Name: オプトジェネティクスを組み合わせてそのまま神経回路内でのシナプス前機能に関する遺伝子ノックダウンの効果を特徴付ける人工マイクロ Rna (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 学ぶオプトジェネティクスと人工マイクロRNAを組み合わせた神経回路内シナプス前機能の遺伝子ノックダウン効果の評価法。急性脳切片を用いてシナプス伝達を選択的にモニタリングし、シナプス可塑性の生理学的役割を解明します。

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デモで助けるため支援・ カルメラ ・ ヴィターレ ・ f ・ Benfenati (Istituto イタリアーノ ・ ディ ・技術、情報技術学院) をありがちましょう。この作品は、IIT とアラコエリ サン ・ パオロ (LAC にグラント号 9734) によって賄われていた。

<ol><li>Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+Versus+miRNA+as+Therapeutics+for+Gene+Silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther-Nucl+Acids%22%5BJournal%5D)">siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing.</a> Mol Ther-Nucl Acids. 4, e252(2015).</li>
<li>Kohl, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemisphere-specific+optogenetic+stimulation+reveals+left-right+asymmetry+of+hippocampal+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity.</a> Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415 (2011).</li>
<li>Maejima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+loss+of+P%2FQ-type+channels+confined+to+rhombic-lip-derived+neurons+alters+synaptic+transmission+at+the+parallel+fiber+to+purkinje+cell+synapse+and+replicates+genomic+Cacna1a+mutation+phenotype+of+ataxia+and+seizures+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Postnatal loss of P/Q-type channels confined to rhombic-lip-derived neurons alters synaptic transmission at the parallel fiber to purkinje cell synapse and replicates genomic Cacna1a mutation phenotype of ataxia and seizures in mice.</a> J Neurosci. 33 (12), 5162-5174 (2013).</li>
<li>Mark, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+postnatal+loss+of+P%2FQ-type+calcium+channels+recapitulates+the+absence+epilepsy%2C+dyskinesia%2C+and+ataxia+phenotypes+of+genomic+Cacna1a+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Delayed postnatal loss of P/Q-type calcium channels recapitulates the absence epilepsy, dyskinesia, and ataxia phenotypes of genomic Cacna1a mutations.</a> J Neurosci. 31 (11), 4311-4326 (2011).</li>
<li>Thalhammer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+Splicing+of+P%2FQ-Type+Ca2%2B+Channels+Shapes+Presynaptic+Plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Alternative Splicing of P/Q-Type Ca2+ Channels Shapes Presynaptic Plasticity.</a> Cell Rep. 20 (2), 333-343 (2017).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-phosphate-mediated+Transfection+of+Eukaryotic+Cells+with+Plasmid+DNAs%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Calcium-phosphate-mediated Transfection of Eukaryotic Cells with Plasmid DNAs.</a> CSH Protoc. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Chung, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycistronic+RNA+polymerase+II+expression+vectors+for+RNA+interference+based+on+BIC%2FmiR-155%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Polycistronic RNA polymerase II expression vectors for RNA interference based on BIC/miR-155.</a> Nucleic Acids Res. 34 (7), e53(2006).</li>
<li>McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+titering+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> J Vis Exp. (57), e3348(2011).</li>
<li>Cingolani, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+regulation+of+synaptic+AMPA+receptor+composition+and+abundance+by+beta3+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent regulation of synaptic AMPA receptor composition and abundance by beta3 integrins.</a> Neuron. 58 (5), 749-762 (2008).</li>
<li>Huang, H., Xu, Y., Cheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+alternative+splicing+during+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of alternative splicing during epithelial-mesenchymal transition.</a> J Vis Exp. (92), e51845(2014).</li>
<li>Vandesompele, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+normalization+of+real-time+quantitative+RT-PCR+data+by+geometric+averaging+of+multiple+internal+control+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes.</a> Genome Biol. 3 (7), (2002).</li>
<li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. (2012).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. (2013).</li>
<li>Gunaydin, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+optogenetic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ultrafast optogenetic control.</a> Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).</li>
<li>Bourinet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+of+alpha+1A+subunit+gene+generates+phenotypic+variants+of+P-+and+Q-type+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Splicing of alpha 1A subunit gene generates phenotypic variants of P- and Q-type calcium channels.</a> Nat Neurosci. 2 (5), 407-415 (1999).</li>
<li>Chaudhuri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+as+a+molecular+switch+for+Ca2%2B%2Fcalmodulin-dependent+facilitation+of+P%2FQ-type+Ca2%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing as a molecular switch for Ca2+/calmodulin-dependent facilitation of P/Q-type Ca2+ channels.</a> J Neurosci. 24 (28), 6334-6342 (2004).</li>
<li>Soong, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+splice+variants+in+human+P%2FQ-type+channel+alpha1%282.1%29+subunits%3A+implications+for+current+density+and+Ca2%2B-dependent+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of splice variants in human P/Q-type channel alpha1(2.1) subunits: implications for current density and Ca2+-dependent inactivation.</a> J Neurosci. 22 (23), 10142-10152 (2002).</li>
<li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+channelrhodopsins+for+fast+neuronal+stimulation+at+low+light+levels%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels.</a> P Natl Acad Sci USA. 108 (18), 7595-7600 (2011).</li>
<li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li>
<li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).</li>
<li>Zhang, Y. P., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+induction+of+synaptic+plasticity+using+a+light-sensitive+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel.</a> Nat Methods. 4 (2), 139-141 (2007).</li>
<li>Fowler, D. K., Williams, C., Gerritsen, A. T., Washbourne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+knockdown+from+artificial+microRNAs+in+an+enhanced+miR-155+backbone%3A+a+designer%27s+guide+to+potent+multi-target+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Improved knockdown from artificial microRNAs in an enhanced miR-155 backbone: a designer's guide to potent multi-target RNAi.</a> Nucleic Acids Res. 44 (5), e48(2016).</li>
</ol>

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光プローブおよび興味のシナプス前遺伝子に対してミールの共発現遺伝子ノックダウンがそのまま神経回路内でのシナプス前機能に及ぼす影響を特徴付けるための強力なアプローチを提供しています。この実験の方法識別し非常に効率的なネイティブ システムの興味の遺伝子をノックダウンで選択 miRs を特徴付ける重要です。可能であれば、関心の同じ mRNA に対する 2 つ以上の独立した miRs は最終的なオフターゲット効果のコントロールに使用ください。レスキュー実験、ミール耐性遺伝子は、システムの再導入は、特異性のコントロールとして使用できます。
同じ構成要素を使用して、光を表現するプローブと、ミールは、光学的に操作されているシナプス前ニューロンのみを刺激するためできます。ために混合し、希釈の結果を起こす感染および非感染のニューロンを区別しないので、これは電気刺激で可能ではありません。光の刺激は、複数の活動電位15を引き起こすことができる、ので拡大パレット15,の19,20,21の中で、最速の光遺伝学的プローブのみを選択することが重要です。また、光刺激はシナプス前の研究の直接脱分極を誘導せず、シナプス伝達の手順の一部をバイパスするを避けるために 1 つは22を調査したいことを確保するため不可欠です。
ここで、述べたい実験的アプローチでは、並行限られた期間 (4 〜 6 ヶ月) 内の興味の複数のシナプス前遺伝子の生理学的な関連性を評価可能です。ただし、ノックダウンほとんど 100% に達することを留意することが重要です。さらに、rAAVs は初期の発達過程を調査するときに時間の制約を表す場合があります光プローブの最大のノックダウンと表現を可能にするのには、少なくとも 2 週間の表現する必要があります。シナプス前ニューロンに限るより多くの時間がかかり、条件付きのノックアウト マウスは通常結果が興味の遺伝子の削除を完了し、有効な相補的なアプローチを提供するため。
ミールの技術の特定の利点は、複数の miRs 同じプロモーターから発現できます。このプロパティは、同じミールまたは同じターゲット遺伝子に対する異なる miRs の複数のコピーを挿入することによってノックダウン効率化に主に使用されています。ただし、によってまた使用されるノックダウンする複数の遺伝子別のターゲット遺伝子7,23に対して miRs を表現します。このプロパティは、シナプス前のシグナル伝達経路を分析する複数のシナプス蛋白質の沈黙にされる可能性があります。
ここでは、我々 は急性海馬スライスにおけるシナプス前機能遺伝子の打撃の効果を特徴付ける人工 miRs で光遺伝学を組み合わせています。同様のアプローチは、操作し、プローブの体内の神経回路にも使用できます。さらに、人工 miRs と chemogenetic を組み合わせてアプローチにより、尋問の長い時間スケールの神経回路に 1 つ。

このプロトコルでは、遺伝子の打撃がそのまま神経回路内でのシナプス前機能に及ぼす影響を評価する新しいアプローチについて説明します。そのまま神経回路のシナプス前機能の調査多くのシナプス前のボタンが小さすぎるのでと遠く離れた複合分子と電気生理学的介入を許可する相馬からは困難です。RNA 干渉をノックダウン シナプス蛋白質1の強力で柔軟な手段が用意されています、このアプローチは、従来の打撃の効果を検出することは困難だからシナプス前機能を調査するため多用されていた区別しない電気刺激の操作と素朴なシナプス ボタン2。ここでは、人工マイクロ Rna (ミール) を結合する方法について説明-急性脳スライスの操作シナプス ボタンの選択的刺激を達成するために最近開発された光遺伝学的技術と RNA 干渉を介する。
電気生理学との組み合わせで条件付きノックアウト マウスは、シナプス蛋白質3,4の機能を調査するも使用できますが、我々 の戦略は不要開発と保守の遺伝子マウスの行を変更し、遺伝子の特定のアイソ フォームをノックダウンするも簡単に採用することができます。一般的に相対的な使用される短いヘアピン Rna (Shrna) ここを用いて、人工のミールはニューロンの打撃の主な利点を提供しています。Shrna とは異なり、彼らはポリメラーゼ II のプロモーター1の制御の下で表現できます。したがって、単一プロモーターは、ミールの蛍光レポーターと一緒にの光遺伝学的プローブ式をドライブに使用できます。このように、組換えアデノ随伴ウイルス (下さい rAAV、図 1 a) の包装範囲内で構造体のサイズを維持できます。また、単一の構造と単一のプロモーターを使用はミール、光遺伝学的プローブ、固定比率で蛍光レポーターの発現できるので実験的変動を低減します。
我々 は最近5海馬におけるシナプス前性カルシウム チャネルの交互スプライシング アイソ フォームの役割を調べるにこの技術を適用されます。このような戦略は、一般的に関心の任意の脳回路他ンエに表現された蛋白質の生理学的な関連性を勉強に適用されます。

<table><tbody><tr><td>アクリルアミド</td><td>Sigma</td><td>アクリルアミド/ビスアクリルアミド、30%溶液</td><td></td></tr><tr><td>ヒートパッド付き有毒動物温度コントローラー</td><td>WPI</td><td>ATC2000</td><td></td></tr><tr><td>BCAタンパク質アッセイキット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>BLOCK-iT Pol II miR RNAi 発現ベクターキット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>K4936-00</td><td></td></tr><tr><td>ブレインスライス プレチャンバー</td><td>ハーバード・イスプラクティッド</td><td>BSC-PC</td><td></td></tr><tr><td>CCDカメラベースイメージャー</td><td>Bio-Rad</td><td>ChemiDoc&trade;</td><td></td>MP</tr><tr><td>細胞培養試薬</td><td>ライフテクノロジー</td><td></td><td></td></tr>ズ <tr><td>化学発光基質</td><td>GE Helthcare</td><td>ECL ウェスタンブロッティング試薬、RPN2106</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td>毒性</td></tr><tr><td>Cytosine &β;-D-アラビノフラノシド</td><td></td><td>Σ C6645</td><td></td></tr><tr><td>ドリル</td><td>フォレダム</td><td>K.1030</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン軟膏</td><td>地方薬局</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グルコース Σ</td><td></td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Σ</td><td></td><td>54459</td><td></td></tr><tr><td>注射用マイクロピペット</td><td>成重</td><td>GD1</td><td></td></tr><tr><td>無機塩・洗剤</td><td></td> Σ <td></td><td></td></tr><tr><td>K2-クレアチンリン酸</td><td>Calbiochem</td><td>237911</td><td></td></tr><tr><td>KGluconate</td><td>Fluka</td><td>60245</td><td></td></tr><tr><td></td><td>レーザーLaserglow Technologies</td><td>LRS-0473-GFM-00100-03</td><td></td></tr><tr><td>メンブレン</td><td>アマシャム</td><td>Protran&trade; 0.2 &micro;m NC</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Σ</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットホルダー</td><td>成重</td><td>IM-H1</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー</td><td>成重</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>Na3GTP</td><td>Σ</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>NaPyruvate</td><td></td><td>Σ P5280</td><td></td></tr><tr><td>眼用潤滑剤</td><td>地元薬局</td><td>ラクリゲル</td><td></td></tr><tr><td>リン酸塩阻害剤</td><td>Sigma</td><td>P0044, P5726</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤</td><td>Sigma</td><td>cOmplete&trade;, EDTAフリー プロテアーゼ阻害剤 カクテル</td><td></td></tr><tr><td>タンパク質ゲル電気泳動およびブロッティングデバイス</td><td>バイオ・ラッド</td><td>ミニプロティアンIII細胞</td><td></td></tr><tr><td>プロビドンヨウ素</td><td>地元の薬局</td><td>ベタジン</td><td></td></tr><tr><td>キアゾール溶解試薬</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>QuantiTect Reverse 転写キット</td><td>Qiagen</td><td>205311</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy マイクロキット</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>定位装置</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>テトロドトキシン</td><td>トクリス</td><td>1069</td><td>有毒</td></tr><tr><td>ビブラートーム</td><td>ライカ</td><td>VT1200S</td><td></td></tr></tbody></table>

オプトジェネティクスを組み合わせてそのまま神経回路内でのシナプス前機能に関する遺伝子ノックダウンの効果を特徴付ける人工マイクロ rna

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

このプロトコルの目的は、そのまま神経回路内でのシナプス前機能に関する遺伝子の打撃の効果を特徴付けるためです。我々 は人工マイクロ Rna (ミール) を結合する方法のワークフローを記述する-急性脳スライスの操作シナプス ボタンの選択的刺激を達成するために研究と RNA 干渉を介する。実験的アプローチは、単一のウイルス構造と光プローブとシナプス前遺伝子に対して人工 miR(s) の両方の式を運転する単一ニューロン固有プロモーターの使用を含みます。興味の脳の領域に注入改良ときに、表現の構成要素、捜査遺伝子の発現低下と神経細胞のみを光で刺激することが可能になります。この戦略は、開発と遺伝子組み換えマウスのメンテナンスが必要ないと原則的に適用できる他の生物と選択のすべての神経の遺伝子。最近シナプス前 P/Q 型電位依存性カルシウム チャネル (VGCCs) の代替スプライス アイソ フォームのノックダウンが CA1 急性海馬スライスにおける興奮性シナプスに CA3 で短期的なシナプス可塑性を調節する方法を調査することを行った。同様のアプローチは、操作し、プローブのin vivo神経回路にも使用できます。

上記の手順は、どのようにシナプス伝達を評価する手法は、シナプス前ニューロンにおけるシナプス蛋白質の打撃によって影響を受けるを提供します。代替のノックダウン スプライスのシナプス前 Cav2.1 のアイソ フォームの代表的な結果 (P/q) VGCCs 例として下記の通り興奮性シナプス CA1 に CA3 で短期的なシナプス可塑性を調節します。
Cav2.1 (P/q) チャネルは、中枢神経系で最も速いシナプスで優勢なシナプス前 VGCCs。相互に排他的エクソンのスプライシング代替 37a と Cav2.1 (α1 a) の細孔形成 α1サブユニットの 37b 生成 2 つの主要な変形、Cav2.1 [EFa] と Cav2.1 [EFb]16,17 、18。かどうか Cav2.1 [EFa] と Cav2.1 [EFb] 差動を調節するシナプス伝達とラット海馬錐体ニューロンのシナプス可塑性を決定する開発したノックダウンするアイソ フォーム特異 miRs 選択的に Cav2.1 [EFa] または Cav2.1 [EFb]5。ショート サイズにもかかわらず (97 bp) とエクソン間類似性が高い (塩基配列レベルで id 61.86%) に対して 3 つのミール シーケンスを設計できるか 37b 37a、ラットの Cav2.1 [EFa] (ミール EFa1: TCCTTATAGTGAATGCGGCCG; ミール EFa2: ATGTCCTTATAGTGAATGCGG;ミール EFa3: TTGCAAGCAACCCTATGAGGA) および 2 Cav2.1 [EFb] ラットに対して (ミール EFb1: ATACATGTCCGGGTAAGGCAT; ミール EFb2: ATCTGATACATGTCCGGGTAA) 予測高ノックダウン効率。否定的な制御 (ミール コントロール) として、知られている脊椎動物の遺伝子をターゲットにしないシーケンスを含む pcDNA6.2 GW/EmGFP ミール neg プラスミドを使用しました。HEK 293 細胞異種チャンネルの最初の画面を基に、ミール EFa1、ミール EFa3 と EFb2 を選択しに 3' UTR の rAAVs の生産のために設計されている pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X のベクトルの式カセットを複製と場所、synapsin プロモーター ドライブ式超高速チャネルロドプシン ケータ、赤の蛍光タンパク質 TdTomato と挿入されたミール (図 1)。我々 はまた、ミール EFb2 このミールのノックダウン効率を高めるための発現カセットを複製しました。
次に、上記の 4 つの構造の rAAV1/2 を作製し、ノックダウン効率化及びアイソ フォーム特異 qRT PCR を用いたラット初代神経文化における選択性を定量化しました。ミール EFa1 とミール EFa3 ネイティブ カリフォルニア州v2.1 [EFa] 〜 70% の mRNA はなく、Cav2.1 [EFb] ながら減少ミール EFb 減少ネイティブ カリフォルニア州v2.1 [EFb] ~ 60% の mRNA はなく、Cav2.1 [EFa] (図 2)。
我々、改良 4 rAAV1/2 のそれぞれに注入 (図 3 a-c)、P18 ラットの海馬の CA3 領域 (A ・ P/M L/D-V 前から) −2.6 の座標を持つ/± 2.9/−2.9。15 から 24 日後注入 rAAV1/2 注入ラット急性海馬スライスを作製し、TdTomato 蛍光式 (図 3 b) rAAVs の局在を確認するために使用します。[EFb] Cav2.1 [EFa] または Cav2.1 のシナプス前の打撃に CA1 シナプスに CA3 における短期的なシナプスの可塑性が影響を受けるかどうか調べるために、我々 は簡単な 473 nm レーザー光パルス (2 ms 間で選択的に感染の ca3 錐体細胞を刺激;図 3) と CA1 領域 (図 3) の内側の管に近位の錐体細胞のパッチによって結果の工を記録。Cav2.1 スプライス アイソ フォームのノックダウンに反対の方向で対パルス刺激に対する応答が影響を受けることが分かった: Cav2.1 のノックダウン [EFa] (ミール EFa1 またはミール EFa3) に対しペアパルス円滑化 (PPF) を後押しした Ca のノックダウンv2.1 [EFb] (ミール EFb2) はそれ (図 3 DE) を廃止しました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig1.jpg"> 図 1: 超高速光プローブ ケータとアイソ フォーム特異 miRs Cav2.1 [EFa] と Cav2.1 [EFb] に対して組み合わせ式の構造の方式です。(A) 、下さい rAAV の地図作成 pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X、synapsin プロモーター (Syn) を含む、超高速チャネルロドプシン ケータ融合 TdTomato し、近位 3' UTR、Cav2.1 スプライス ・ アイソ フォーム特異ミールで。表示の制限の酵素は、シングル カッターです。(B)式カセットのトップ、方式です。Synapsin のプロモーターは、ケータ TdTomato のアイソ フォーム特異 miR 式をドライブします。下、ミールのカセットの部分を形成する 21 ヌクレオチド ターゲット シーケンスの逆の補数。ミール EFb2 2 つの同一のミール カセットだった他の後タンデム 1 つで表されます。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig2.jpg"> 図 2。ノックダウン効率と Cav2.1 [EFa] と Cav2.1 [EFb] のアイソ フォーム特異 miRs の選択性の評価します。MiRs Cav2.1 [EFa] (ミール EFa1 とミール EFa3) をターゲットを表現する rAAVs 6 DIV で感染 17 18 DIV 初代培養から分離された RNA のアイソ フォーム特異 qRT PCR 解析または Cav2.1 [EFb] (ミール EFb2)。データは、ネガティブ コントロール (ミール コントロール) に正規化されます。ミール EFa1 とミール EFa3 大幅にし、選択的に減らす [EFa] Cav2.1 の mRNA (n 8 と 7 の文化をそれぞれ =)、ミール EFb 大幅にし、選択的に減少 [EFb] Cav2.1 の mRNA (n = 4 文化; * * * p &lt; 0.001; 一方向の解析分散テスト テューキー Kramer の事後テストが続く)。± SEM. を意味するようにデータが表示されます。この図は、Thalhammer、A.らから適応されています。5.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig3.jpg"> 図 3。オプトジェネティクスをノックダウン ニューロンの刺激をターゲットの役割評価 Cav2.1 [EFa] と Cav2.1 [EFb] ネイティブ海馬。(A) 生体内で感染に使用下さい rAAV 構造の発現カセット法(B)その TdTomato 蛍光性を示す海馬のセクションは、CA3 領域とその予測に限定されます。(C)実験的構成: レーザービームが CA3 突起に指示された, CA1 錐体細胞からパッチ クランプ録音を行った。(D) 2 ms ロング ブルー (473 nm) レーザー光パルス 20 Hz で輝いていた呼び起こす工が PPF は miRs Cav2.1 [EFa] をターゲットにより増加し、ミール Cav2.1 [EFb] によって廃止されます。ミール コントロールする相対的なミール、EFb2 の減少とミール EFa3 ミール EFa1 PPF の増加を示すペアパルス比率 (D) のように実験のための(E)概要 (n = 9-11 録音; * p = 0.02; * * p = 0.01; * * * p &lt; 0.0004; 共分散分析)。± SEM. を意味するようにデータが表示されます。この図は、Thalhammer、A.らから適応されています。5.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

このプロトコルは、そのまま神経回路内で選択的な遺伝子の発現低下と特にシナプス研究を刺激するために光遺伝学と人工のマイクロ Rna を介した RNA 干渉を結合する方法のワークフローを提供します。

オプトジェネティクスを組み合わせてそのまま神経回路内でのシナプス前機能に関する遺伝子ノックダウンの効果を特徴付ける人工マイクロ Rna

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

人工マイクロRNAを介したRNA干渉をオプトジェネティクスと組み合わせる全体的な目標は、無傷のニューロン回路内のシナプス前機能に対する遺伝子ノックダウンの影響を特徴づけることです。この方法は、無傷の脳回路におけるシナプス前タンパク質の生理学的役割に対処するなど、シナプス生理学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、調査中のシナプス前タンパク質の発現が低下したニューロンでシナプス伝達を選択的に監視することを可能にすることです。また、この手法を用いて、急性脳切片のシナプス前機能を調べています。また、in vivoでのニューロンのセキュリティの操作や調査にも適用できます。その手順を実演するのは、私たちの研究室の大学院生であるCarmela Vitaleです。マイクロRNAを設計し、マイクロRNAと光遺伝学的プローブを発現する組換えベクターを構築した後、目的の脳領域から初代ニューロン培養物を調製します。これを行うには、LA Cingolani and Companyによって確立された皮質培養プロトコルに従い、次の変更を加えます。まず、6ウェルプレートを使用し、ウェルあたり50万個のニューロンをプレート化し、ウェルあたり2.5ミリリットルの付着培地を使用します。プレートを4時間インキュベートした後、ウェルあたり3.3ミリリットルのメンテナンス培地に切り替え、アストロサイトの異常増殖が観察された場合は、7.5マイクロモルのAraCを補充した0.5ミリリットルのメンテナンス培地を3〜4回のDIVで追加します。5〜6個のDIVで、各microRNAに対して3つのウェルを感染させてテストします。ニューロンの少なくとも99%に感染する最低感染量を使用してください。ウイルスをニューロンに直接加え、穏やかに混合し、プレートを摂氏37度のインキュベーターに戻します。17〜18 DIVで、ニューロンを溶解してRNAを抽出します。プレートを傾け、ガラスピペットを使用して各ウェルからすべての培地を取り除きます。次に、すぐに各ウェルに700マイクロリットルの溶解試薬を加えます。短時間の混合後、細胞ライセートを各ウェルから別々の1.5ミリリットルチューブに移します。次に、各ライセートに140マイクロリットルのクロロホルムを加えます。チューブをすばやくキャップして15秒間激しく振とうし、内容物を乳化します。次に、チューブをGの12, 000倍で摂氏4度で15分間遠心分離します。次に、RNAを含む上部水相を新しいチューブに慎重に移します。ピペットの先端が有機相に触れないようにしてください。水相に100%エタノール1.5容量を加え、溶液をゆっくりと3回ピペットで混合します。その後、市販のキットを用いてRNAを精製し、収量を定量します。サンプルあたり少なくとも3.5マイクログラムを期待してください。タンパク質と有機化合物に対する純度の比率は、どちらも少なくとも1.9である必要があります。次に、キットを使用して250、500、または1, 000ナノグラムのRNAを後転写します。次に、定量的RTPCRにより、目的の内因性遺伝子のノックダウン効率を定量化します。このプロトコルでは、A.Cetin and Companyが以前に発表したプロトコルに従って、15日以上前にRAAV12を脳に注入した動物を使用してください。脳を分離し、ビブラトームとガスで氷のように冷えたACFFで急性脳スライスを作成します。関心領域のスライスを収集し、光への曝露を最小限に抑えて、光遺伝学的プローブの活性化を回避します。同じACFFでスライスを摂氏37度で30分間回復させます。脳のスライスを保持するために特別に設計されたチャンバーを使用してください。その後、スライスを室温に戻すと、6〜8時間健康に保たれます。続行するには、スライスを記録チャンバーに移し、ACFFの毎分2ミリリットルでスーパーフュージョンします。次に、発現した蛍光レポーターのシグナルを簡単に確認し、感染の局在と強度を確認します。次に、パッチ電極に細胞内溶液を充填します。次に、赤外線照明下で、感染したニューロンからシナプス入力を受けているニューロン上のタイトシールホールセール構成を取得します。直列抵抗は補償せずに放置することもできますが、一定で低くする必要があります。例えば、CA3錐体ニューロンが感染した場合、CA1領域の近位から内側の路に錐体ニューロンをパッチします。細胞が縮小または膨らみ始めたとき、パッチングが困難になったとき、またはバッチが不安定になったとき、選択したスライスは記録するのに十分な健康状態ではなくなります。次に、薬理学を使用して、調査中のシナプス電流を分離します。例えば、興奮性シナプス伝達を調べることが目的であれば、浴槽にバイキュクリンを添加することで抑制性シナプス伝達をブロックします。次に、感染したニューロンの体性体上に配置された光ファイバーに結合された473ナノメートルの青色レーザーを使用して、興奮性シナプス後電流などのシナプス電流を呼び起こします。レーザーをニューロンの軸索に向けないでください。たとえば、シェイファーの担保に光を当てることは避けてください。軸索の直接的な脱分極は望ましくありません。次に、刺激の長さを最小に調整して、光パルスごとに複数の活動電位を誘発する可能性を減らします。次に、レーザーの強度を微調整して、小さいながらもはっきりと検出可能なシナプス電流を呼び起こします。例えば、CA3とCA1の錐体ニューロン間の興奮性シナプス伝達の場合、レーザーの強度を調整して、20〜50ピコアンペアのシナプス電流を呼び起こします。実験の最後に、テトロドトキシンを0.5マイクロモルで適用して、ナトリウムチャネルを遮断します。光学的に誘発される電流のテトロドトキシンに対する感度は、それらが活動電位駆動であることを示しています。少なくとも3つの異なる動物から、特定の条件に対して少なくとも8つのニューロンがパッチされるまで、データを収集し続けます。これは、結果の分析に必要な最小限のデータです。記載の方法を用いて、シナプス前P/Q型電位依存性カルシウムチャネルの代替スプライスアイソフォームをノックダウンした。これらのチャネルは、CA3からCA1の興奮性シナプスにおける短期的なシナプス可塑性を調節すると考えられています。アイソフォーム特異的なマイクロRNAを発現する4つの異なるコンストラクトを作製しました。それぞれを超高速チャネルのロドプシンと蛍光タンパク質Td-Tomatoと共に発現させました。まず、各コンストラクトは、アイソフォーム特異的定量的RTPCRを使用して、初代ラットニューロン培養において十分なノックダウン効率と選択性を有することを確認しました。次に、各構築物をP18ラットの海馬に注入した。最終的に、CA3からCA1シナプスへの短期的なシナプス可塑性に対するコンストラクトの影響は、感染したCA3錐体ニューロンを473ナノメートル光の短いパルスで刺激し、得られたEPSCをCA1領域の錐体ニューロンから卸売り構成で記録することによって調査されました。異なるスプライスアイソフォームのノックダウンは、反対方向の対パルス刺激に対する応答に影響を与えました。A アイソフォームのノックダウンでブーストされたペアパルス促進。一方、Bアイソフォームのノックダウンはそれを廃止しました。RNA干渉オプトジェネティクスを組み合わせることで、シナプス生理学の分野での研究が可能になり、シナプス前タンパク質が無傷の回路で短期的なシナプス可塑性をどのように制御するかを探求することができます。このビデオを見れば、マイクロRNAのRNA干渉を検証する方法と、それらをオプトジェネティクスと組み合わせて急性脳スライスのシナプス伝達を調査する方法について十分に理解できるはずです。

combining-optogenetics-with-artificial-micrornas-to-characterize

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオは、マウス海馬の脳スライスにおける興奮性シナプス電流のマイクロRNA媒介阻害を示しています。CA3ニューロンには、蛍光レポーターを発現するためのコンストラクト、光活性化膜チャネル、および電位依存性カルシウムチャネルの発現をダウンレギュレートするマイクロRNAを保有する組換えウイルスベクターが感染しました。スライスを記録チャンバーに入れ、CA1ニューロンを記録ピペットでパッチすると、光パルスを使用して光活性化チャネルを刺激し、イオンの流入と活動電位の生成をもたらしました。CA3ニューロンに電位依存性カルシウムチャネルがないと、神経伝達物質の放出が阻害され、シナプスに結合したCA1ニューロンの興奮性シナプス後電流が阻害されます。...

マイクロRNAを介したマウス海馬切片における興奮性シナプス後電流の阻害

マイクロRNAは、脳の構造と機能に重要な役割を持っている。ここでは、設計されたmiRNAの発現レンチウイルスの定位注射を使用して過剰発現海馬のmiRNAを強制する方法について説明します。このアプローチは、評価するための比較的急速な方法として役立つことができる...

の定位注入マイクロRNA発現マウス海馬CA1領域にレンチウイルスと行動アウトカムの評価

遺伝学と光学系を組み合わせた神経科学のツールの最近の開発は、空間的および時間解像度の前例のないレベルの神経回路の活動を制御することができ、「光遺伝学」と呼ばれる。ここでは、前頭前皮質及びsubicular錐体ニューロンの遺伝的に定義されたサブセットのoptogenetic操作で、生体内の記録に統合するためのプロトコルを提供する。...

個々の錐体細胞のハイフィデリティOptogenetic制御法<em&gt;インビボ</em

私たちは、光遺伝学的アプローチを使用して前脳回路の機能的トポグラフィーとシナプス特性を特徴付ける方法を記述し、in...

光遺伝学的に標的とした前脳回路のレーザー走査型光刺激

Optogeneticsは、行動神経科学の実験で使用するための強力なツールとなっています。このプロトコルは、レーザーシステムの設計とセットアップのステップバイステップガイドを提供し、ほとんどのげっ歯類の行動試験パラダイムと互換性のある複数の同時in...

齧歯類の中枢神経系の生体光遺伝学的刺激

人工多能性幹細胞(iPSC)に由来するニューロン、初代皮質ニューロン、およびアストロサイトからなる共培養システムを生成するためのプロトコルが説明されています。この共培養システムにより、新しいiPS細胞由来ニューロンとチャネルロドプシン-2を発現する既存の皮質ニューロンとの間のシナプス接触および回路の形成を検出することができます。...

共培養系における神経結合の形成を評価するための光遺伝学的アプローチ

ここでは、マウスにおける睡眠/覚醒状態のモニタリング中に特定のタイプのニューロンを光遺伝学的に操作する方法を説明し、ストリア末端のベッド核に関する最近の研究を例に挙げる。...

マウスにおける睡眠/覚醒状態のモニタリング中の神経回路の光遺伝学的操作

このプロトコルの目的は、特定の局所神経回路の化学的操作に応答して成人神経幹細胞/前駆細胞の挙動を分析するアプローチを記述することである。...

成人海馬神経前駆細胞のアッセイ回路特異的調節

特定の神経集団や脳領域の光遺伝学的操作により、自由に動く動物の高い時間的および空間的分解能で行動を修正することができる。慢性に埋め込まれた光ファイバーと組み合わせて異なる光遺伝学的ツールを使用することにより、さまざまな神経変調および行動検査を行うことができます。...

自由に動くマウスの行動を調節する神経活動の光遺伝学的操作

ここでは、急性げっ歯類の脳スライスにおけるシナプス特異的な電気生理学的特性評価を可能にするために、光遺伝学的構築物を備えた個別の脳領域のウイルス形質導入を記述するプロトコルを提示します。...

エクスビボ 内側前頭前野から外側嗅内皮質への長距離シナプス伝達と可塑性の光遺伝学的調べ

ここでは、覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動を同時にイメージングするためのアデノ随伴ウイルス注入と頭蓋窓移植を組み合わせたプロトコルについて説明します。...

覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動の同時イメージング

学ぶオプトジェネティクスと人工マイクロRNAを組み合わせた神経回路内シナプス前機能の遺伝子ノックダウン効果の評価法。急性脳切片を用いてシナプス伝達を選択的にモニタリングし、シナプス可塑性の生理学的役割を解明します。

オプトジェネティクスを組み合わせてそのまま神経回路内でのシナプス前機能に関する遺伝子ノックダウンの効果を特徴付ける人工マイクロ Rna

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