静脈瘤形成と中枢神経の軸索の回復を研究するための Microbiomechanical システム
April 30th, 2018
このプロトコルでは、ニューロンの下肢の急速かつ可逆的誘導の生理学的に関連する、加圧液体のアプローチについて説明します。
この加圧流体セットアップの全体的な目標は、培養ニューロンの軸索に沿って再現性のある一貫した腫脹を生成することです。この方法は、損傷後のニューロンの細胞内形態学的変化の背後にあるメカニズムなど、脳損傷分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、この方法が時間の経過とともに回復する一貫性のある反復可能な形態学的変化を生成することです。
これは、私たちが研究室で開発した非常に重要な技術です。これは、このシステムを使用して、新しい形態のニューロン可塑性として、機械的ストレスによる軸索形態変化を支配する分子メカニズムを特定できるだけでなく、軽度または外傷性脳損傷の新薬や治療戦略を特定するためのスクリーニングツールとしても使用できるためです。この手順を開始するには、12mmまたは25mmのカバースリップの1つ以上のボックスを70%の硝酸を含むガラスビーカーに入れ、カバースリップを室温で一晩インキュベー
トします。翌日、すべてのカバースリップを2.5リットルの二重蒸留水で満たされた4リットルのビーカーに移します。カバースリップの入ったビーカーを100RPMで1時間振って、振るときにビーカーを保持するために輪ゴムを使用することを忘れないでください。その後、清掃したカバースリップを金属カバー付きの乾いたフラスコに移します。
カバーガラスを摂氏225度のオーブンで6時間焼きます。その後、室温まで冷まし、使用するまで滅菌したプラスチック容器に保管します。次に、24ウェルプレートの各ウェルにカバースリップを1枚入れます。
30ミリメートルのカバーガラスに12マイクロリットルのカバーガラスコーティング溶液を加えて渦巻きます。その後、各ウェルに1ミリリットルの滅菌PBSを追加します。このプレートは、すぐに使用することも、摂氏4度で滅菌PBSに入れて最大1週間保存することもできます。
解剖当日は、プレートからPBSを取り除きます。風乾し、プレートをUVライトの下に2〜4時間置きます。海馬ニューロンを解離して培養するには、プロテアーゼ酵素溶液を解凍し、めっき培地を摂氏37度で予温します。
次に、解剖した海馬をSLDSですすいでください。次に、それを取り除き、2ミリリットルのプロテアーゼ酵素溶液を加え、サンプルを摂氏37度で15分間インキュベートします。その後、海馬外植片を5〜10ミリリットルのめっき培地で2回洗浄し、5ミリリットルのめっき培地を追加します。
海馬の外植片を単一の細胞に解離し、1ミリリットルのプラスチックチップを備えたピペットを使用して小さな渦を発生させます。溶液が濁り、大きな外植片が残らなくなるまで、酸素の泡の形成を避けながら約40回ピペットで上下します。次に、細胞を重力の1、125倍で3分間遠心分離します。
細胞を培地に浸した状態で上清を取り除き、145ミリリットルのめっき培地に細胞を再懸濁します。次に、ウェルあたり1ミリリットルの細胞懸濁液を24ウェルプレートに加えます。プレーティング培地で細胞を摂氏37度で2〜4時間インキュベー
トします。その後、めっき媒体を取り外し、新しいメンテナンス媒体と交換してください。2日後、培地の半分を維持培地に溶解した2マイクロモルRSCと交換して、線維芽細胞、内皮細胞、グリア細胞の増殖を阻害します。次に、細胞をRSCに2日間さらした後、培地を新鮮な維持培地と交換します。
細胞形態の可視化のためにトランスフェクションするには、Opti-MEM培地およびボルテックス中で、ストックからコンストラクトを1マイクロリットルあたり1マイクログラムで希釈します。次に、リポソーム媒介トランスフェクション試薬をOpti-MEM培地およびボルテックスで希釈します。その後、各ウェルに対して1つの構造希釈液と1つのトランスフェクション希釈液を調製します。
次に、コンストラクトとOpti-MEM培地とトランスフェクション試薬、Opti-MEM培地とボルテックスを1対1で混合した液を調製します。混合物を室温で20分間インキュベートします。20分後、各ウェルから培地の半分を取り出し、この培地をきれいな円錐形のチューブに移します。
チューブをインキュベーターに保持し、次に前のステップで調製した混合物の100マイクロリットルをウェル内の残りの培地に加えます。細胞を摂氏37度で20〜30分間インキュベートします。インキュベーション中に、コニカルチューブ内の培地に1容量の新鮮なメンテナンス培地を加え、混合物を同じインキュベーターに入れます。
インキュベーション後、トランスフェクション溶液を含む培地をウェルから取り出し、コニカルチューブ内の古いメンテナンス培地と新鮮なメンテナンス培地の1対1の混合物と交換します。この手順では、ピペットをマイクロマニピュレーターのスクリュー上部に挿入して所定の位置に保持します。マイクロマニピュレーターアームに取り付けられている金属製のフラットトップネジをねじ込み、ゴムチューブが取り付けられている場所のすぐ上にピペットの引っ張られていない端を保持するようにします。
カバースリップを含むニューロンの表面に対してピペットを45度の角度で傾けます。蛍光フィルターをオンにします。開口部を開けて、対物レンズを通して蛍光スポットが見えることを確認します。
マイクロマニピュレーターを使用して、ピペットを先端と蛍光スポットが揃う位置に移動し、ピペットを細胞培養皿の高さのすぐ上に下げます。所定の位置になったら、透過光をオンにし、蛍光をオフにします。ピンセットを使用して、細胞培養プレートから細胞をピペットに向けて、室温で2ミリリットルのハンク緩衝液が入った細胞培養皿に1枚のカバースリップを移します。
ファインフォーカスノブと20折り対物レンズを使用して、セルの約4回転上の平面に焦点を合わせます。次に、マイクロマニピュレーターを使用して、ピペットチップが焦点を合わせ、接眼レンズを通して見える平面の中央左側に来るように配置します。ピペットが所定の位置に配置されたら、対象領域を含む平面に顕微鏡の焦点を合わせます。
7つのdivのイメージングでは、GFPトランスフェクトマウス海馬ニューロンは、膨らみ前と膨らみ後、およびその後の10分間の回復期間を示しました。これは、同じニューロンのタイムラプスイメージングのキモグラフです。赤い矢印は、190ミリリットルのH2Oパフの150秒後に形成された静脈瘤を示しています。
このテクニックは、一度マスターすれば、適切に実行すれば3時間で完了します。この手順に続いて、全細胞記録、タイムラプスFRETおよびTIRFイメージング、カルシウムイメージングなどの他の方法を実行して、機械的ストレスが神経および電気的およびカルシウムシグナル伝達、タンパク質輸送および相互作用に与える影響などの追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、光外傷性脳損傷の研究者が、生きているニューロンの軸索静脈瘤形成の根底にある分子メカニズムを説明する道を開きました。
このビデオを見た後、中枢ニューロンの機械感覚を研究するための実験の実行方法についてよく理解しているはずです。
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概要
このプロトコルは、培養ニューロンに急速で可逆的な膨大を引き起こす加圧流体アプローチを記述しています。これは機械的ストレスによる細胞下形態学的変化のメカニズムを解明することを目的としており、神経可塑性および脳損傷治療の研究に価値があります。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 神経可塑性
- 細胞培養技術
背景
- この研究は神経形態学と機械的ストレスへの適応に焦点を当てています。
- 膨大は軸索に沿った腫れで、神経機能の理解に重要です。
- この技術は脳損傷メカニズムの研究に重要です。
- これらの変化を再現する能力は、薬物スクリーニングや治療戦略に影響を与えます。
研究目的
- 一貫した神経形態学的変化を誘導する方法を確立すること。
- これらの変化の基礎となる分子メカニズムを調査すること。
- 治療のための新しい戦略を特定すること。
使用された方法
- この方法は培養ニューロンモデルを使用し、海馬ニューロンに焦点を当てています。
- カバースリップと細胞培養のための特定の準備ステップが含まれます。
- テキストではマルチオミクスのワークフローは言及されていません。
- 重要なステップには、カバースリップの洗浄、コーティング、および可視化のための細胞のトランスフェクションが含まれます。
- 加圧流体セットアップを使用して、ニューロンの軸索腫れを誘導します。
主な結果
- この技術は時間とともに回復する繰り返し可能な形態学的変化を生み出します。
- 機械的ストレスによって引き起こされる神経可塑性の探索を可能にします。
- ストレスに対する生物学的反応をモニタリングでき、回復メカニズムへの洞察を提供します。
- 結果は外傷性脳損傷反応の理解に貢献する可能性があります。
結論
- この研究は神経形態学的変化を調査するための信頼できる方法を確立しました。
- この発見は、損傷と回復に関連する神経適応メカニズムに光を当てています。
- この方法は神経損傷モデルにおける治療介入のスクリーニングの可能性を秘めています。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This pressurized fluid system enables rapid, reversible induction of axonal varicosities in central neurons, providing a controlled model to study mechanosensitive pathways relevant to traumatic brain injury and neuronal plasticity. By linking mechanical stress to subcellular morphological changes and protein dynamics, the method supports target de-risking in early discovery, particularly for ion channel and cytoskeletal targets. Its compatibility with live imaging, electrophysiology, and drug perfusion allows integration into screening cascades for mechanistic validation and lead optimization in neurodegeneration and injury models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transient receptor potential channel activation as a molecular mechanism of mechanical-stress-induced axonal swelling.
- Operational Value: Provides a repeatable, reversible phenotype to validate target engagement and pathway modulation in live neurons.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by correlating fluid pressure inputs with defined axonal varicosity formation and recovery kinetics.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable morphological readouts (varicosity formation/recovery) suitable for high-content imaging-based screening.
- Operational Value: Compatible with drug perfusion and calcium imaging, enabling compound effect assessment on mechanosensitive responses.
- Assay Readiness: Standardized coverslip preparation and transfection protocol ensure reproducibility across wells and experiments.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Models axonal pathology seen in traumatic brain injury, allowing preclinical evaluation of protective or regenerative compounds.
- Mechanistic Continuity: Bridges acute mechanical insult to subcellular repair processes, supporting risk-adjusted advancement decisions.
- Disease Relevance: Directly applicable to studying cytoskeletal dynamics, calcium signaling, and protein trafficking in injury contexts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through phenotypic screening to preclinical efficacy testing, particularly for neuroprotective and neurorestorative candidates.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of mechanosensitive ion channels and cytoskeletal regulators via controlled axonal deformation.
- Screening: Enables assay standardization for quantifying morphological recovery as a functional readout of compound activity.
- Analytics: Provides time-resolved, quantitative data on varicosity formation and dissolution kinetics for comparative condition analysis.
- Translational Research: Models early axonal pathology in brain injury, allowing preclinical continuity from mechanism to functional outcome.
- Enterprise Reuse: Standardized microfluidic pressure application allows reuse across neuronal types and experimental conditions with minimal reoptimization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in neuronal plasticity studies by isolating mechanical stress as an independent variable.
- Operational Value: Ensures reproducibility of axonal swelling phenotypes, minimizing variability in downstream assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, mechanism-based efficacy signals in injury-relevant models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds targeting axonal integrity and stress response pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuronal culture, microsurgery, and live-cell imaging.
- Depends on pressurized fluid delivery system and micromanipulator for precise axonal targeting.
- Necessitates standardization of coverslip preparation, transfection efficiency, and puff pressure parameters.
- Adaptation to other neuron types may require optimization of dissociation and culture conditions.
- Practical limitations include technical complexity of setup and need for specialized micromanipulation skills.
