Name: 静脈瘤形成と中枢神経の軸索の回復を研究するための Microbiomechanical システム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 学ぶ 加圧流体法による培養海馬ニューロンの軸索静脈瘤誘導技術。機械ストレス応答と神経可塑性の分子メカニズムを解明し、外傷性脳損傷治療薬のスクリーニングに応用可能です。

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すべての動物実験は、国立機関の健康動物使用のガイドラインに従って実施されています。この作品は、一部に C. 区国立衛生研究所 (R01NS093073 と R21AA024873) からの助成金によって支えられました。

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この microbiomechanical のアッセイのプロシージャはまっすぐ進むです。そのすべてのステップは慎重に行われている場合信頼性の高い結果が生成されます。正常なデータ収集の妨げになる場合は、不適切な実行、いくつかの主要な手順があります。重要なステップが始まる上流たばこを吸う刺激の実際に適用しました。細かく、養殖と一次ニューロンの文化のケアが最も重要です。培養神経細胞が健全でない場合彼らが反応しない一貫して、以来、彼ら可能性がありますが既にされて準備万端ストレス。文化、初期セットアップと下肢が誘発される coverslip 表面から細胞の剥離は発生しませんが、根気よく行う必要があります、整合の圧力を提供するためにたばこを吸う装置の校正の下流。セッティングの正確な校正は、ピペットの目詰まり、チューブ、またはバルブの問題のための 1 時間をかかることがあります。皿にセルを配置し、ピペット チップを配置に進む前に最低限の抵抗とピペットから液が流れていることを確認する重要です。設定への変更が懸念している限りでは、血流、パッチク ランプ、その他顕微鏡ベースの計測器、顕微鏡の両側に無料の物理的なスペースに主に依存してたばこを吸う装置一組する...

静脈瘤の形成、または腫れ/ビーズ, 軸索に沿っては多くの障害やパーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症を含む中枢神経系の損傷で観察した神経変性疾患の顕著な特徴と外傷性脳損傷1,2。活動電位伝搬とシナプス伝達3軸索下肢の生理学的な影響にもかかわらず、下肢の生成方法は不明のまま。最近、齧歯動物から培養海馬神経細胞の新設 microbiomechanical 試金を使用して、機械的刺激が下肢機能を非常に魅力的なこれらのニューロンを引き起こすことができることがわかった。最初に、静脈瘤の誘導は急速な (< 10 s)、このプロセスは予期せず元に戻せる。第二に、静脈瘤開始が圧力を吹きかける強さ依存: より高い圧力、高速の開始。第三に、静脈瘤の発生は神経年齢に依存します。若いニューロンの軸索はより古いニューロンのそれらと比較して、機械的ストレスに対する応答表示されます。第四に、樹枝状結晶およびこれらのニューロンの軸索の初期セグメント中の海馬ニューロンの軸索に沿って下肢のフォームには、同じたばこを吸う条件変更は表示されません。したがって、我々 の研究は、神経細胞の極性の新規機能を明らかにしました。体外システムこれらの発見は、生理学的に関連しています。軽度外傷性脳損傷 (mTBI)生体内でモデルを使用して、軸索の下肢が閉じる頭蓋骨への影響、私たち体外で一貫した後すぐにマウスの体性感覚野における多焦点方式で開発を示した結果4。私たちの染色・ イメージング mTBI マウスの神経の形態学的変化のスナップ ショットを提供するだけで、体内の実行以来機械的衝撃に神経細胞形態のタイムラプス イメージングはまだ不可能することが重要です。
この液体に吹きかけるシステム機械的応力誘起静脈瘤形成に関連するユニークな機能をキャプチャするのみならず、基になるメカニズムを決定することができました。細胞外のさまざまなソリューション、ブロッカーと機械刺激感受性イオン チャネル、細胞電気生理学の別候補のオープナをテストすることにより一時的な受容器の潜在的な陽イオン チャネル亜科 V メンバー 4 (TRPV4) ことがわかりました吹き込むことによってアクティブ化される Ca2 + +の Na に透過性チャネルは軸索静脈瘤形成4の間に初期の機械的応力を検出を主に担当。これはさらに、siRNA ノックアウト アプローチで確認されました。まとめると、海馬ニューロンの文化を開発したこの新しいアッセイ システム、他の技術との組み合わせでは特に、脳のニューロンのマイクロメカニックスによるプロパティの勉強にとって非常に貴重です。
設けてこのマイクロ システムはユニークないくつかの主要な側面で既存システムとは異なります。まず、このシステムは、ニューロンは圧縮とせん断の形態で面外応力を経験します。機械的衝撃に神経突起 coverslip 表面に接続したまま、移動しないでください。その他実験的曲げ、平面でストレッチを主に含んだシステム (または張力) からこれとは異なり、文字列5,6を移動またはマイクロパターニングゲル上に成長した軸索を伸ばす例えば、バンドルされた軸索の偏向のようなチャンネルと伸縮性膜7,8。また、軸索の下肢に誘起することが流体に吹きかけるシステムでこれらの設定のプロセスのようなこれらの試金が表示されます (数時間6,7,810 分) からのより多くの時間がかかると不可逆的です。最後に、ローカル流体息を切らしを用いてできます静脈瘤形成の空間的特徴の検討 (e.g。、樹状突起スパイン、相馬、軸索の初期セグメント、軸索端末)、時空間特徴のほか。このシステムを使用すると、予期しない、ユニークな機能がいくつか軸索静脈瘤形成、特に急激な発症、低速の可逆性と軸索・樹状突起の極性を発見しました。
本稿で述べるシステムは分子の多くの技術との互換性と、細胞生物学。例えば、機械的ストレスが神経細胞の形態と機能に及ぼす影響を研究するそれと共に使用できますミエリン共、タイムラプス蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) の全内部反射蛍光 (TIRF) イメージングカルシウム イメージング、およびパッチ ・ クランプ記録。本稿で我々 はシステムのコア ・ コンポーネントに焦点を当てます。海馬ニューロンの文化、流体パフィング セットアップ、軸索輸送のための高分解能のタイムラプス イメージングおよびカルシウム イメージングを以下順を追って示します。

<table><tbody><tr><td>12mmカバースリップ&nbsp;</td><td>ワーナー・インストゥルメンツ&nbsp;</td><td>64-0702</td><td>24ウェルプレート用&nbsp;</td></tr><tr><td>25mmカバースリップ&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>12-545-102&nbsp;</td><td>6ウェルプレート用&nbsp;</td></tr><tr><td>酢酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-D-リジン</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>ラットテールコラーゲン&nbsp;</td><td>ロシュ&nbsp;</td><td>11 179 179 001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBSの10倍&nbsp;</td><td>国立診断&nbsp;</td><td>CL-253</td><td></td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>K2SO4</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>P304-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>BP410-500</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl<サブ>2</サブ></td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NaOH フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ酵素&nbsp;</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>P4032</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ギブコ&nbsp;</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム&nbsp;</td><td>ギブコ&nbsp;</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン&nbsp;</td><td>ギブコ&nbsp;</td><td></td><td></td>25030081</tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン100x(P / S)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>MEM アールズソルト&nbsp;</td><td>ギブコ&nbsp;</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>B27サプリメント&nbsp;</td><td>ギブコ&nbsp;</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>ニューロ基礎&nbsp;</td><td>ギブコ&nbsp;</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>アラビノシルシトシン (Ara-C)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>147-94-4</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEMメディア&nbsp;</td><td>ギブコ&nbsp;</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>1854313</td><td>トランスフェクション試薬&nbsp;</td></tr><tr><td>ホウケイ酸ロッド&nbsp;</td><td>ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ株式会社&nbsp;</td><td>PG52151-4</td><td>パフピペット用&nbsp;</td></tr><tr><td>ゴムチューブ&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>14-169-1A</td><td></td></tr><tr><td>10ccプラスチックシリンジ&プランジャー</td><td>ベクトン・ディッキンソン&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター&nbsp;</td><td>サッター・インストゥルメンツ&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>S640-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養ディッシュ (35 mm x 10 mm)</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3294</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Molecular Probes</td><td>F14201</td><td>カルシウムイメージング用&nbsp;</td></tr><tr><td>水戸-YFPコンストラクト&nbsp;</td><td>タカラバイオ株式会社&nbsp;</td><td></td><td>細胞トランスフェクション用&nbsp;</td></tr><tr><td>YFP-N1コンストラクト&nbsp;</td><td>タカラバイオ株式会社&nbsp;</td><td></td><td>細胞トランスフェクション用&nbsp;</td></tr><tr><td>P-1000型 フレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラー&nbsp;</td><td>サッター・インストゥルメンツ&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TE2000-U マクロスコープ&nbsp;</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラン Fluor ELWD 20x レンズ&nbsp;&nbsp;</td><td>ニコン</td><td>062933</td><td>目標&nbsp;</td></tr><tr><td>Apo TIRF 100x/1.49 オイルレンズ&nbsp;</td><td>ニコン</td><td>MRD01991</td><td>目標&nbsp;</td></tr></tbody></table>

静脈瘤形成と中枢神経の軸索の回復を研究するための microbiomechanical システム

A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons

軸索の下肢は、不均一性の高度で軸索の軸に沿って拡大構造です。彼らが神経変性疾患や外傷、脳は通常の脳だけではなく存在です。ここでは、我々 静脈瘤形成と異種タンパク質組成を支配するメカニズムを理解すること急速に、確実に、かつ可逆的に軸索の下肢を誘導するために新設された微小力学系をについて説明します。このシステムは、ニューロン、他の培養システム主に及ぼす伸張の影響に焦点を当てる別の細胞内コンパートメントに及ぼす圧縮と剪断応力を評価するための新しい手段を表します。重要なは、我々 のシステムの固有の機能のおかげで我々 は最近、加圧流体のアプリケーション迅速かつ可逆的に誘発することが一時的な受容器の潜在的なチャネルの活性化を介して軸索の下肢を示す新規発見をしました。私たちの生体力学的システムは、薬剤灌流、ライブセル イメージング、カルシウム イメージング、およびパッチ ・ クランプ記録との組み合わせで便利に利用できます。したがって、このメソッドは、機械刺激感受性イオン チャネル、軸索輸送規制、軸索細胞骨格のダイナミクス、カルシウム シグナル伝達、および形態変化関連外傷性脳損傷を研究するため採用することができます。

息を切らし前、軸索は通常小さな静脈瘤形成を示します。次は私たちの標準圧力 (190 mmH2O 高さ)、多くのビーズのような下肢を開発する軸索開始と息を切らし。下肢の形成は、次の 10 分回復期 (図 2A B) 事前息切れの状態を返す軸索の領域で示すように、部分的に可逆です。回復の長い期間後 (&gt; 20 分)、いくつかの軸索は完全に回復します。急速に、190 mm ステージ上で注射器の正確な位置決めと同様にたばこを吸うピペットの最適位置決めも下肢は生成可能性があります。最適な条件は、若いニューロン (約 7 DIV) 約 5 秒4の軸索静脈瘤形成になります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/5720...

このプロトコルでは、ニューロンの下肢の急速かつ可逆的誘導の生理学的に関連する、加圧液体のアプローチについて説明します。

静脈瘤形成と中枢神経の軸索の回復を研究するための Microbiomechanical システム

Axonal varicosities are enlarged structures along the shafts of axons with a high degree of heterogeneity. They are present not only in brains with ...

この加圧流体セットアップの全体的な目標は、培養ニューロンの軸索に沿って再現性のある一貫した腫脹を生成することです。この方法は、損傷後のニューロンの細胞内形態学的変化の背後にあるメカニズムなど、脳損傷分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、この方法が時間の経過とともに回復する一貫性のある反復可能な形態学的変化を生成することです。これは、私たちが研究室で開発した非常に重要な技術です。これは、このシステムを使用して、新しい形態のニューロン可塑性として、機械的ストレスによる軸索形態変化を支配する分子メカニズムを特定できるだけでなく、軽度または外傷性脳損傷の新薬や治療戦略を特定するためのスクリーニングツールとしても使用できるためです。この手順を開始するには、12mmまたは25mmのカバースリップの1つ以上のボックスを70%の硝酸を含むガラスビーカーに入れ、カバースリップを室温で一晩インキュベートします。翌日、すべてのカバースリップを2.5リットルの二重蒸留水で満たされた4リットルのビーカーに移します。カバースリップの入ったビーカーを100RPMで1時間振って、振るときにビーカーを保持するために輪ゴムを使用することを忘れないでください。その後、清掃したカバースリップを金属カバー付きの乾いたフラスコに移します。カバーガラスを摂氏225度のオーブンで6時間焼きます。その後、室温まで冷まし、使用するまで滅菌したプラスチック容器に保管します。次に、24ウェルプレートの各ウェルにカバースリップを1枚入れます。30ミリメートルのカバーガラスに12マイクロリットルのカバーガラスコーティング溶液を加えて渦巻きます。その後、各ウェルに1ミリリットルの滅菌PBSを追加します。このプレートは、すぐに使用することも、摂氏4度で滅菌PBSに入れて最大1週間保存することもできます。解剖当日は、プレートからPBSを取り除きます。風乾し、プレートをUVライトの下に2〜4時間置きます。海馬ニューロンを解離して培養するには、プロテアーゼ酵素溶液を解凍し、めっき培地を摂氏37度で予温します。次に、解剖した海馬をSLDSですすいでください。次に、それを取り除き、2ミリリットルのプロテアーゼ酵素溶液を加え、サンプルを摂氏37度で15分間インキュベートします。その後、海馬外植片を5〜10ミリリットルのめっき培地で2回洗浄し、5ミリリットルのめっき培地を追加します。海馬の外植片を単一の細胞に解離し、1ミリリットルのプラスチックチップを備えたピペットを使用して小さな渦を発生させます。溶液が濁り、大きな外植片が残らなくなるまで、酸素の泡の形成を避けながら約40回ピペットで上下します。次に、細胞を重力の1、125倍で3分間遠心分離します。細胞を培地に浸した状態で上清を取り除き、145ミリリット

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

住んでいるグラム陰性およびグラム陽性細菌は、ゼラチンコートしたマイカ上に固定し、原子間力顕微鏡（AFM）を用いて液体中に撮像することができます。...

原子間力顕微鏡によるイメージングのための細菌の固定化

このビデオは、マイクロ流体チャンバーシステムを使用して運動ニューロンの軸索輸送を追跡する方法を示しています。これは、ポリマー被覆ウェル内でマウス胚性脊髄組織を栄養培地で培養し、軸索成長を誘導することを含みます。ライブイメージングにおける蛍光色素染色オルガネラの動きは、双方向の軸索輸送を確認します。...

マイクロ流体デバイスを用いた運動ニューロンにおけるオルガネラの軸索輸送の追跡

このビデオは、ニューロンにマイクロメカニカル刺激を加えることにより、軸索静脈瘤の誘導を示しています。このシステムは、チューブを介してバッファーを含むシリンジに取り付けられたマイクロピペットで構成されています。マイクロマニピュレーターを使用して、マイクロピペットをニューロンの上に配置します。次に、流体圧力が加えられて、軸索に静脈瘤が誘発されます。...

ニューロンに対する微小機械的刺激による軸索静脈瘤の誘導

末梢神経系（PNS）は、損傷後の大幅な修理が可能ですが、少しは、この現象を支配する細胞および分子メカニズムについてはほとんど知られていない。ライブ、トランスジェニックゼブラフィッシュと再現神経切断アッセイを使用して、我々は、神経変性と再生の間ダイナミックグリア細胞の挙動を学ぶことができます。...

モーター神経切断とライブゼブラフィッシュにおけるグリア細胞の挙動のタイムラプスイメージング

ショウジョウバエの幼虫は、その半透明のキューティクルと強力な遺伝学へのライブイメージングのための魅力的なモデル系である。このプロトコルは、単層のPDMSデバイスを活用する方法について説明し、 第3齢ショウジョウバエの幼虫の神経細胞内で細胞過程のライブイメージングのための「幼虫チップ」と呼ばれる。...

における損傷応答のライブイメージングや研究のためのマイクロ流体チップを使用<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

レーザーnanodissectionに結合された2つの光子イメージングは​​、細胞内の分解能で中枢神経系の変性と再生のプロセスを研究するための有用なツールである。このプロトコルは、ラベル画像、およびin vivoでの小脳皮質内の単一の登山繊維を分析する方法を示しています。...

小脳軸索のレーザーNanosurgery<em&gt;インビボ</em

私たちは、軸索とミエリンの損傷のダイナミクスをリアルタイムで同時に視覚化するために、2光子励起タイムラプス顕微鏡を利用したプロトコルを提示します。この提案されたプロトコルは、中枢性有髄軸索に影響を与える可能性のある内因性および外因性の両方の要因の研究を可能にします...

アンエクスビボレーザー誘起脊髄損傷モデルがリアルタイムで軸索変性のメカニズムを評価するために

ここでは、in vitroでの脊髄固有の接続の機能的再生を研究するために、マルチ電極アレイ上で培養脊髄スライスに基づいてされているプロトコルを提示します。...

マルチ電極アレイ上に成長させた器官脊髄共培養における機能的再生の調査

この原稿では、微細組織工学ニューラルネットワークの作成について詳しく述べる。三次元のミクロンサイズの構造物は、管状ヒドロゲルに包まれた凝集ニューロン集団にまたがる長い整列した軸索路からなる。これらの生存足場は、神経回路を再構成または調節するための機能的中継として、または灰白色物質の神経解剖学を模倣するバイオフィリックテストベッドとして役立ち得る。...

神経系の再構築、変調、モデリングのための解剖学的にインスパイアされた3次元マイクロ組織工学ニューラルネットワーク

このプロトコルは、軸索損傷後のニューロン代謝ダイナミクスをモデル化するマイクロ流体システムを記述し、内因性代謝リモデリングのイメージング、マルチオミクス分析、およびメカニズム研究を可能にします。...

軸索損傷モデル用マイクロ流体チップの構築とマルチオミクス解析の実現

学ぶ 加圧流体法による培養海馬ニューロンの軸索静脈瘤誘導技術。機械ストレス応答と神経可塑性の分子メカニズムを解明し、外傷性脳損傷治療薬のスクリーニングに応用可能です。

静脈瘤形成と中枢神経の軸索の回復を研究するための Microbiomechanical システム

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