、JCYJ20160317152359560)。著者は、深川機関の高度な技術で、サポートのための科学の中国アカデミー教授義陳を感謝したいです。

1. 金型製作
<ol><li>図面のソフトウェアを使用して 2 つのフォトマスクを設計します。マイクロ構造の概要を説明してマスク同じ図面ファイルの 1 と 2 の 2 つの層を使用して、ように異なるチャネル間のすべての接続。1 μ m の分解能でベンダーによるガラスのプレートをクロームに独立して異なるレイヤーを印刷します。フォトマスクは、負の極性、設計構造の透明な暗いことを確認します。 注:マスク 1 には、オリフィスには分散相の入口チャネルが含まれています。マスク 2 は、連続相の入口チャネル、フィルター、およびコンセントに含まれます。</li>
	<li>指定された写真平版ラボで直径 3 インチのシリコンウェハーをクリーンアップします。スピン コーターにウェハを配置、スピン チャックにウェーハを押さなければならない真空をオンにします。スピン コート 2-3 mL 10 のウエハー上に SU 8 2025年ネガ型フォトレジストの 1,000 rpm, 30、s 3,000 rpm、20 μ m の最初の層の厚さを提供することで s。</li>
	<li>6 分の 95 ° C 鉄板ソフト焼く。コーティングされたウェーハ冷却部屋の温度 (RT) 後、それ平行 15 mW/cm2, 365 下マスク 1 を経由して公開 nm UV 18 s. 後の露出のための 6 分、95 ° C 鉄板焼くに冷却したウエハをできるようにして</li>
	<li>スピン コーティング プロセスを繰り返します。10 のウエハー上に SU 8 2100 ネガ型フォトレジストの 2-3 ml 30 その後、1,000 rpm で s 2,000 rpm、130 μ m の 2 番目の層の厚さを提供することで s。30 の公開する第 2 層レジスト 35 分 95 ° C 鉄板ソフト焼く後配置マスク 2 s、UV 露光装置による分散相チャネル層と提携していた。暴露後、7 分間 95 ° C のホット プレートで焼く。</li>
	<li>機能ウェハに明確になるし、エチル ・ アルコールで洗うまでのプロピレング リコール エーテル酢酸メチルの 50 mL 強攪拌浴における浸漬してウエハーを開発します。最後に、2 h のハード焼成用サーモスタットのプラットフォームにウェハを配置します。</li>
</ol>2 半 3 D フロー焦点マイクロ流体チップの作製
<ol><li>ミックス PDMS モノマーおよびその硬化剤上部および下の層、通常最上位のレイヤーの 10:1 と底層の 8:1 のわずかに異なる重量比で 4 分の自動軟膏アジテーターを使用します。 注:上部と下部の PDMS スラブがわずかに異なる比率で作成 (10:1、8:1 それぞれ)、硬化剤に PDMS ベースの接着強度を向上させます。最下の層に 5:1 の比率を選択すると、硬めの底 PDMS スラブは配置が困難し、柔軟性の不足による接合強度を低減します。さらに、下部 PDMS スラブの厚さは、顕微鏡の作動距離を適応するため約 1 mm です。チップは、15:1 の比率を選択した場合、高圧下で簡単に変形します。</li>
	<li>90 mm のシャーレで完成したシリコン型に混合物を注ぐし、厚さ 2 〜 3 mm。 真空チャンバー内に配置し、ドガのすべての空気の泡が消えるまで。オーブンで 1 時間 80 ° C で治します。</li>
	<li>RT。 使用するデバイス機能から 3 mm 以上をカットし、シリコンウェハ PDMS 層にむけてゆっくりとメスを冷却する PDMS を許可します。分散相入口、連続相の入口と 0.75 mm 径パンチを使用して最上位の PDMS レイヤーで出口をパンチします。</li>
	<li>ダスト粒子を除去する粘着テープと PDMS をクリーンアップします。プラズマは、クリーナー 300 W プラズマで 2 分間同時に PDMS レイヤーを上部と下部の両方を扱います。底層表面の一番上の層、ステレオ顕微鏡を通して表示機能が合うまで比較的表面をスライドさせます。</li>
	<li>強度を高めるし、接合を完了する 1 日 120 ° C のオーブンでデバイスを治します。</li>
</ol>3. 試薬の調製
<ol><li>連続相のソリューションの準備: ヘキサデカン 18 巻 % シリコーン系界面活性剤を溶解することにより。</li>
	<li>分散相のソリューションの準備: 親水性ポリ (エチレング リコール) レート (PEGDA、MW 255) 光開始剤およびローダミン B (5 mg/mL の濃度で含まれている 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (MW 224、98%)95%、MW 479.01) 蛍光染料として 1 モル/L の濃度で。</li>
	<li>連続相と空気圧コント ローラーの 1 つの mL 貯水池を埋めます。分散相で 200 μ L のゲルの読み込みヒントを入力します。</li>
</ol>4. システムの準備
<ol><li>ハイスピード カメラを表示する逆にされた顕微鏡のステージ上半 3 D マイクロ流体デバイスを設置します。</li>
	<li>短いステンレス鋼チューブを接続することによって連続相のパンチ穴にフッ素化エチレンのプロピレン (FEP) チューブを接続し、ゲルの読み込みヒントの最後を分散相のパンチ穴に挿入します。デバイスのプラグをコンセントに FEP 管の全長 20 cm を挿入し、15 mL 遠心管中の端に置きます。 注:システムの構成を図 1に示します。</li>
</ol>5. 液滴形成
<ol><li>倒立顕微鏡のワークベンチにデバイスを置き、別のチャネルのジャンクションが約顕微鏡の光源の位置にあることを確認します。二相交差点を含む領域、オリフィスの地域、および下流チャネルの倒立顕微鏡の焦点を当てます。</li>
	<li>圧力 15 mbar の分散相および連続相の 30 mbar との交差する地域にゆっくりと液を提供する空気圧コント ローラーを使用して 2 つのフェーズを設定します。安定化と泡と PDMS 残渣を伝送していない安定した流体までの 3 分を待ちます。</li>
	<li>制御ソフトウェアのユーザー インターフェイスでパラメーターを入力します。たとえば定数システムの圧力はベースレベルの分散相の圧力を設定、45 mbar でそれを維持します。ヒント ストリーミング モードに噴射からエマルジョン破壊モードが変更されるまでの連続相の圧力を増やすし、安定化のための 5 分を待ちます。</li>
	<li>滴を収集する遠心管にコンセントの穴を接続する FEP 管端を置きます。</li>
</ol>6. PEGDA 粒子のコレクションと評価
<ol><li>治具で効率よく研げる遠心管を修正します。チューブに液相が流れるとき、紫外光照射による急冷凝固による PEGDA 粒子を取得します。</li>
	<li>収集プロセスを仕上げ、サンプルし、PEGDA 粒子をそれぞれ 20 X 60 X オブジェクトと蛍光顕微鏡を使って観察。 注意してください。カメラで撮影したデジタル蛍光画像は、カスタムメイドのソフトウェア ルーチンによって分析されます。画像がアウトの中心光と気の利いたエッジ検出メソッドに基づく画像内のオブジェクトを抽出する球のぼかし効果を排除するために R L アルゴリズム17に基づく最初のデコンボリューション最後に、それぞれの球体の直径は、ハフ変換18を使用して計算できます。その結果、平均と各イメージで球オブジェクトの直径の標準偏差を推定できます。</li>
</ol>

<ol><li>Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18231657">Droplet microfluidics.</a> Lab on a chip. 8, 198-220 (2008).</li>
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</ol>

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2 D と半 3 D マイクロ流体デバイスを用いたフロー フォーカス モードにおける液滴の生成は以前様々 なレポート8,9,15,19,20で開発されています 21。これらのシステムで固まってないことができる水性の液体として選ばれた分散相に脱イオン水8,15,20,21, など, ナトリウムの水溶液安定したヒント ストリーミング モードの形成と水酸化19</...

ナノメートルからマイクロ メートル直径範囲1に単分散液滴を高度生成し、高スループット薬物探索23 の生体分子の合成に大きな可能性を保持することは液滴を用いたマイクロ流体システム ,の4、および5をテスト診断。サンプルの数マイクロリットルの処理と大規模なアプリケーション ・体積比表面積などの小さな液滴のユニークな利点のため技術は幅広い分野での広範な関心を集めています。2 液体の乳化は、液滴を生成する最も一般的な方法の 1 つです。T 字合流管内の流れを中心との共同のジオメトリを流れるを含む異なる液滴形成ジオメトリのさまざまな分野で過去に報告、開発しました。T 字路のジオメトリで分散相は連続相が6、7を流れる、メイン チャンネルに垂直チャネルを介して配信されます。典型的な二次元 (2 D) 流れ中心8,9ジオメトリの分散相流れ、外側; から剪断します。され共同流れるジオメトリ10,11, 一方で毛細血管の分散相の流れをご紹介は co 軸共同流れるジオメトリは、大きく毛細血管内から分散相流れ、剪断、すべての方向。
液滴サイズはチャネルのサイズとフローの率の比を調整することによって制御され、流または t 字路で生成される最小のサイズは数十 μ m に限定。液滴形成システムの流れ中心、液滴の 3 つのモードを形成する二相の圧力比を調整することによって、界面活性剤濃度、輸液を含む政権、ジェッティング政権、ヒント ストリーミング15。ヒント ストリーミング モードはスレッドの形成と分散相流量の円錐形の先端から引き出しスレッドを観察する薄い外観とも呼ばれます。ヒント ストリーミングが数マイクロ メートルを生成可能性があります未満の以前の研究は、液滴を実証している 2D または半 3 D フロー集束デバイス8,12のプロセス。しかし、PEGDA の非常に低濃度水溶液は、分散相として使用された、PEGDA 粒子の収縮率だった元液滴直径の約 60% として希釈せず PEGDA しながら重合後、不安定なヒント ストリーミング モード12に分散相を導いた。エマルジョン プロセスの重要なパラメーターであり、粒径、高世代周波数13、非常に湾曲した先端の減少につながる連続相液体に界面活性剤の添加により減少して界面張力と14の不安定性を防止します。さらに、バルク界面活性剤濃度は臨界ミセル濃度よりはるかに高い、界面張力が約13飽和状態で変数とヒント ストリーミング モードは15を発生することが。
この論文では、上記の観測に基づく半 3 D フロー中心のマイクロ流体デバイス、多層ソフト ・ リソグラフィー法により作製したを使用した PEGDA 液滴生成の安易なアプローチを行った。典型的な 2次元流れ集束デバイスとは異なり、半 3 D フロー フォーカシング デバイスが浅い分散相チャネルおよび深い連続相チャネル分散相は横横、上下からせん断されるように。これはエネルギーと液滴分裂に必要な圧力を減らすことによってフロー フォーカス モードのより大きい調整範囲を提供します。前のレポート12とは異なり、分散相は純粋な PEGDAcontaining 写真-イニシエーター、PEGDA 粒子の収縮率が 1016; よりも低いことを確かめる連続相、シリコーン系非イオン性界面活性剤の高いバルク濃度で溶解ヘキサデカンの混合物です。サイズ制御と均一液滴は、2 段階の圧力比を調整することによって生産されました。液滴の径は、噴射モードからヒント ストリーミング モードへの変更が処理される液滴分裂、80 μ m から 1 μ m に変わります。さらに、PEGDA 粒子は、紫外光照射下での光重合プロセスを通じて合成されました。製作が容易で液滴生成マイクロ流体システムは、生物学的応用のためのより多くの可能性を提供いたします。

<table><tbody><tr><td>シリコンウェーハ</td><td>Huashi Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025, 2100</td><td>Microchem Co.</td><td></td><td></td>Y111069</tr><tr><td>SU-8の開発元</td><td>Microchem Co.</td><td></td><td></td>Y020100</tr><tr><td>クロム マスク</td><td>Qingyi Precision Mask Making Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリジメチルシロキサン (PDMS)</td><td>ダウ コーニング</td><td>シルガード 184</td><td></td></tr><tr><td>ポリ (エチレングリコール) ジアクリレート (PEGDA)</td> <td>シグマ</td><td>26570-48-9</td><td></td></tr><tr><td>2-ヒドロキシ-40-(2-ヒドロキシエトキシ)-2-メチルプロピオフェノン</td><td>TCI</td><td>H1361-5G</td><td>光開始剤</td></tr><tr><td>ヘキサデカン</td><td>シグマ</td><td>544-76- 3</td><td></td></tr><tr><td>アビル EM 90</td><td>CHT</td><td>144243-53-8</td><td>界面活性剤</td></tr><tr><td>ローダミン B</td><td>アラジン</td><td>81-88-9</td><td>蛍光染料</td></tr><tr><td>スピンコーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>リソグラフィー機</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>自動軟膏攪拌機</td><td>Thinky</td><td>ARV-310</td><td></td></tr><tr><td>オーブン</td><td>ブルーパード</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光学顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>ハイスピードカメラ</td><td>浜松</td><td>オルカフラッシュ</td><td></td></tr><tr><td>MAESFLO マイクロ流体制御システム</td><td>FLUIGENT</td><td>MFCS-EZ</td><td></td></tr><tr><td>UVランプ</td><td>FUTANSI</td><td></td><td>365nm UVライト、8000MW/CM2</td></tr></tbody></table>

サイズ制御されたポリ (エチレング リコール) レート液滴を介して半 3 次元流れ焦点マイクロ流体デバイスの生成

Generation of Size-controlled Poly (ethylene Glycol) Diacrylate Droplets via Semi-3-Dimensional Flow Focusing Microfluidic Devices

中心にマイクロ流体デバイス プロセス フローを介して均一でサイズ制御ポリ (エチレング リコール) レート (PEGDA) 液滴を作り出すことができます。液滴形成のため semi-three-dimensional (半 3 D) 流れ焦点マイクロ流体チップを提案する.多層ソフト ・ リソグラフィー法を用いたポリジメチルシロキサン (PDMS) チップを試作しました。界面活性剤を含むヘキサデカンが連続相として使用され、紫外線 (UV) 光開始剤と PEGDA は分散相。界面活性剤を削除するローカルの表面張力と小さなマイクロ液滴に分割を促進したよりカスプの先端を形成します。分散相の圧力は一定、液滴のサイズは、分散相流量が打ち切られた前に連続相の圧力の増加とともに小さくなった。その結果、直径 80 μ m 1 μ m からサイズ バリエーションと液滴を選択的に 2 つの入口チャネルの圧力比を変更することによって達成される可能性し、変動係数の平均は 7% 以下と推定されました。さらに、液滴は、光重合のための紫外光照射によるマイクロ ビーズになるかもしれない。このようなマイクロ ビーズ表面に抱合生体分子生物学と化学の分野で多くの潜在的なアプリケーションがあります。

前述のように多層ソフト ・ リソグラフィー技術を使用して半 3 D フロー焦点マイクロ流体チップを試作しました。作製及び図 2に示すように protocolare でマスター型の結果。65 μ m ワイド チャンネルを分散相と、50 μ m 幅のオリフィス (図 2、) を導入するため、第 1 の層は、厚さ 20 μ m です。また 130 μ m 厚層を使用して、連続相チャネルと出口チャネル (図 2b) を提供します。図 2cは、完成した金型を示しています。入口のフィルターは入力から PDMS のパンチ穴の破片を防ぐために設計されています。これは、(図 2d...

ここでは、製造プロセスと semi-three-dimensional (半 3 D) 流れ焦点マイクロ流体チップ液滴形成のための検証実験を説明するためにプロトコルを提案します。

Uniform and size-controllable poly (ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) droplets could be produced via the flow focusing process in a microfluidic device. ...

この方法は、半三次元フローフォーカシングPDMSチップの製造や純粋なPGD液滴の生成など、マイクロ流体液滴形成分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この戦術の主な利点は、セミ3Dフローフォーカシングデバイスがフローフォーカシング金型のより大きな試験場を提供することです。純粋なPGDは、PGD粒子の比率が10%未満であることを確認しますこの技術の意味は、表面積と体積の比率が大きいため、多くの生化学的影響に拡張できます。ノズル、大規模なアプリケーションは、サンプルの数マイクロリットルを消費するこの技術の利点になります。現在、この方法はPGD飛沫形成に関する洞察を提供することができます。また、ガスを装備したフローフォーカシング分析などの他のシステムにも適用できます。一般に、この方法に不慣れな個人は、オリフィスの詰まりと先端の流れ型の不安定性のために苦労します。この方法が重要であるのは、半流路フォーカシングチップの作製は、手作業で半流路チップを製造するための上部と下部のPDMS層の位置合わせが見直されないため、習得が困難であるためです。2 つのフォトマスクを標準的な手法を使用して設計します。同じ図面ファイル内のマスク 1 とマスク 2 に 2 つの別々の画層を使用して、すべての接続が異なるチャネル間で整列するようにします。マスク 1 には分散フェーズ インレット チャネルとオリフィスが含まれ、マスク 2 には連続フェーズ インレット チャネル、フィルター、およびアウトレットが含まれます。2つの位置合わせマークを使用して、異なるレイヤーをガラス上のクロムプレートに個別に印刷します。次に、指定されたフォトリソグラフィーラボで、直径3インチのきれいなシリコンウェーハをスピンコーターに置き、真空をオンにしてウェーハをスピンチャックに貼り付けます。2〜3ミリリットルのSU-8 2025ネガフォトレジストをウェーハに1, 000rpmで10秒間スピンコートします。次に、速度を3, 000 rpmsに30秒間変更します。これにより、最初の層に20ミクロンの層厚が提供されます。最初の層を摂氏95度のホットプレートに6分間置いて柔らかく焼きます。次に、ウェーハを取り出して室温に戻します。ソフトベイクされたウェーハを、コリメートされたUVライトの下でマスク番号1に18秒間露光します。UV露光後、95°Cのホットプレートでウェーハを6分間ポストベークします。その後、ウェーハを室温まで冷まします。2〜3ミリリットルのSU-8 2100ネガフォトレジストを使用して、スピンコーティングプロセスを2回繰り返します。ウェーハを 1, 000 rpm で 10 秒間回転させ、次に 2, 000 rpm で 30 秒間回転させます。これにより、2 層目の厚さは 130 ミクロンになります。95°Cのホットプレートで35分間ソフトベーキングした後、2層目のフォトレジストにマスクNo.2を並べ、30秒間UV光を照射します。次に、摂氏95度のホットプレートで7分間ポストベークします。室温に戻したら、ウェーハ上に特徴が明らかになるまで、50ミリリットルのプロピレングリコールメチルエーテルアセテートの攪拌槽に浸してウェーハを現像します。次に、ウェーハをエチルアルコールで洗浄します。最後に、ウェーハをサーモスタットプラットフォームに置き、摂氏95度で2時間ハードベークします。PDMSモノマーとその硬化剤を、最上層が10:1、最下層が8:1の比率で4分間混合します。軟膏自動攪拌機を用いて、シリコンウェーハを90mmのシャーレにセットし、8:1の比率のPDMS混合物を金型上に2〜3mmの厚さまで注ぎます。次に、すべての気泡が消えるまで真空チャンバー内でPDMSを脱気します。ペトリ皿をオーブンに入れ、PDMSを摂氏80度で1時間硬化させます。室温に戻したら、メスを使用してデバイスをフィーチャから少なくとも3ミリメートル離して切断し、シリコンウェーハからPDMS層をゆっくりと剥がします。次に、直径0.75ミリメートルのパンチを使用して、分散した位相入口、連続位相入口、および出口を上部のPDMS層に打ち抜きます。PDMSの表面を粘着テープで清掃し、ほこりの粒子を取り除きます。次に、上部と下部の両方のPDMS層を同時にプラズマクリーナーに入れ、300ワットで2分間プラズマにさらします。プラズマ曝露の直後に、最上層を最下層に置き、実体顕微鏡で見ると特徴が整列するまで表面を相対的にスライドさせます。120°Cのオーブンで1日硬化させると、強度が増し、接着が完了します。まず、シリコーンベースの非イオン性界面活性剤の18%をヘキサデカンに溶解して、連続相溶液を調製します。次に、親水性ペグジアクリレート、蛍光染料1リットルあたり1ミリモル、光開始剤1ミリグラムあたり5ミリグラムを添加して、分散相の溶液を調製します。空気圧コントローラーの1ミリリットルのリザーバーに連続相を充填します。次に、200 μリットルのゲルローディングチップに分散相を充填します。ハイスピードカメラを搭載した倒立型光学顕微鏡のステージにセミ3Dマイクロ流体デバイスを置きます。次に、フッ素化エチレンプロピレンチューブを短尺のステンレスチューブに取り付け、ゲルローディングチップの端部にチューブを挿入し、分散相のパンチ穴にチップを装着して、連続相のパンチ穴にフッ素化エチレンプロピレンチューブを接続します。次に、長さ20cmのFEPチューブをデバイスの出口に挿入し、端をペトリ皿に入れます。倒立顕微鏡を、二相交差、オリフィス領域、および下流チャネルを含む領域に焦点を合わせます。次に、接続された空気圧コントローラーを使用して、2つの相の圧力を設定します。分散相を 15 ミリバールに設定し、連続相を 30 ミリバールに設定します。圧力が安定するまで3分間待ち、気泡やPDMS残留物が運ばれず、安定した流体の流れに達します。次に、システムの基本レベル圧力としての分散相の圧力を45ミリバールに設定します。エマルジョンのブレークアップモードが噴射から先端ストリーミングモードに変更されるまで、連続相の圧力を上げます。その後、安定するまで5分待ちます。セットアップが完了したら、出口穴をシャーレに接続するチューブ端を配置し、液滴を収集します。それらをUV光にさらし、そこで急速に球体に固化します。分散相チャネルと連続相チャネルの深さが異なるため、分散相流は連続相流によってすべての方向に圧迫されます。その結果、対称的な円錐形の液体チップが形成され、液滴が連続的に生成されます。液滴のサイズは、分散相流と連続相流の圧力比によって変化します。ここでは、連続相の圧力がせん断力に影響を与えるように変更され、液滴の分解プロセスが噴射モードから先端ストリーミングモードに変化します。液滴は光重合により固化し、チップから出る際に粒子を形成します。ここに示されている液滴は、異なる圧力比で形成されました。結果として得られる液滴半径は、連続相と分散相の圧力比に反比例します。この技術は、生物学的応用分野の研究者に道を開き、創薬、生体分子の合成、診断テストのための強力なツールを提供します。このビデオを見れば、半3次元マイクロ流体チップの製造方法と、マイクロPGD液滴を数個生成する方法を十分に理解できるはずです。フォトレジストPGMEAでの作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には使い捨て手袋やマスクの着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

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