Name: 世代と複雑な染色体と細胞周期逮捕細胞の分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: 学ぶ細胞周期停止した複雑な染色体を持つArCK細胞の分離法。RPE-1 hTERT細胞を用いたシェイクオフ技術で、免疫系との相互作用研究に有用な細胞集団を効率的に得る方法です。

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この作品は、国内機関の健康の付与 (CA206157-22 と GM118066) とアンジェリカ アモンにぞんざいな大理石がん研究基金によってコッホ研究所サポート (コア) グラント P30 CA 14051 国立がん研究所から一部支持されました。アンジェリカ アモンもハワード ヒューズ医学研究所と医歯薬学研究グレン財団法人の捜査官です。アメリカ イタリアがん財団 (AICF)、マリー ・ キュリー ・ アクションから癌研究 (AIRC) のためのイタリアの協会がん研究の交わりによって、キ Quinquennial がん研究員、s. s. がサポートされていました。E. m. は、ハワード ヒューズ医学研究所から奨学金によって支えられました。

培養条件
RPE 1 テロメラーゼ セルラインだったダルベッコ変更イーグル培地中で培養 (材料表) 10% を添加したウシ胎児血清、2 mM L-グルタミン 100 U/ml ペニシリン/ストレプトマイシン。セル 5% CO2加湿環境で 37 ° C で培養。下記プロトコル 10 cm 皿を使用して開発されているし、報告されるすべての技術的な詳細は、これらの料理を参照してください。別の料理を使用している場合スケール アップまたはそれに応じてダウンします。
1. 網膜色素上皮細胞の同期
<ol><li>すべての実験のための以上 15 通路を受けていない新鮮な解凍のセルを使用します。1 日に解凍し、~2.5 - 10 cm 培養皿に 105 RPE 1 テロメラーゼ セル x 5.0 を調剤します。標準的な成長媒体の 8 mL を追加し、一晩インキュベートします。(診断) などの標準的な細胞カウンターを使用してセル数を決定します。 注: セル密度は RPE 細胞の成長条件を指します。成長条件が異なるセルは並ぶ; の間で異なる場合があります。それらをそれに応じて調整することを検討してください。</li>
	<li>2 日目、通常成長培地を吸引し、5 mM チミジンを含む 8 mL の培地を追加して G1/S のボーダーでセルを同期します。 注: チミジン濃度と治療期間を異なる細胞間で異なる場合があります。テストするセルの行の最適な条件を決定するためのパイロット実験を実行することをお勧めします。</li>
	<li>3 日目、24 h チミジン培地 (ステップ 1.2) を追加した後、培地を吸引・洗浄の 3 回 1 × PBS のセルによってチミジン ブロックからのリリースします。通常培 8 mL を追加し、インキュベーターにプレートを返します。</li>
</ol>2 世代異数性の細胞分裂期キナーゼ Mps1 の活動と干渉
<ol><li>3 日目、リリース後 6 h チミジン ブロックから (ステップ 1.3; 細胞が有糸分裂を入力する前に、これは約 3-6 時間)、培地を吸引、1 × PBS で 1 回洗浄し、500 nM リバーシン (Mps1 阻害剤) を添加した培地で置き換えます。 注: RPE 細胞有糸分裂 9 12 h を入力後チミジン ウォッシュ アウト10,11。ただし、細胞周期は異なる細胞株によって異なります。したがって、(例えば、DNA コンテンツを介してFACS 解析を測定することによって) 確立された方法によって細胞周期解析を実行してパイロット実験におけるそれらの動態を決定することが重要です。さらに、細胞間最適な作業 Mps1 阻害剤濃度が異なる場合があります。RPE1 細胞を用いた以前の実験は、500 nM10、11,12の作業濃度リバーシンを使用して成功しています。テストするセルの行の最適な濃度を決定するためのパイロット実験を実行することをお勧めします。</li>
	<li>日目 4、12 h リバーシン治療 (約 6 h 細胞有糸分裂後) 後、リバーシン培地を吸引し、洗浄 3 回 1 × PBS のセル。プレートに 8 mL の正規の成長培地を追加し、インキュベーターにセルを返します。</li>
</ol>3. Aneuploid サイクリング細胞と ArCK 人口の濃縮の除去
<ol><li>日 6、約 72 時間細胞を入力最初の細胞分裂後に (手順 2.2; リバーシン洗浄アウト後, 約に相当する約 66 時間は、この 2-3 細胞周期)、培地を吸引、1 × PBS で 1 回洗浄、300 nM ノコダゾールを含有する培地に置き換えます。 注: 最近の仕事は示した RPE 1 細胞の染色体の異数性 genomically 不安定について彼らの増殖を逮捕最初不良有糸分裂10の後の 2-3 細胞周期。ただし、この速度は異なる細胞の間で異なる場合があります。したがって、構成するサイクリング細胞の除去のための適切なタイミングを決定するためのパイロット実験を実行することが重要です。</li>
	<li>一日 7、ノコダゾール治療後 12 h 培地を吸引し、プレートに 3 mL の 1x PBS を追加します。プレートの側面をタップすることで分裂期の細胞を振り払います。分裂細胞も除去できるように各タップ プレートを回転させます。</li>
	<li>分裂期細胞の完全な除去を確実には、複数のラウンド (3-5 回を推奨)、吸引・追加 3 mL の 1x PBS 各ラウンド間の振り払いプロセスを繰り返します。</li>
	<li>振り払い後、軽く蓋または板のエッジに付着した液体を吸い出しなさい。簡単に言えば、10 倍の倍率の顕微鏡の下でプレートを確認してください。いくつかの分裂期の細胞が観察されることを確認します。5 つ以上の分裂期の細胞は、対物レンズ 10 倍の下で見られている、振り払いの別のラウンドを繰り返します。 注: 分裂期細胞は丸みを帯びているが、振り払い後部分的に切断可能性があります。ノコダゾール治療の次のラウンドに細胞を公開する前に分裂細胞の完全な除去のために重要です。そう失敗はおよび/または四倍体細胞生成の結果有糸分裂細胞死につながる可能性があります。</li>
	<li>最終的な揺れオフ後 5 mL の 1x PBS で 1 回細胞を洗います。プレートに 330 nM ノコダゾールを含む 8 mL の培地を追加し、12 時間インキュベートします。</li>
	<li>孵化後分裂細胞が観察されなくなるまでノコダゾール治療/振り払い (ステップ 3.1 3.5) 12 時間間隔を繰り返します。通常、治療/手ふれ off の 4-5 回を推奨します。 注: ここで提供される情報は、RPE 細胞を参照してください。治療/手ふれ off のラウンド数は、異なる細胞間で異なる場合があります。ノコダゾールに長引くと不必要な露出を避けるために、慎重に判断して、パイロット実験における異数サイクリング細胞の効率的かつ完全な除去のために必要なラウンド数に不可欠です。</li>
	<li>ノコダゾール治療/振り払い (ステップ 3.1 3.6) の 4 〜 5 ラウンドの後通常成長培地 10 mL を加えるし、孵化させなさい。将来の操作または試金の使用前に 12-24 時間の残りの部分にセルを許可します。 注: 最終振るオフ後セルが皿に残って逮捕細胞周期、最近10、示すように、複雑な染色体を抱きます。これらの細胞は、弧 (複雑核型で逮捕) 細胞と呼ばれます。分離の一週間以内 ArCK 集団でアッセイを実行することをお勧めします。</li>
	<li>必要に応じて、複雑な染色体で逮捕された細胞の割合を評価するために収集し、スタンダード セルのカウンターを使用して各シェイクオフからセルをカウントします。</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig1.jpg"> 図 1: 生成し、複雑核型 (弧) と代表的な画像を構成する細胞の分離に使用するメソッドの全体的なスケマティック。(A)図の ArCK 細胞世代と分離のプロトコル。(B) RPE 1 テロメラーゼ細胞治療の各段階での代表的なイメージ。(赤で記載) の最後のパネルでは、分離の ArCK セルを表します。スケール バー 100 μ m.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
4. ArCK 人口の特性評価
<ol><li>次の試金の実行によって ArCK 人口の分離を成功させるを確認します。<ol>
<li>ロバ β-ガラクトシダーゼ (老化マーカー) を染色、市販を使用してキット (材料の表を参照してください)。</li>
		<li>市販キット (材料の表を参照) を用いて CCL2 などの炎症性サイトカインの分泌を測定します。</li>
		<li>細胞周期阻害剤 p53、p21、ウェスタンブロットで p16 の増加されたレベルを確認します。 注: これらのアッセイを正しく制御するため ArCK 集団は欠異数のサイクリング細胞と比較する必要があります。前者は低通過、野生型 RPE 1 テロメラーゼ細胞は指数関数的に成長しています。後者は RPE 1 テロメラーゼの偏析を誤染色体を誘導する、最初異常有糸分裂後 72 時間のセルを収穫して取得できます。これを行うには、最初のノコダゾール治療 (ステップ 3.1) の前に右ステップ 1.1 および収穫細胞から上記プロトコルに従います。</li>
	</ol>
</li>
	<li>逮捕された細胞の核型を評価するために単一セルのシーケンスを実行します。 メモ: 単一セルの配列は、単細胞レベル13でセル人口の間で染色体とサブ染色体の変化を調べること確立された方法です。単一セルのシーケンスを実行する方法の詳細な手順は、他の場所で10で見つけることができます。</li>
</ol>

<ol><li>Santaguida, S., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-+and+long-term+effects+of+chromosome+mis-segregation+and+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Short- and long-term effects of chromosome mis-segregation and aneuploidy.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 473-485 (2015).</li>
<li>Pfau, S. J., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+instability+and+aneuploidy+in+cancer%3A+from+yeast+to+man%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Chromosomal instability and aneuploidy in cancer: from yeast to man.</a> EMBO reports. 13 (6), 515-527 (2012).</li>
<li>Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+aneuploidy+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of aneuploidy in cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (3), 189-203 (2012).</li>
<li>Holland, A. J., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boveri+revisited%3A+chromosomal+instability%2C+aneuploidy+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 478-487 (2009).</li>
<li>Meena, J. K., Cerutti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+abrogates+aneuploidy-induced+telomere+replication+stress%2C+senescence+and+cell+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Telomerase abrogates aneuploidy-induced telomere replication stress, senescence and cell depletion.</a> The EMBO Journal. , 1-14 (2015).</li>
<li>Ohashi, A., Ohori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy+generates+proteotoxic+stress+and+DNA+damage+concurrently+with+p53-mediated+post-mitotic+apoptosis+in+SAC-impaired+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells.</a> Nature Communications. 6, 7668(2015).</li>
<li>Passerini, V., Ozeri-Galai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+extra+chromosomes+leads+to+genomic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The presence of extra chromosomes leads to genomic instability.</a> Nature Communications. 7, 10754(2016).</li>
<li>Sheltzer, J. M., Blank, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy+drives+genomic+instability+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy drives genomic instability in yeast.</a> Science. 333 (6045), 1026-1030 (2011).</li>
<li>Zhu, J., Pavelka, N., Bradford, W. D., Rancati, G., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyotypic+determinants+of+chromosome+instability+in+aneuploid+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Karyotypic determinants of chromosome instability in aneuploid budding yeast.</a> PLoS Genetics. 8 (5), e1002719(2012).</li>
<li>Santaguida, S., Richardson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+Mis-segregation+Generates+Cell-Cycle-Arrested+Cells+with+Complex+Karyotypes+that+Are+Eliminated+by+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Chromosome Mis-segregation Generates Cell-Cycle-Arrested Cells with Complex Karyotypes that Are Eliminated by the Immune System.</a> Developmental Cell. 41 (6), 638.e5-651.e5 (2017).</li>
<li>Santaguida, S., Vasile, E., White, E., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy-induced+cellular+stresses+limit+autophagic+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy-induced cellular stresses limit autophagic degradation.</a> Genes & Development. 29 (19), 2010-2021 (2015).</li>
<li>Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+role+of+MPS1+in+chromosome+biorientation+and+the+spindle+checkpoint+through+the+small+molecule+inhibitor+reversine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine.</a> The Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).</li>
<li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genome+sequencing%3A+current+state+of+the+science%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell genome sequencing: current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).</li>
<li>López-Soto, A., Gonzalez, S., López-Larrea, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosurveillance+of+Malignant+Cells+with+Complex+Karyotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Immunosurveillance of Malignant Cells with Complex Karyotypes.</a> Trends in cell biology. , 1-4 (2017).</li>
<li>Watson, E. V., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy+Police+Detect+Chromosomal+Imbalance+Triggering+Immune+Crackdown%21%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+genetics%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy Police Detect Chromosomal Imbalance Triggering Immune Crackdown!</a> Trends in genetics: TIG. , 1-3 (2017).</li>
</ol>

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この新規メソッドを生成し、複雑な染色体 (弧) の逮捕された電池の豊かは、複数の染色体の利得または損失を持ち、分割停止細胞の研究のためことができます。方法セットアップは迅速かつ信頼性の高い方法で ArCK 細胞の分離を容易にする設計されています。
この試験で最も重要なステップは、薬物治療のタイムラインと、最も重要なは、構成するサイクリング細胞の除去厳密制御です。最適な結果を得るのためのノコダゾール治療と振るオフのタイミングは特に重要な彼らはまだ丸みを帯びたと分裂、G1 に分裂細胞死やスリッページの可能性を防止するプレートからサイクリングのセルを削除するには四倍体の人口を作成する可能性があります。推奨 12 h ノコダゾール インキュベーションから 2 時間以上を振り払いのタイミングに逸脱はお勧めできません。
将来に関する ArCK 細胞どのように複雑な染色体のより深い理解を促進する可能性がある細胞生理学に影響を与えます。特に、最近の研究は、免疫系の細胞と対話すること、トリガー免疫クリアランス ArCK の細胞10を示した。ここで述べる方法免疫クリアランス未変換細胞とどのように発癌の研究の基礎となる分子メカニズムの解明を含む ArCK セルのさらなる評価のため優秀な出発点を提供します。この監視のメカニズム、フィールド14,15の重大な質問をバイパスがあります。

染色体分配の過程でエラーは、異数性半数体補1,2,3,4の倍数ではない染色体数によって特徴付けられる条件に します。異数性染色体ゲノム不安定性5,が生成されますさらにトリガーのレプリケーション ストレス6,7,8,9,10増加核型の複雑さ、および最終的に細胞10個体の細胞周期の停止につながる。ここで紹介した方法の目的を生成し細胞をサイクリングからこのような個体を分離です。安価な培養技術を採用し、このプロトコル分離と複雑な染色体の異数性細胞の細胞周期逮捕の評価が容易になります。これらの細胞は、ArCK (複雑核型で逮捕) セルおよびコントロールとしてサイクリング欠の相手として呼ばれます。
このプロトコルは、この目的のために確立される最初の 1 つを分離することができ、さらなる研究の ArCK 線を含む、彼らの誘導老化と老化関連の分泌形質 (SASP) に限定されない、プロ炎症機能、および能力を免疫細胞に関与します。ここで紹介した方法未変換、不死化ひと細胞で開発されていますが、がんでまだテストされていません。いくつかの変換されたセルが 1 つまたは複数の経路の抑制による細胞周期の停止に敏感である可能性があります。さらにしたがって、他の細胞では検証を実行する必要があります。

<table><tbody><tr><td>DMEM(ダルベッコs モディファイド イーグル ミディアム)&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>チミジン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>T1859</td><td></td></tr><tr><td>リバーシン</td><td>ケイマン ケミカル カンパニー</td><td>10004412</td><td></td></tr><tr><td>ノコダゾール</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>M1410</td><td></td></tr><tr><td>アンチ p53 抗体</td><td>サンタ クルス</td><td>sc-126</td><td></td></tr><tr><td>抗 p21 抗体</td><td>サンタ クルス</td><td>sc-6246</td><td></td></tr><tr><td>アンチ p16抗体</td><td>BD</td><td>554079</td><td></td></tr><tr><td>老化b-ガラクトシダーゼ染色キット</td><td>Cell Signaling Technology&nbsp;</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>プロテオームプロファイラーヒトサイトカインアレイキット&nbsp;</td><td>R&Dシステム</td><td>ズARY005B</td><td></td></tr></tbody></table>

世代と複雑な染色体と細胞周期逮捕細胞の分離

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

染色体の誤った分離は、異数性、細胞が不均衡な染色体数を港を条件に します。証拠の複数のラインは強くその異数性をゲノムの不安定性は、最終的に彼らの増殖を阻止する複雑な染色体を持つ細胞を生成するトリガーを示します。細胞の複雑な染色体の分離と性状、細胞生理学的不均衡な染色体数の影響を検討することが重要です。日には、手法が確立されてないような構成する細胞を確実に分離します。このペーパーでは、標準の安価な培養技術を利用した複雑な染色体の濃縮と異数性細胞の解析のためのプロトコルを提供します。このプロトコルは、その誘導分泌老化関連の表現、プロ炎症性のプロパティ、および免疫細胞と対話する能力を含む複雑な染色体を構成する細胞のいくつかの機能を分析する使用することができます。がん細胞は、染色体数の不均衡をしばしば港、異数性が両方のプロと反 tumorigenic 効果を暴くの究極の目標と、正常細胞の細胞生理に及ぼす影響について解読することが重要です。

このメソッドは、彼らの増殖を阻止する複雑な染色体を構成する細胞を分離するための in vitro培養システムを利用しています。この人口は、ArCK (逮捕された複雑な染色体で) 細胞と呼ばれます。図 1 aは、実験の方法を示します。野生型サイクリング RPE 1 テロメラーゼ細胞チミジンと G1/S の国境で、同期化、染色体の誤った分離を誘発する Mps1 阻害剤と扱われます。スピンドルの毒ノコダゾールは、染色体の誤った分離の誘導後 72 時間のセルに追加されます。異数性の細胞増殖するまだことができるノコダゾール治療後 12 時間は有糸分裂を入力し、微小管重合の干渉のためには、この細胞周期段階に閉じ込められています。閉じ込められたこれらのセルが穏やかな振り払いによって簡単に削除されます。振り払いプロセスは繰り返し 3 - 5 回、サイクリング細胞を完全に除去です。図 1 bは、治療の各段階での RPE 細胞の代表的なイメージを示しています。
ArCK 細胞は、p53、p21、図 2 aに示すように、欠と異数性細胞をサイクリングに比べて p16 などの細胞周期阻害剤の増加されたレベルを表示します。また、図 2 bは、肯定的な β-ガラクトシダーゼ染色 ArCK 欠細胞と比較して細胞の細胞老化の十分に確立されたマーカーを示します。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig2.jpg"> 図 2: ArCK 細胞を利用した代表的な結果。((A))の西部のしみ欠、サイクリング、異数性、ArCK 細胞の細胞周期阻害剤レベルを評価します。P53、p21、p16 のレベルは、西部のしみの分析により決定しました。アクチンはローディング コントロールとして提供しています。(B) β-ガラクトシダーゼ染色 ArCK 細胞老化のレベルを評価します。欠細胞と ArCK 細胞老化関連 β ガラクトシダーゼ (β Gal) 活動を求めた。スケール バー 100 μ m.<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
この細胞周期の停止は、ランダム染色体の利得そして損失で図 3ArCK セルが複数表示されるシーケンスの単一セルから代表的な核型分析によって示されている複雑な染色体を構成する細胞の顕著な特徴です。この発見は、以前のレポート10との完全な合意です。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig3.jpg"> 図 3: ArCK 細胞の代表的な単一セル配列。セグメンテーションは、六つの代表的な ArCK 細胞の核型を示すプロットされます。セグメント化プロットは、(RPE 1 野生型は女性の出自の 2 倍体細胞ライン) ログ2規模で欠基準 X に 1 からすべての染色体のコピー数が表示されます。染色体の利益は、緑色で、赤の染色体損失でハイライトされます。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

異数性は、ゲノムの不安定性、複雑な染色体を持つ細胞を細胞周期逮捕を最終的に生成に します。このペーパーでは、複雑な染色体を分割するために停止を構成する細胞を分離する簡単で便利な方法を提供します。

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

このプロトコルの全体的な目標は、複雑な核型を持つ細胞周期停止細胞を生成および単離する簡単な方法を提供することです。この方法は、免疫系と異数性細胞との相互作用など、異数性研究の分野における重要な疑問に対する答えを提供することができます。この手法の主な利点は、複雑な核型のみを持つ細胞集団を生成することです。RPE-1 hTERT細胞の同期を開始するには、解凍したばかりの細胞を使用し、8ミリリットルの標準増殖培地を使用して10cmの組織培養皿に分注します。次に、血球計算盤を使用して細胞番号を決定します。その後、細胞を一晩インキュベートします。翌日、標準的な増殖培地を5ミリモルのチミジンを含む培地と交換します。摂氏37度で24時間インキュベートし、G1S境界で細胞を同期させます。24時間後、PBSで細胞を3回洗浄します。次に、洗浄した細胞に標準的な増殖培地を加え、摂氏37度で6時間インキュベートします。まず、細胞を10ミリリットルのPBSで洗浄します。次に、500ナノモルのMps1阻害剤リバーシンを含む培地を追加します。摂氏37度で12時間インキュベートします。翌日、PBSで細胞を3回洗浄します。次に、標準的な増殖培地を添加し、プレートをインキュベーターに戻します。最初の異常な有糸分裂から約72時間後、10ミリリットルのPBSで細胞を洗浄します。次に、330ナノモルのノコダゾールを含む培地を追加します。摂氏37度で12時間インキュベートします。翌日、ノコダゾール培地を吸引します。次に、3ミリリットルのPBSを皿に加え、プレートの側面を軽くたたいて有糸分裂細胞を振り落とします。各タップ間でプレートを回転させて、有糸分裂細胞を均一に除去できるようにします。最初のシェイクオフ後、プレートの蓋と端に付着した液体を吸引します。次に、顕微鏡でプレートを10倍の倍率で確認します。次に、細胞を5ミリリットルのPBSで洗浄します。次に、330ナノモルのノコダゾールを含む培地を追加します。摂氏37度で12時間インキュベートします。最後のシェイクオフ後、10ミリリットルの標準成長培地を追加します。アッセイを行う前に、細胞を摂氏37度で12〜24時間インキュベートします。プレート上に残った細胞は、複合核型細胞またはArCK細胞でアレストされたと呼ばれます。このプロトコルは、ArCK細胞を単離する簡単な方法を説明しており、ArCK細胞に特有のいくつかの機能を解析して、その単離を確認します。イムノブロット解析では、ArCK細胞は細胞周期阻害剤p53、p21、およびp16のレベルの増加を示しますが、正倍数体および異数性循環細胞はそうではありません。さらに、ArCK細胞は老化関連β-ガラクトシダーゼ陽性であり、これは青緑色に染色されますが、正倍数体制御細胞は陽性ではありません。セグメンテーションプロットは、ArCK細胞が異数体であり、複数のランダムな染色体増加と染色体損失を特徴とすることを示しています。セグメンテーションプロットは、1番染色体からX番染色体までの単一細胞のコピー数を、正倍数体参照対数2スケールと比較して示します。この手順を試みるときは、シェイクオフのたびにすべての有糸分裂細胞を必ず除去することが重要です。この手順を行った後、サイトカインアッセイなどの他の方法を実施することができる。これらのアッセイは、ArCK細胞が免疫系の細胞と相互作用する能力など、追加の疑問に答えるのに役立ちます。ノコダゾールは危険であることを忘れないでください。この試薬を使用する間は、適切な個人用保護具を着用する必要があります。この技術を習得すると、in vitroでArCK細胞を効率的に単離するために使用できます。この手順は、適切に実行すれば7日で完了します。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

核型分析は、広く遺伝子変異を検出するために使用されるシンプルかつ有用な技術である。ここでは、文化の中で維持、これらの細胞の染色体の状態を監視するためのヒト胚性幹細胞の染色体の広がりの準備のためのステップのプロトコルバイステップで説明します。...

染色体分析のためのヒト胚性幹細胞の染色体スプレッドの準備

ミクロ解剖植技術は、骨格筋幹細胞のソースとして、若年成人や胚の筋肉から増殖性骨格筋細胞を単離するための堅牢で信頼性の高い方法です。一意に、これらの細胞は、クローン的に生体移植のために使用される骨格筋幹細胞株を生成するために導出されている。...

大人と胚骨格筋のMicroexplantの文化と骨格筋幹細胞の単離

細胞集団の細胞周期の位置を決定する、または信号が増殖にどのような影響を与えるか理解する、容易にこのプロトコルを使用してフローサイトメトリーによって測定することができる。我々は、細胞を染色し、細胞周期内の位置を定量化するための簡単​​な実験的なアプローチを報告する。...

哺乳動物細胞における細胞周期の位置の解析

細胞周期ステージの進行と動態の追跡微妙な変化は、BrdUとヨウ化プロピジウムを経由して全ゲノムDNAを染色した核酸の代謝標識の組み合わせの使用によって達成することができます。このメソッドは、それによって順番に細胞周期の進行に影響を及ぼす非特異的DNA損傷の導入を防止し、サイクリング細胞の化学物質の同期の必要がなくなります。...

代謝標識とフローサイトメトリーで細胞周期の進行速度を測定

染色体は、例えば、リンパ球または皮膚線維芽細胞等の生細胞から、ヒトまたはマウスを含む生物から単離することができる。これらの染色体調製物は、さらに、ルーチンG-バンディングなどsituハイブリダイゼーション （FISH）、 蛍光 、比較ゲノムハイブリダイゼーション（CGH）、スペクトル核型分析（SKY）のような分子細胞遺伝学手順のために利用することができる。...

培養細胞からの染色体の準備

倍数体細胞の染色体不安定性を分析するためには増殖性倍数体細胞が必要ですが、そのような細胞を形質転換されていないヒト細胞から作成することは容易ではありません。本報告は、正常なヒト線維芽細胞からの二倍体集団を含まない増殖性四倍体細胞を確立するための比較的簡単な手順を述べている。...

非形質転換ヒト線維芽細胞から増殖性四倍体細胞の樹立

我々は、細胞周期の特定の段階に関連する事象を研究するための状況を提供する2つの細胞同期プロトコールを報告する。我々は、このアプローチが、摂動のない細胞周期または細胞周期に影響を及ぼす薬剤への暴露で特定の遺伝子の調節を分析するのに有用であることを示す。...

2つの相補的細胞同期プロトコルによる細胞周期制御遺伝子発現の研究

このプロトコルでは、異なる細胞周期の段階に主な急性リンパ芽球性白血病細胞を分離する遠心浄化の使用について説明します。...

遠心浄化によって異なった細胞周期の段階で主に急性リンパ性白血病細胞の調製

高分解能共焦点顕微鏡を用いた解析に続いて HeLa 細胞の二重チミジン同期するためのプロトコルを提案します。このメソッドは、多数の有糸分裂、また界面機能を有する多機能性蛋白質の細胞分裂の役割の解明を可能にする S...

有糸分裂の多機能の細胞周期蛋白質の役割を研究する有糸分裂細胞同期と高分解能共焦点顕微鏡を組み合わせた

このプロトコルでは、ラベルおよび Histone2B GFP BacMam 2.0...

細胞分裂時の染色体分配の生きているセルイメージ投射

このプロトコルは、酵母細胞周期停止とオプションの放出の2つの方法を詳述し、 S.

出芽酵母における細胞周期依存過程の操作と解析

学ぶ細胞周期停止した複雑な染色体を持つArCK細胞の分離法。RPE-1 hTERT細胞を用いたシェイクオフ技術で、免疫系との相互作用研究に有用な細胞集団を効率的に得る方法です。

世代と複雑な染色体と細胞周期逮捕細胞の分離

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