オプトジェネティクスを組み合わせてそのまま神経回路内でのシナプス前機能に関する遺伝子ノックダウンの効果を特徴付ける人工マイクロ Rna

人工マイクロRNAを介したRNA干渉をオプトジェネティクスと組み合わせる全体的な目標は、無傷のニューロン回路内のシナプス前機能に対する遺伝子ノックダウンの影響を特徴づけることです。この方法は、無傷の脳回路におけるシナプス前タンパク質の生理学的役割に対処するなど、シナプス生理学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、調査中のシナプス前タンパク質の発現が低下したニューロンでシナプス伝達を選択的に監視することを可能にすることです。

また、この手法を用いて、急性脳切片のシナプス前機能を調べています。また、in vivoでのニューロンのセキュリティの操作や調査にも適用できます。その手順を実演するのは、私たちの研究室の大学院生であるCarmela Vitaleです。

マイクロRNAを設計し、マイクロRNAと光遺伝学的プローブを発現する組換えベクターを構築した後、目的の脳領域から初代ニューロン培養物を調製します。これを行うには、LA Cingolani and Companyによって確立された皮質培養プロトコルに従い、次の変更を加えます。まず、6ウェルプレートを使用し、ウェルあたり50万個のニューロンをプレート化し、ウェルあたり2.5ミリリットルの付着培地を使用します。

プレートを4時間インキュベートした後、ウェルあたり3.3ミリリットルのメンテナンス培地に切り替え、アストロサイトの異常増殖が観察された場合は、7.5マイクロモルのAraCを補充した0.5ミリリットルのメンテナンス培地を3〜4回のDIVで追加します。5〜6個のDIVで、各microRNAに対して3つのウェルを感染させてテストします。ニューロンの少なくとも99%に感染する最低感染量を使用してください。

ウイルスをニューロンに直接加え、穏やかに混合し、プレートを摂氏37度のインキュベーターに戻します。17〜18 DIVで、ニューロンを溶解してRNAを抽出します。プレートを傾け、ガラスピペットを使用して各ウェルからすべての培地を取り除きます。

次に、すぐに各ウェルに700マイクロリットルの溶解試薬を加えます。短時間の混合後、細胞ライセートを各ウェルから別々の1.5ミリリットルチューブに移します。次に、各ライセートに140マイクロリットルのクロロホルムを加えます。

チューブをすばやくキャップして15秒間激しく振とうし、内容物を乳化します。次に、チューブをGの12, 000倍で摂氏4度で15分間遠心分離します。次に、RNAを含む上部水相を新しいチューブに慎重に移します。

ピペットの先端が有機相に触れないようにしてください。水相に100%エタノール1.5容量を加え、溶液をゆっくりと3回ピペットで混合します。その後、市販のキットを用いてRNAを精製し、収量を定量します。

サンプルあたり少なくとも3.5マイクログラムを期待してください。タンパク質と有機化合物に対する純度の比率は、どちらも少なくとも1.9である必要があります。次に、キットを使用して250、500、または1, 000ナノグラムのRNAを後転写します。

次に、定量的RTPCRにより、目的の内因性遺伝子のノックダウン効率を定量化します。このプロトコルでは、A.Cetin and Companyが以前に発表したプロトコルに従って、15日以上前にRAAV12を脳に注入した動物を使用してください。脳を分離し、ビブラトームとガスで氷のように冷えたACFFで急性脳スライスを作成します。

関心領域のスライスを収集し、光への曝露を最小限に抑えて、光遺伝学的プローブの活性化を回避します。同じACFFでスライスを摂氏37度で30分間回復させます。脳のスライスを保持するために特別に設計されたチャンバーを使用してください。

その後、スライスを室温に戻すと、6〜8時間健康に保たれます。続行するには、スライスを記録チャンバーに移し、ACFFの毎分2ミリリットルでスーパーフュージョンします。次に、発現した蛍光レポーターのシグナルを簡単に確認し、感染の局在と強度を確認します。

次に、パッチ電極に細胞内溶液を充填します。次に、赤外線照明下で、感染したニューロンからシナプス入力を受けているニューロン上のタイトシールホールセール構成を取得します。直列抵抗は補償せずに放置することもできますが、一定で低くする必要があります。

例えば、CA3錐体ニューロンが感染した場合、CA1領域の近位から内側の路に錐体ニューロンをパッチします。細胞が縮小または膨らみ始めたとき、パッチングが困難になったとき、またはバッチが不安定になったとき、選択したスライスは記録するのに十分な健康状態ではなくなります。次に、薬理学を使用して、調査中のシナプス電流を分離します。

例えば、興奮性シナプス伝達を調べることが目的であれば、浴槽にバイキュクリンを添加することで抑制性シナプス伝達をブロックします。次に、感染したニューロンの体性体上に配置された光ファイバーに結合された473ナノメートルの青色レーザーを使用して、興奮性シナプス後電流などのシナプス電流を呼び起こします。レーザーをニューロンの軸索に向けないでください。

たとえば、シェイファーの担保に光を当てることは避けてください。軸索の直接的な脱分極は望ましくありません。次に、刺激の長さを最小に調整して、光パルスごとに複数の活動電位を誘発する可能性を減らします。

次に、レーザーの強度を微調整して、小さいながらもはっきりと検出可能なシナプス電流を呼び起こします。例えば、CA3とCA1の錐体ニューロン間の興奮性シナプス伝達の場合、レーザーの強度を調整して、20〜50ピコアンペアのシナプス電流を呼び起こします。実験の最後に、テトロドトキシンを0.5マイクロモルで適用して、ナトリウムチャネルを遮断します。

光学的に誘発される電流のテトロドトキシンに対する感度は、それらが活動電位駆動であることを示しています。少なくとも3つの異なる動物から、特定の条件に対して少なくとも8つのニューロンがパッチされるまで、データを収集し続けます。これは、結果の分析に必要な最小限のデータです。

記載の方法を用いて、シナプス前P/Q型電位依存性カルシウムチャネルの代替スプライスアイソフォームをノックダウンした。これらのチャネルは、CA3からCA1の興奮性シナプスにおける短期的なシナプス可塑性を調節すると考えられています。アイソフォーム特異的なマイクロRNAを発現する4つの異なるコンストラクトを作製しました。それぞれを超高速チャネルのロドプシンと蛍光タンパク質Td-Tomatoと共に発現させました。

まず、各コンストラクトは、アイソフォーム特異的定量的RTPCRを使用して、初代ラットニューロン培養において十分なノックダウン効率と選択性を有することを確認しました。次に、各構築物をP18ラットの海馬に注入した。最終的に、CA3からCA1シナプスへの短期的なシナプス可塑性に対するコンストラクトの影響は、感染したCA3錐体ニューロンを473ナノメートル光の短いパルスで刺激し、得られたEPSCをCA1領域の錐体ニューロンから卸売り構成で記録することによって調査されました。

異なるスプライスアイソフォームのノックダウンは、反対方向の対パルス刺激に対する応答に影響を与えました。A アイソフォームのノックダウンでブーストされたペアパルス促進。一方、Bアイソフォームのノックダウンはそれを廃止しました。RNA干渉オプトジェネティクスを組み合わせることで、シナプス生理学の分野での研究が可能になり、シナプス前タンパク質が無傷の回路で短期的なシナプス可塑性をどのように制御するかを探求することができます。

このビデオを見れば、マイクロRNAのRNA干渉を検証する方法と、それらをオプトジェネティクスと組み合わせて急性脳スライスのシナプス伝達を調査する方法について十分に理解できるはずです。