Name: 腹膜由来マスト細胞とその機能特性と Ca2 +の単離-イメージングと脱顆粒の試金 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 学ぶマスト細胞の単離培養法とCa²⁺イメージング、脱顆粒アッセイによる機能解析。マウス腹腔由来細胞を用いた免疫応答研究に有用な手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者は、肥満細胞作製、培養での技術支援のジュリア Geminn を認識したいと思います。この作品は、イ共同研究センター (TR SFB) 152 によって支えられました。

<ol><li>Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+mast+cells%3A+negative%2C+as+well+as+positive%2C+regulators+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity.</a> Nat Rev Immunol. 8 (6), 478-486 (2008).</li>
<li>Feyerabend, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-mediated+cell+ablation+contests+mast+cell+contribution+in+models+of+antibody-+and+T+cell-mediated+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cre-mediated cell ablation contests mast cell contribution in models of antibody- and T cell-mediated autoimmunity.</a> Immunity. 35 (5), 832-844 (2011).</li>
<li>Razin, E., Cordon-Cardo, C., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+a+pure+population+of+mouse+mast+cells+in+vitro+with+conditioned+medium+derived+from+concanavalin+A-stimulated+splenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Growth of a pure population of mouse mast cells in vitro with conditioned medium derived from concanavalin A-stimulated splenocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (4), 2559-2561 (1981).</li>
<li>Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7508174">The kit ligand, stem cell factor.</a> Adv Immunol. 55, 1-96 (1994).</li>
<li>Galli, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells+as+%22tunable%22+effector+and+immunoregulatory+cells%3A+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mast cells as "tunable" effector and immunoregulatory cells: recent advances.</a> Annu Rev Immunol. 23, 749-786 (2005).</li>
<li>Ma, H. T., Beaven, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+of+Ca%282%2B%29+signaling+in+mast+cells%3A+Potential+targets+for+treatment+of+mast+cell-related+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulators of Ca(2+) signaling in mast cells: Potential targets for treatment of mast cell-related diseases.</a> Adv Exp Med Biol. 716, 62-90 (2011).</li>
<li>Vig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+mast+cell+effector+functions+in+mice+lacking+the+CRACM1+pore+subunit+of+store-operated+calcium+release-activated+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Defective mast cell effector functions in mice lacking the CRACM1 pore subunit of store-operated calcium release-activated calcium channels.</a> Nat Immunol. 9 (1), 89-96 (2008).</li>
<li>Freichel, M., Almering, J., Tsvilovskyy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+TRP+proteins+in+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of TRP proteins in mast cells.</a> Front Immunol. 3, 150(2014).</li>
<li>Scholten, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell-specific+Cre%2FloxP-mediated+recombination+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Mast cell-specific Cre/loxP-mediated recombination in vivo.</a> Transgenic Res. 17 (2), 307-315 (2008).</li>
<li>Malbec, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peritoneal+cell-derived+mast+cells%3A+An+in+vitro+model+of+mature+serosal-type+mouse+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Peritoneal cell-derived mast cells: An in vitro model of mature serosal-type mouse mast cells.</a> J Immunol. 178 (10), 6465-6475 (2007).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3838314">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li>
<li>Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+release+of+beta-hexosaminidase+and+beta-glucuronidase+from+purified+rat+serosal+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunologic release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast cells.</a> J Immunol. 123 (4), 1445-1450 (1979).</li>
<li>Schafer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell+anaphylatoxin+receptor+expression+can+enhance+IgE-dependent+skin+inflammation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice.</a> J Allergy Clin Immunol. 131 (2), 541-549 (2013).</li>
<li>Maurer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells+promote+homeostasis+by+limiting+endothelin-1-induced+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mast cells promote homeostasis by limiting endothelin-1-induced toxicity.</a> Nature. 432 (7016), 512-516 (2004).</li>
<li>Maurer, M., Church, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+skin+responses+induced+by+icatibant+injection+are+mast+cell+mediated+and+attenuated+by+H%281%29-antihistamines%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Inflammatory skin responses induced by icatibant injection are mast cell mediated and attenuated by H(1)-antihistamines.</a> Exp Dermatol. 21 (1), 154-155 (2012).</li>
<li>McNeil, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mast-cell-specific+receptor+crucial+for+pseudo-allergic+drug+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions.</a> Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).</li>
<li>Gaudenzio, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+activation+signals+induce+distinct+mast+cell+degranulation+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies.</a> J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).</li>
<li>Solis-Lopez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+TRPV+channel+activation+by+stimulation+of+FCepsilonRI+and+MRGPR+receptors+in+mouse+peritoneal+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of TRPV channel activation by stimulation of FCepsilonRI and MRGPR receptors in mouse peritoneal mast cells.</a> PLoS One. 12 (2), 0171366(2017).</li>
<li>Enerback, L., Svensson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rat+peritoneal+mast+cells+by+centrifugation+on+density+gradients+of+Percoll%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of rat peritoneal mast cells by centrifugation on density gradients of Percoll.</a> J Immunol Methods. 39 (1-2), 135-145 (1980).</li>
<li>Bird, G. S., DeHaven, W. I., Smyth, J. T., Putney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+store-operated+calcium+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying store-operated calcium entry.</a> Methods. 46 (3), 204-212 (2008).</li>
<li>Aronson, N. N., Kuranda, M. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2531691">Lysosomal degradation of Asn-linked glycoproteins.</a> FASEB J. 3 (14), 2615-2622 (1989).</li>
<li>Moon, T. C., Befus, A. D., Kulka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell+mediators%3A+their+differential+release+and+the+secretory+pathways+involved%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mast cell mediators: their differential release and the secretory pathways involved.</a> Front Immunol. 5, 569(2014).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

MC モデルは、三菱商事の脱顆粒、走化性、接着、同様 MC 活性化に関与する細胞内のシグナル伝達経路を解明する研究を正常に使用できます。臍帯由来不死化線 (LAD2 および HMC1) など人間の MCs 使用人間 MCs のモデルいくつかの研究者は血 (CD133 陽性) 前駆細胞と末梢血前駆細胞 (CD34 陽性)。他の齧歯動物の不死化など、MC のモデル (ラット好塩基性白血病 RBL-2 H 3 MC ライン) またはプライマリ培養を好む (マウス骨髄由来 MCs BMMCs、Pmc) モデル。マウスのプライマリ MCs は、特定の遺伝子の符号化された蛋白質の生理機能の探索に金標準的なアプローチは、多数の「ノックアウト」マウス モデルで MC 関数を分析する使用できます。十分な選択性と効力の薬理学的ツールの赤字は、MC 活性化18によるシグナル伝達のメカニズムの調査のため特に貴重なメソッドをなります。Pmc のマウス、成熟した形態と高粒度を示す結合組織表現型です。彼らはのみ BMMCs のような受容の抗原の架橋にも応答しないが、複合 48 エンドセリン 1 などいくつか追加の受容体...

MCs は、自然免疫と獲得免疫の間に顕著な役割を果たします。具体的には、MCs は細菌や寄生虫などの病原体の殺害に参加し、潜在的に有毒の内因性ペプチドや毒 (レビュー ガリら20081を参照) のためのコンポーネントも低下します。自然免疫と適応免疫の MCs の生理的役割激論の主題であります。したがって、異なる MC 欠損マウス モデルで実施された試験で多数のデータの不一致アレルギー2MCs の免疫学的機能の体系的な再評価が必要です。成熟した MCs は、大抵集中する組織や皮膚、肺、腸などの臓器で、通常血に小さな数字でのみ発見します。MCs は MC 前駆細胞などの造血前駆細胞に由来し、分化と成熟、微小でほぼすべての血管柄付きの組織1を完了します。T 細胞由来因子インターロイキン (IL)-3 は選択的にその造血前駆細胞3からの生存・増殖・分化多能性人口マウス MCs を促進します。幹細胞因子 (SCF) は、組織の構造細胞によって生成され、MC 開発、生存、移行、および関数4の重要な役割を果たしています。個々 の MCs の特性を合成して様々 なプロテアーゼやプロテオグリカンを格納する能力によって異なります。マウス、いわゆる結合組織型 MCs は解剖学的局在、形態、およびヘパリンおよびプロテアーゼの5の内容に従って粘膜 MCs と区別されます。
MCs の増加は無料のゾル性細胞質 Ca2 + ([Ca2 +]私) が脱顆粒とエイコサノイドの生産のためだけでなく、サイトカインの合成と抗原に対する応答における転写因子の活性化は不可欠ですし、様々 な分泌刺激6。これらの刺激の主要な下流ターゲットはジアシルグリセ ロール (DAG) とイノシトール 1,4,5 三リン酸ホスファチジルイノシトール 4, 5-ビスリン酸を加水分解するホスホリパーゼ C、です。DAG はプロテインキナーゼ C を活性化し、IP3 は、Ca2 +小胞体からのイオンを解放します。これらの店の枯渇は、原形質膜 Ca2 +チャネル作動させたカルシウム エントリ (SOCE) を格納するリードを介する Ca2 +流入をアクティブにします。このプロセスは Ca2 +との相互作用を誘発-センサー、一過性受容体電位標準 (TRPC) チャネルの活性化を介してだけでなく、Orai17と小胞体で間質相互作用分子-1 (Stim1)(レビューを参照してください Freichelらのタンパク質20148) 血しょう膜の。
勉強するには、いくつかの薬理学的これらのチャネルの生理的役割、(チャンネル遮断薬の適用) または遺伝的アプローチは通常使用されます。後者の場合、タンパク質発現の抑制がターゲット mRNA (ノックダウン) によって達成されるゲノム DNA が細孔の形成 (ノックアウト) チャネルのサブユニットをコードするエクソンのグローバルまたは組織固有の9削除と編集。これらのチャンネルに十分な特異的なブロッカーの可用性は制限されています。さらに、ノックダウンの方法は、例を使用して、その有効性の注意深い制御を必要があります。 西部、ブロット分析、および多くの場合対象となるチャネル蛋白質のための特定の抗体の使用不能によって妨げられています。したがって、ノックアウト マウス モデルの使用は、そのような分析のためのゴールド スタンダードとしてみなされます。MC の機能の調査のため最寄りの in vitroモデルは分離前のヴィヴォ完全に成熟した個体としては、Pmc の栽培 (MCs体外、例えばから差別化ではなく、骨髄細胞)10。.MC 関数体外受容と β ヘキソアミダーゼの刺激を研究にも使われている骨髄由来 MCs (BMMCs) に比べてリリース 8 倍と 100 倍に増資 Pmc、それぞれ。この記事では、純粋な結合組織の数が多いを培養 2 週間タイプ MCs、さらなる分析のための十分な後に取得することができますマウス Pmc の培養と分離のメソッドについて説明します。
開発及び遺伝的コード化カルシウム指標の適用の最近の進歩にもかかわらず、使用状況限られている標的細胞に遺伝子の配信の難しさによって具体的には、一次培養 MCs など専門性の高い細胞。さらに、[Ca2 +]私の測定のための蛍光プローブのこのグループには、レシオ メトリック染料と高ダイナミック レンジまだ欠けています。これらの理由から、最寄りレシオ メトリック [Ca2 +]私の測定法はまだ蛍光染料「Fura 2」11の使用です。
現在、MC 活性化の評価のために最も一般的に使用されるアプローチと脱顆粒が β-ヘキソアミダーゼ活性の測定。Β-ヘキソアミダーゼ、アレルギーの調停は、MCs12から一定の割合でヒスタミンが分泌される MC 顆粒コンポーネントの 1 つです。Β-ヘキソアミダーゼは、マイクロ プレートの比色定量法で容易に検出できるが colorigenic 製品の測定可能な量を生成する特定の基質との反応によって容易にかつ正確に測定できます。この資料では、この様々 な刺激への応答で Pmc の脱顆粒の解析手法の応用が報告されます。
高親和性の原形質膜 IgE 受容体 (FcɛRI) の集計は MCs の分泌顆粒周囲の細胞外領域のコンテンツのリリースにつながる多彩な細胞内シグナル伝達経路をアクティブにします。特異抗原に加えて、他の多くの刺激は免疫調節メディエーター、補体によりなどの多様な配列を解放する MCs をアクティブ化できます (e.g、C3a と C5a)13、血管収縮ペプチド エンドセリン 1 (ET1)14。、数々 のカチオン性物質と pseudoallergic 反応の刺激薬として (e.g。、icatibant)15 MRGPRX216へのバインド。MRGPR 誘起 MCs 脱顆粒反応に関与する細胞内シグナル伝達経路の FcɛRI を介した細胞内シグナル伝達; と比較して特徴は不十分これらの経路は、受容体同定16後最後の数年間17の間に集中的に調査される開始。主として、カルシウム項目の後に MRGPRX2 刺激に関与する細胞膜のイオン チャネルは、理解されるに残る。したがって、本稿はまた細胞内カルシウム シグナルに焦点を当て、MRGPR アゴニストと MCs の脱顆粒が刺激されます。

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Medium Thermo Scientific</td><td>21875034</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Thermo Scientific</td><td>R92157</td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>R&D Systems</td><td>403-ML</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>Thermo Scientific</td><td>PMC2115</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2272</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>F1221</td><td></td></tr>プル<tr><td>ロニックF-127</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>DNP-HSA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6661</td><td></td></tr><tr><td>抗DNP抗体&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>D-8406</td><td></td></tr><tr><td>ペンストレップ</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>コンパウンド 48/80&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2313</td><td></td></tr><tr><td>4-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェニル-ポリエチレングリコール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>4-ニトロフェニル 2-アセトアミド-2-デオキシ-&β;-D-グルコピラノシド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N9376</td><td></td></tr><tr><td>CoverWell イメージングチャンバー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GBL635051</td><td></td></tr><tr><td>96-ウェルプレート、V字型底部&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3896</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート、平底</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>マイクロタイタープレートリーダー、i-controlソフトウェア付き&nbsp;</td><td>Tecan</td><td>Nano Quant, infinite M200 Pro</td><td></td></tr><tr><td>フラットボトムプレート&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>イオノマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9657</td><td></td></tr><tr><td>50 mL プラスチック遠心分離管</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>培養フラスコ (25 cm)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>69160</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips glasses round; &oslash; 25 mm;No. 1</td><td>Menzel</td><td>CB00250RA1</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>VWR</td><td>631-0696</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>オブザーバー Z1</td><td></td></tr><tr><td>Objectiv Fluar 40x/1.3 オイル</td><td>ツァイス</td><td>440260-9900</td><td></td></tr><tr><td>HC フィルターセット フラ 2&nbsp;</td><td>AHF</td><td>H76-521</td><td></td></tr><tr><td>CCDカメラ</td><td>ツァイス</td><td>AxioCam MRm&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>単色光源</td><td>サッター機器</td><td>ラムダ DG-4</td><td></td></tr><tr><td>イメージング取得プログラム</td><td>Zeiss</td><td>AxioVision 4.8.2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>重力供給溶液アプリケーションシステム</td><td>カスタムメイド</td><td>4チャンネル</td><td></td></tr><tr><td>15 mL プラスチック遠心分離管</td><td>Sarstedt</td><td>62,554,502</td><td></td></tr><tr><td>ベンチ遠心分離機</td><td>Heraeus</td><td>Megafuge 1.0R</td><td></td></tr></tbody></table>

腹膜由来マスト細胞とその機能特性と ca2 +の単離-イメージングと脱顆粒の試金

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

肥満細胞 (MCs)、免疫システムの一部としていくつかの病原体に対するホストを守るために、アレルギーの免疫応答の開始に重要な役割を再生します。MCs の高親和性 IgE 受容体 (受容) だけでなく、他のいくつかの受容体の刺激による IgE がバインドされた表面のクロスリンクすることにより活性化無料の細胞内 Ca2 +濃度の上昇が開始されます ([Ca2 +]私)アレルギー炎症性メディエーターの放出を促進します。これらのシグナル伝達経路に関与する分子の同定は、MC の機能制御を理解するため重要です。この記事で腹膜 MCs (Pmc) のマウスの結合組織型腹膜灌流による MCs の分離と培養のためのプロトコルについて述べる。この方法による様々 なノックアウト マウス モデルから MCs の文化は、MC シグナル伝達経路に関与するタンパク質の同定に有用なアプローチを表しています。また、Ca2 +シグナル MCs。 蛍光ベース監視の [Ca2 +]私の定量化のための重要な技術は信頼性の高い単一セル Fura 2 するイメージングのためのプロトコルについても説明し、よくするアプローチを使用Ca2 +シグナル イベント、MC の活性化にとって重要であるストア作動性カルシウム エントリを含むを研究します。MC 脱顆粒の解析、β ヘキソアミダーゼ リリース アッセイをについて説明します。MCs β-ヘキソアミダーゼで説明されているすべての 3 つ異なる分泌のサブセットの脱顆粒マーカーはで colorigenic 基板との反応によって容易に定量化ことができますはとしての β-ヘキソアミダーゼの培養液中に放出される量を。マイクロタイター プレートの比色定量法。この再現性の高い技術、コスト効果の高い特殊な装置は必要ありません。指定されたプロトコルが高収率を示します全体的にみて、典型的な MC の表面マーカーを表現する MCs の MCs の典型的な形態および表現型特徴を表示して、Ca2 +- のところ再現性の高いレスポンスを発揮イメージングおよび脱顆粒の試金。

Pmc は腹腔内洗浄によって 3 の野生型マウス (C57BL/6 n) から隔離され RPMI 培でさらに培養 1% と 20% の FCS 滅菌下で成長因子 (IL-3 10 ng/ml) と 30 ng/mL で SCF の存在下でペン球菌加湿条件37 ° C と 5% の CO2。媒体は、細胞分離後 2 と 9 の日に変更されました。細胞の形態は、伝送を用いて解析した DIC イメージングの光 (図 1A, Bを参照)。セルのコントラストと粒度は、良い細胞生存率を示した。これらの条件の下で培養 2 週間後 1.5 倍の 10 の7セルの同質な人口を求めた。共同と FITC 標識抗 IgE 抗体で染色細胞と PE と抱合抗 C-kit 抗体の流れフローサイトメトリー解析では、FITC 陽性と 99.8 %pe 陽性細胞 (図 1C) の ...

ここでは、分離し、マウスの腹腔肥胖細胞を養うプロトコルを提案します。2 つのプロトコルの機能特性評価についても述べる: リリースされた β-ヘキソアミダーゼの比色定量に基づく細胞内 Ca2 +濃度を無料と脱顆粒試験の蛍光イメージング。

腹膜由来マスト細胞とその機能特性と Ca2 +の単離-イメージングと脱顆粒の試金

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

これらの方法は、免疫細胞の活性化やメディエーターの放出にどのイオンチャネルが重要であるかなど、興奮性細胞の細胞内シグナル伝達の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。これらの技術の主な利点は、比較的単純であることと、多数の細胞を同時に分析できることです。肥満細胞におけるFura-2カルシウムイメージングのデモンストレーションを行うのは、私の研究室の大学院生であるKathrin Ohlenschlagerです。この手順を開始するには、安楽死させたマウスに70%エタノールをスプレーし、ピンを使用して背側を下にしてフォームブロックに固定します。鈍い刃のはさみを使用して、マウスの腹部の上の皮膚を取り除き、腹膜腔を損傷しないようにします。次に、27ゲージの針を腹膜に慎重に挿入することにより、7ミリリットルの氷冷RPMI培地を腹腔に注入します。臓器に穴を開けず、精巣上体脂肪の領域のスポットを使用して臓器穿孔のリスクを減らします。注射後、マウスを1分間振とうして、腹膜細胞をRMPI培地に剥離します。内臓の損傷や腹腔の血液汚染を避けるために、マウスを強く振らないでください。次に、シリンジに新しい20ゲージカニューレを装備して再利用します。フォームブロックを傾け、ベンチで軽くたたいて内側の臓器を片側にずらし、反対側から中程度の吸引を容易にします。その後、20ゲージの針を斜めに挿入して、腹部から体液を穏やかかつゆっくりと吸引し、内臓による詰まりを防ぎます。できるだけ多くの水分を集めます。次に、シリンジから針を取り出し、採取した細胞懸濁液を氷上の採取チューブに移します。目に見える血液汚染がある場合は、サンプルチューブを廃棄してください。クリーンセル懸濁液でチューブを300 gで5分間遠心分離します。滅菌フードの下で、上清を吸引します。サンプルペレットを冷たいPMC培地に再懸濁し、細胞懸濁液を25平方センチメートルの細胞培養フラスコに移します。続いて、成長因子IL-3およびSCFを、それぞれ10ナノグラム/ミリリットルおよび30ナノグラム/ミリリットルの最終濃度に加える。次の手順まで、細胞を摂氏37度で約48時間インキュベートします。12日目から15日目に、形質哺乳類IgE受容体の刺激実験が計画されている場合は、標準的な培地で1ミリリットルあたり300ナノグラムのIgE抗DNPで細胞を一晩前処理します。Fura-2イメージングを調製するには、ローディングバッファーを調製するために、カルシウムHBSS中のFura-2、AMストック溶液を最終濃度5マイクロモルに希釈します。次に、500マイクロリットルのローディングバッファーを500マイクロリットルのPMC細胞懸濁液と混合します。混合物をイメージングチャンバーにピペットで移し、暗所で室温で20〜30分間細胞をインキュベートします。重力供給アプリケーションシステムは、刺激プロトコルに応じて異なるソリューションでセットアップします。次に、倒立顕微鏡のステージにアプリケーションシステムを取り付けます。40倍高開口油浸対物レンズに少量の液浸油を垂らして準備します。ロードされたセルを備えたイメージングチャンバーをアプリケーションシステムに配置し、記録中の動きを防ぐために固定します。次に、透過光をオンにし、セルに焦点を合わせます。その後、Physiological Acquisitionモードでイメージング取得プログラムを開始します。セットアップウィンドウを開き、フォーカスと最適な取得時間を調整します。参照画像を画像化し、セルをROIとしてマークします。セルが存在しない領域の最後の ROI をマークし、それを背景として定義します。その後、セットアップを完了し、5秒の集録レートで測定を開始します。次に、実験計画に従って適切なサイクル番号で溶液を追加します。抗原誘発性細胞内カルシウム濃度の上昇を測定するには、サイクル20の後にシリンジ-2溶液を適用し、サイクル150の後に記録を停止します。化合物48/80による細胞内カルシウム濃度の上昇を測定するには、サイクル20の後にシリンジ-3溶液を適用し、サイクル150の後に記録を停止します。SOCEによって誘発される細胞内カルシウム濃度の上昇を測定するには、サイクル10の後にシリンジ4溶液を適用し、サイクル70の後にシリンジ5溶液を適用し、サイクル120の後にシリンジ4溶液を適用し、サイクル150の後にシリンジ1溶液を適用し、サイクル220の後に記録を停止します。取得プログラムで、[カッターの開始]、[すべてマーク]、[すべて変換]、[生理学的測定]、[OK]、次に[OK]ボタンを連続して押します。ファイルをテーブルおよびイメージスタックとして保存し、オフラインで分析します。β-ヘキソサミニダーゼの放出を測定するには、ウェルあたり100マイクロリットルの細胞懸濁液を96ウェルのVボトムウェルプレートに移します。各ウェルに25マイクロリットルの刺激溶液または制御溶液を加えます。その後、細胞を摂氏37度で45分間インキュベートします。その後、96ウェルプレートを氷上に5分間置いて反応を停止します。次に、プレートを摂氏4度で120gで4分間遠心分離します。上清120マイクロリットルを平底の96ウェルプレートに移し、氷の上に置きます。細胞ペレットに触れないように注意しながら、上清を完全に吸引します。次に、125マイクロリットルの溶解緩衝液を細胞ペレットに加えます。細胞ペレットを室温で5分間インキュベートし、インキュベーション後にピペッティングを繰り返して再懸濁します。新しい平底96ウェルプレートの必要なウェルに4ミリモルpNAG溶液の25マイクロリットルをピペットで移します。調製したpNAG溶液に、各上清25マイクロリットルと各細胞溶解液25マイクロリットルを別々に加えます。反応バッチを摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、各ウェルに150マイクロリットルの停止溶液をピペットで注入して反応を停止させます。次に、マイクロプレートリーダーでプレートサンプルの光吸光度を405ナノメートルで分析し、リファレンス630ナノメートルで自動バックグラウンド減算を行います。取得プログラムで、[参照]チェックボックスをオンにし、吸光度プログラム要素メニューで、自動バックグラウンド減算のために630ナノメートルを選択します。β-ヘキソサミニダーゼ放出アッセイは、形質哺乳類IgE高親和性受容体の架橋またはMrg PRB2受容体の刺激により脱顆粒を受ける単離されたPMCの能力をテストするために実施されました。細胞をV底96ウェルプレートに加え、このスキームに従って摂氏37度で45分間刺激した。遠心分離を行い、上清を除去した後、ペレットを溶解しました。次に、個々の上清およびペレット溶解物のβ-ヘキソサミニダーゼ含量を、摂氏37度での1時間のインキュベーション中のpNAGとの反応によって分析しました。反応生成物の量を比色的に検出し、放出されたβ-ヘキソサミニダーゼの割合を計算しました。自然放出は非常に低かったが、10マイクロモルのイオノマイシンや50マイクログラム/ミリリットルの化合物48/80などの強力な脱顆粒刺激に対する反応は、それぞれ40%と60%を超えていた。DNP刺激に対する脱顆粒反応は、1ミリリットルあたり10〜300ミリグラムの濃度範囲で用量依存的でした。.これらのデータをまとめると、分離されたPMCの良好な機能状態が明確に示されています。この技術を使用すると、2週間以内に腹膜由来のマウス成熟結合組織肥満細胞の高純度集団を得ることができます。この手順を試みる際には、細菌汚染を避けるために、細胞の分離と培養中に無菌状態を維持することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、肥満細胞のカルシウム侵入経路に関する追加の質問に答えるために、電気生理学的パッチクランプイオン電流測定などの他の方法を実行できます。その開発後、Fura-2細胞内カルシウムイメージング技術は、質量細胞生理学の分野の研究者が肥満細胞脱顆粒のカルシウム依存性を調査する道を開きました。このビデオを見れば、Fura-2カルシウムイメージング実験と肥満細胞を用いたβ-ヘキソサミニダーゼ脱顆粒アッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。紫外線を扱う作業は目や皮膚に危険を及ぼす可能性があるため、この手順を実行するときは不必要な曝露を避ける必要があることを忘れないでください。

isolation-peritoneum-derived-mast-cells-their-functional

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

心臓から機能的な免疫細胞を単離するためのこの方法では、これらの細胞の反応性の低下、その結果、不要な免疫細胞の活性化を引き起こすコラゲナーゼ消化、の従来の方法に代わる方法が用意されています。分離の手法は、酵素消化に関連する問題を回避することによって機能的な心臓の免疫細胞が得られます。...

機能心臓の免疫細胞の単離

このビデオでは、肥満細胞の脱顆粒活性を測定するための比色分析を実演しています。肥満細胞によって放出された酵素は、基質を加水分解し、着色された製品を生成します。肥満細胞の脱顆粒活性は、細胞外への酵素の放出率を細胞内の総酵素含有量で正規化して測定しました。...

標的化学物質の効果を研究するための肥満細胞脱顆粒アッセイ

このビデオは、成体マウスの腹腔から成熟結合組織型肥満細胞を単離するための腹膜洗浄法を示しています。初代免疫細胞の混合物を腹腔から単離すると、適切な培養条件下で肥満細胞の選択的増殖が行われます。...

マウス腹腔から初代肥満細胞を単離する技術

マスト細胞の脱顆粒、アレルギー性​​メディエーターの放出は、アレルギー、喘息、および寄生虫防御に重要です。ここでは、脱顆粒で薬や毒物の影響を評価するための技術1を実証、方法論は、最近抗菌剤トリクロサン2の強力な阻害効果を発揮するために利用。...

RBL-2H3マスト細胞脱顆粒に対する化学的影響を評価するために、マイクロプレートアッセイ：有機溶剤を使用せずに、トリクロサンの影響

本プロトコルの目的は、マスト細胞の分泌の機能的ゲノム解析を可能にする方法を開発することであった。プロトコルは、目的の遺伝子とcotrasfected蛍光レポーター遺伝子の放出を定量的に評価し、実時間に基づいて分泌顆粒の形態の分析。...

マスト細胞の分泌顆粒の調査。生からのエキソサイトーシスへ

イン ビトロ 由来肥満細胞の生成方法、肥満細胞欠損マウスへのそれらの生着、異なる解剖学的部位における生着マスト細胞の表現型、数および分布の分析について述べた。このプロトコルは、...

「マスト細胞ノックイン」マウスを用いた生体内肥満細胞の機能解析

ここでは、乳腺細胞外マトリックス (ECM) 式および膵管の形態を検討する提案全体、そのままマウスの隔離のためのプロトコル。マウス #4 腹部腺は、8-10 週齢雌未マウス、中性緩衝ホルマリンで固定、断面、ECM 蛋白質の免疫組織化学を用いたステンド...

そのままに、全体のマウス乳腺の腺の形態と細胞外マトリックス式の分析のための分離

このプロトコルの目的は、コラゲナーゼを用いて組織の酵素消化によって結腸のラミナプロプリに存在する単核細胞を単離させることである。このプロトコルは、単核細胞の効率的な単核分離を可能にし、その結果、単一細胞懸濁液を生成し、堅牢な免疫表現型に使用することができます。...

コラゲナーゼEを用いてマウスコロンからのラミナプロプリア単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞

MRGPRX2受容体を介してマスト細胞を活性化できる短いペプチドのライブラリーを生成する技術が記載されている。関連する技術は、容易で安価であり、他の細胞受容体に拡張することができる。...

工学的HEK細胞を用いたMRGPRX2を活性化するペプチドのスクリーニング

この記事は、最初の臍帯静脈からヒト内皮細胞を単離するための手順を説明した後、フロー条件下で好中球の遊出を調べるために、これらの細胞を使用する方法を示します。ガラスの光学特性を有するポリマーから作られた低容量のフローチャンバーを用いて、希少細胞集団の生細胞蛍光イメージングも可能です。...

フローの状況下で好中球移住研究におけるヒト臍帯静脈内皮細胞とそれらの使用の分離

学ぶマスト細胞の単離培養法とCa²⁺イメージング、脱顆粒アッセイによる機能解析。マウス腹腔由来細胞を用いた免疫応答研究に有用な手法です。

腹膜由来マスト細胞とその機能特性と Ca^{2 +}の単離-イメージングと脱顆粒の試金

さらに動画を探す