腹膜由来マスト細胞とその機能特性と Ca^{2 +}の単離-イメージングと脱顆粒の試金

これらの方法は、免疫細胞の活性化やメディエーターの放出にどのイオンチャネルが重要であるかなど、興奮性細胞の細胞内シグナル伝達の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。これらの技術の主な利点は、比較的単純であることと、多数の細胞を同時に分析できることです。肥満細胞におけるFura-2カルシウムイメージングのデモンストレーションを行うのは、私の研究室の大学院生であるKathrin Ohlenschlagerです。

この手順を開始するには、安楽死させたマウスに70%エタノールをスプレーし、ピンを使用して背側を下にしてフォームブロックに固定します。鈍い刃のはさみを使用して、マウスの腹部の上の皮膚を取り除き、腹膜腔を損傷しないようにします。次に、27ゲージの針を腹膜に慎重に挿入することにより、7ミリリットルの氷冷RPMI培地を腹腔に注入します。

臓器に穴を開けず、精巣上体脂肪の領域のスポットを使用して臓器穿孔のリスクを減らします。注射後、マウスを1分間振とうして、腹膜細胞をRMPI培地に剥離します。内臓の損傷や腹腔の血液汚染を避けるために、マウスを強く振らないでください。

次に、シリンジに新しい20ゲージカニューレを装備して再利用します。フォームブロックを傾け、ベンチで軽くたたいて内側の臓器を片側にずらし、反対側から中程度の吸引を容易にします。その後、20ゲージの針を斜めに挿入して、腹部から体液を穏やかかつゆっくりと吸引し、内臓による詰まりを防ぎます。

できるだけ多くの水分を集めます。次に、シリンジから針を取り出し、採取した細胞懸濁液を氷上の採取チューブに移します。目に見える血液汚染がある場合は、サンプルチューブを廃棄してください。

クリーンセル懸濁液でチューブを300 gで5分間遠心分離します。滅菌フードの下で、上清を吸引します。サンプルペレットを冷たいPMC培地に再懸濁し、細胞懸濁液を25平方センチメートルの細胞培養フラスコに移します。

続いて、成長因子IL-3およびSCFを、それぞれ10ナノグラム/ミリリットルおよび30ナノグラム/ミリリットルの最終濃度に加える。次の手順まで、細胞を摂氏37度で約48時間インキュベートします。12日目から15日目に、形質哺乳類IgE受容体の刺激実験が計画されている場合は、標準的な培地で1ミリリットルあたり300ナノグラムのIgE抗DNPで細胞を一晩前処理します。

Fura-2イメージングを調製するには、ローディングバッファーを調製するために、カルシウムHBSS中のFura-2、AMストック溶液を最終濃度5マイクロモルに希釈します。次に、500マイクロリットルのローディングバッファーを500マイクロリットルのPMC細胞懸濁液と混合します。混合物をイメージングチャンバーにピペットで移し、暗所で室温で20〜30分間細胞をインキュベー

重力供給アプリケーションシステムは、刺激プロトコルに応じて異なるソリューションでセットアップします。次に、倒立顕微鏡のステージにアプリケーションシステムを取り付けます。40倍高開口油浸対物レンズに少量の液浸油を垂らして準備します。

ロードされたセルを備えたイメージングチャンバーをアプリケーションシステムに配置し、記録中の動きを防ぐために固定します。次に、透過光をオンにし、セルに焦点を合わせます。その後、Physiological Acquisitionモードでイメージング取得プログラムを開始します。

セットアップウィンドウを開き、フォーカスと最適な取得時間を調整します。参照画像を画像化し、セルをROIとしてマークします。セルが存在しない領域の最後の ROI をマークし、それを背景として定義します。

その後、セットアップを完了し、5秒の集録レートで測定を開始します。次に、実験計画に従って適切なサイクル番号で溶液を追加します。抗原誘発性細胞内カルシウム濃度の上昇を測定するには、サイクル20の後にシリンジ-2溶液を適用し、サイクル150の後に記録を停止します。

化合物48/80による細胞内カルシウム濃度の上昇を測定するには、サイクル20の後にシリンジ-3溶液を適用し、サイクル150の後に記録を停止します。SOCEによって誘発される細胞内カルシウム濃度の上昇を測定するには、サイクル10の後にシリンジ4溶液を適用し、サイクル70の後にシリンジ5溶液を適用し、サイクル120の後にシリンジ4溶液を適用し、サイクル150の後にシリンジ1溶液を適用し、サイクル220の後に記録を停止します。取得プログラムで、[カッターの開始]、[すべてマーク]、[すべて変換]、[生理学的測定]、[OK]、次に[OK]ボタンを連続して押します。

ファイルをテーブルおよびイメージスタックとして保存し、オフラインで分析します。β-ヘキソサミニダーゼの放出を測定するには、ウェルあたり100マイクロリットルの細胞懸濁液を96ウェルのVボトムウェルプレートに移します。各ウェルに25マイクロリットルの刺激溶液または制御溶液を加えます。

その後、細胞を摂氏37度で45分間インキュベートします。その後、96ウェルプレートを氷上に5分間置いて反応を停止します。次に、プレートを摂氏4度で120gで4分間遠心分離します。

上清120マイクロリットルを平底の96ウェルプレートに移し、氷の上に置きます。細胞ペレットに触れないように注意しながら、上清を完全に吸引します。次に、125マイクロリットルの溶解緩衝液を細胞ペレットに加えます。

細胞ペレットを室温で5分間インキュベートし、インキュベーション後にピペッティングを繰り返して再懸濁します。新しい平底96ウェルプレートの必要なウェルに4ミリモルpNAG溶液の25マイクロリットルをピペットで移します。調製したpNAG溶液に、各上清25マイクロリットルと各細胞溶解液25マイクロリットルを別々に加えます。

反応バッチを摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、各ウェルに150マイクロリットルの停止溶液をピペットで注入して反応を停止させます。次に、マイクロプレートリーダーでプレートサンプルの光吸光度を405ナノメートルで分析し、リファレンス630ナノメートルで自動バックグラウンド減算を行います。

取得プログラムで、[参照]チェックボックスをオンにし、吸光度プログラム要素メニューで、自動バックグラウンド減算のために630ナノメートルを選択します。β-ヘキソサミニダーゼ放出アッセイは、形質哺乳類IgE高親和性受容体の架橋またはMrg PRB2受容体の刺激により脱顆粒を受ける単離されたPMCの能力をテストするために実施されました。細胞をV底96ウェルプレートに加え、このスキームに従って摂氏37度で45分間刺激した。

遠心分離を行い、上清を除去した後、ペレットを溶解しました。次に、個々の上清およびペレット溶解物のβ-ヘキソサミニダーゼ含量を、摂氏37度での1時間のインキュベーション中のpNAGとの反応によって分析しました。反応生成物の量を比色的に検出し、放出されたβ-ヘキソサミニダーゼの割合を計算しました。

自然放出は非常に低かったが、10マイクロモルのイオノマイシンや50マイクログラム/ミリリットルの化合物48/80などの強力な脱顆粒刺激に対する反応は、それぞれ40%と60%を超えていた。DNP刺激に対する脱顆粒反応は、1ミリリットルあたり10〜300ミリグラムの濃度範囲で用量依存的でした。.これらのデータをまとめると、分離されたPMCの良好な機能状態が明確に示されています。

この技術を使用すると、2週間以内に腹膜由来のマウス成熟結合組織肥満細胞の高純度集団を得ることができます。この手順を試みる際には、細菌汚染を避けるために、細胞の分離と培養中に無菌状態を維持することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、肥満細胞のカルシウム侵入経路に関する追加の質問に答えるために、電気生理学的パッチクランプイオン電流測定などの他の方法を実行できます。

その開発後、Fura-2細胞内カルシウムイメージング技術は、質量細胞生理学の分野の研究者が肥満細胞脱顆粒のカルシウム依存性を調査する道を開きました。このビデオを見れば、Fura-2カルシウムイメージング実験と肥満細胞を用いたβ-ヘキソサミニダーゼ脱顆粒アッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。紫外線を扱う作業は目や皮膚に危険を及ぼす可能性があるため、この手順を実行するときは不必要な曝露を避ける必要があることを忘れないでください。