ラットモデルにおける部分的な術後後の漏れを減らすために脂肪組織由来幹細胞シートの移植

それらは組織治癒にプラスの効果を仮定しているため、ASCシートは、心筋梗塞などの多くの疾患モデルでテストされています。この実験は、ASCシートが腹腔内で使用でき、腸に適用できることを示しています。ASCシートの主な利点は、合成材料が不要なことです。

また、ASCシート移植は比較的簡単に行え、少しの練習で済みます。このASCシート移植の新たな応用は、腸切除後の漏出を防ぐために開発されたものであり、新たな治療戦略の第一歩となるものです。腸管吻合にASCシートを塗布すると、漏出防止に有望であることが示されている。

ASCシートは、尿路などの他の腹腔内臓器にも適用できます。まず、サイズ 10 の滅菌外科用ブレード、Adson-Brown 組織鉗子、Metzenbaum はさみを使用して、ヒトの皮下腹部脂肪組織を 0.5 cm の小片に解剖します。滅菌ガラス瓶内の解剖された組織の総量を秤量します。

ボトルあたり30mlのアイソレーションメディウムを追加します。そして、解剖した脂肪組織をシェーカーインキュベーターで150rpm、摂氏37度で1時間消化します。1時間後、消化した組織溶液を50mlのチューブに分け、チューブを390Gで10分間遠心分離します。

培地を添加して細胞ペレットを再懸濁し、さらに培地を最大45 mLまで加え、結合した細胞を390 Gで5分間遠心分離し、上清を除去します。細胞ペレットを10 mLの培地で再懸濁します。

そして、100ミクロンのフィルターで細胞懸濁液をろ過します。50リットルの3%酸性メチレンブルー溶液を50リットルの細胞懸濁液に加え、シラミの赤血球に添加します。溶液を混合した後、10リットルを血球計算盤にピペットで移し、細胞をカウントします。

細胞を1平方cmあたり40000細胞の密度で、培地入りのT175フラスコに播種します。そして、細胞を摂氏37度で5%CO2の湿度の高い雰囲気で24時間インキュベートします。翌日、温かいリン酸緩衝生理食塩水で細胞を洗浄し、細胞の破片を取り除きます。

次に、培地を10%FBS培地に加えて、新たに添加したアスコルビン酸-2-リン酸とヒト組換え線維芽細胞成長因子2と交換します。細胞が90%のコンフルエントに達するまでインキュベートします。脂肪幹細胞を90%コンフルエンスで、標準的な0.25%トリプシン-EDTA溶液を使用して継代培養します。

3〜5分後、0.25%トリプシン-EDTA溶液を10mlの培地で中和します。遠心チューブに移し、細胞を250 Gで8分間遠心分離し、上清を取り除き、細胞を1 mLの培地に再懸濁します。血球計算盤で細胞をカウントした後、T175培養フラスコに細胞を8000細胞/平方cmの密度でプレートします。

残りのASCを液体窒素で凍結し、10%ジメチルスルホキシドを培地で使用してからさらに使用します。直径3.5cmの熱応答性培養皿に、1mlのウシ胎児血清をプレコートします。次に、播種する前に、少なくとも30分間、皿を摂氏37度のインキュベーターに入れます。

熱応答性皿へのASC接着を補助し、培養中のASCシートの早期剥離のリスクを減らすために、細胞播種前に熱応答性皿をウシ胎児血清でプレコートする必要があります。以前と同様にASCをトリプシンしますが、トリプシン処理後に細胞の塊がある場合は、カウントする前に100ミクロンのフィルターで細胞をろ過します。インキュベーターから皿を取り出し、摂氏37度の温め皿に移します。

皿からFBSを取り外します。LG DMEMに細胞ペレットを10%FBSで再懸濁し、細胞をカウントした後、皿ごとに2mlの培養培地で10の6番目のASCsの3.52倍を希釈し、各3.5cm皿に1平方cmあたり400000個の細胞を播種します。皿を静かに振ることにより、細胞をできるだけ均等に慎重に分配します。

その後、ASCシートを5%CO2の湿度の高い雰囲気下で37°Cで48時間培養します。移植当日は、in vivo移植の40分前に培養皿を室温まで冷まし、ASCシートの剥離を容易にします。冷却したら、培地を取り出し、1 mLの無血清LG DMEMと交換します。

細胞シートを移植するには、非外傷性鉗子でASCシートの端をそっとつかみ、ASCシートの皿側を吻合線の上に置きます。シートの適切な取り扱いと正しいシート配置は、無傷のシート移植を成功させるために不可欠です。ASCシートを吻合線の上下約0.25cmまで慎重に伸ばします。

結腸を持ち上げてシートを結腸に巻き付け、ASCシートを背側に巻き付けます。ASCシートを移植しなかった対照動物は、術後3日目に白い矢印で示されているように、吻合線付近で糞便漏出を示します。黒矢印で示されているASCシートを移植した動物は、術後3日目に糞便漏出と膿瘍形成の減少を示しました。

手術の7日後にも同様の結果が認められました。この画像は、HおよびEで染色された移植動物の結腸直腸吻合部位の代表的な断面を示しています.シート構造は、術後7日までの吻合部位で識別できます。一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば数分で実行できます。

ASCシートは、結腸のゼロセル表面に自発的に接着するため、ASCシートにフィットするために接着剤や縫合糸を使用する必要はありません。このビデオを見た後、結腸部分切除後の漏出を防ぐために、ASCシートをラットの結腸直腸吻合部に移植する方法を十分に理解しているはずです。