Name: ミトコンドリアの分離と培養細胞におけるミトコンドリアのカルシウム流入の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 学ぶミトコンドリアのカルシウム流入測定法。プレートリーダーと共焦点顕微鏡を用いて、分離ミトコンドリアと培養細胞におけるカルシウム動態を解析する。神経科学や細胞生物学の研究に応用可能です。

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この作品は、アメリカ心臓協会 (J.Q.K.) からの交付によって支えられました。

このプロトコルで記述されているすべてのメソッドは、制度的動物のケアと使用エモリー大学委員会によって承認されています。
注: 最初の部分は、プレート リーダーを使用して分離心筋ミトコンドリア ミトコンドリアの Ca2 +流入を測定する実験です。
1. 試薬および解決
<ol><li>500 mL のミトコンドリアの分離のための MS グリコールエーテルジアミン四酢酸バッファーを作る: 225 mM マンニトール、75 mM ショ糖、5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES) 1 mM エチレング リコール-bis(β-aminoethyl ether)-N、N、N'、N'-四酢酸 (グリコールエーテルジアミン四酢酸)、pH 7.4 に調整島。0.22 μ m のフィルターを通してそれを殺菌、4 ° C で保存MS グリコールエーテルジアミン四酢酸バッファーが使用する前に 4 ° C にあらかじめ冷えたことを確認します。</li>
	<li>100 mL の KCl のバッファーを準備: 125 mM KCl、20 mM HEPES、1 mM KH2PO4、2 mM MgCl2、40 μ M グリコールエーテルジアミン四酢酸、pH 島の 7.2 に調整。室温で保管してください。</li>
	<li>ジメチルスルホキシド (DMSO) でグリーン 5N 株式 1 mM カルシウムを準備します。カルシウム グリーン 5N 株式 aliquotted をすることができ、-20 ° C で保存</li>
	<li>
Ca2 +取り込みのための基板を準備します。
	<ol>
<li>1 M ピルビン酸ナトリウム、pH 7.4 を準備します。因数-20 ° C で保存します。</li>
		<li>500 mM リンゴ酸、pH 7.4 を準備します。因数-20 ° C で保存します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 心筋ミトコンドリアの分離
<ol><li>制度の基準によるとマウスを安楽死させます。 注: 安楽死の私達の制度上承認された方法、マウスが isofluorane 吸入麻酔し、頚部転位によって犠牲に。</li>
	<li>胸の空洞を開き、肋骨の両側に沿って切断、中心部の側面、横隔膜を離れて切断と心臓組織を切除、心を収集します。 注: このプロトコル 3-4 実験のために十分であるべきアダルト マウス (約 120 mg) から収集した全体の中心からミトコンドリアの分離が行われます。肝臓など他のミトコンドリアの豊富な組織からミトコンドリアの分離、説明されたプロトコルに続く組織の 200 mg までを使用できます。</li>
	<li>組織をリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) すべての血液は心室から押し出されることを確保する x 氷冷 1 の 25 mL を徹底的にすすいでください。 注: 中心部から押し出される液体を実行する明確な心が十分に洗浄するでしょう。</li>
	<li>シャープはさみのペアを使用して冷たい 1 × PBS の 5 mL の小さな断片に心臓をミンチします。</li>
	<li>PBS を破棄し、みじん切りにした心臓組織を 0.10 に 0.15 mm のクリアランスで中古冷蔵 7 mL ガラス テフロン dounce ホモジナイザーに転送します。</li>
	<li>冷たい MS グリコールエーテルジアミン四酢酸バッファーの 5 mL を追加し、サンプルを均質化組織部分がもはやないまで表示 (約 11 ストローク)。 無傷と機能のミトコンドリアを取得することと、メモ: は、過剰組織を均質化はないです。</li>
	<li>磨砕液を 15 mL チューブに転送します。</li>
	<li>核と切れ目のない細胞のペレットに 5 分間、4 ° C で 600 x g でホモジネートを遠心します。</li>
	<li>上清を新しい 15 mL チューブに転送し、ミトコンドリアをペレットに 10 分間、4 ° C で 10,000 × g で遠心分離します。</li>
	<li>上澄みを廃棄し、氷の上のミトコンドリアのペレットを維持します。</li>
	<li>冷たい MS グリコールエーテルジアミン四酢酸バッファーを 2 回使用してミトコンドリアのペレットを洗浄します。各洗浄のためには、5 mL の MS グリコールエーテルジアミン四酢酸バッファーでミトコンドリアのペレットを再懸濁します 10,000 x g で 10 分間、4 ° C で遠心分離機、上澄みを廃棄します。</li>
	<li>最終的な洗浄後上澄みを廃棄し、氷冷 MS グリコールエーテルジアミン四酢酸バッファーの 100 μ L でミトコンドリアを再懸濁します。氷の上のミトコンドリアを維持します。 注: 実験 1 h 内のミトコンドリアを使用ください。</li>
	<li>ブラッドフォード蛋白質の試金26を用いたミトコンドリアのタンパク質濃度を測定します。</li>
</ol>3 ミトコンドリアのカルシウム吸収のプレート リーダーによる計測
注: ここでは、それはインジェクターが装備マルチモード プレート リーダーを使用してミトコンドリアの Ca2 +吸収を分析のために、プロトコルを記述しました。カルシウム グリーン 5N 蛍光を読み取る能力を持つリーダーをプレートいずれか (励起/蛍光 506/532 nm) キネティック モード自動試薬と反応を光から保護を保つためにインジェクターを使用ことができます。
<ol><li>毎秒 1,000 の総測定時間測定とカルシウム グリーン 5N 蛍光の運動を実行するプレート リーダーを読み取るプログラム s のさらに、プログラムの 30 の CaCl2ソリューションの 5 μ L を分注する試薬インジェクター s、150 s, 300 s、480 s、および 690 秒時点。 注: CaCl2注射のタイミングは、ユーザー定義、実験ニーズに合わせての調整することができます。</li>
	<li>首相の CaCl2ソリューションの試薬注入器を使用します。 注: CaCl2溶液の濃度は、ユーザー定義、Ca2 + MPTP オープニングをトリガーするために必要な量を滴定する後続の実行で調整することができます。</li>
	<li>96 well プレートの各ウェルにミトコンドリアの 200 μ g を追加します。</li>
	<li>ミトコンドリアと KCl のバッファーの総量は 197 μ L になるように、井戸に KCl バッファーの適切な量を追加します。</li>
	<li>ミトコンドリアの混合物に 1 M ピルビン酸の 1 μ L と 500 mM マラテの 1 μ L を追加します。優しく、ミックスしてミトコンドリアが活性化するように常温で 2 分間基板とミトコンドリアをインキュベート ピペットで移しなさい。</li>
	<li>1 mM カルシウム グリーン 5N 株式の 1 μ L を追加します。ピペットで穏やかに混合します。 注: を防ぐカルシウム グリーン 5N 色素添加による光反応。</li>
	<li>事前にプログラムされた運動プロトコルとモニター カルシウム グリーン 5N 蛍光を開始します。</li>
</ol>4. 試薬および解決
注: 2 番目の部分はミトコンドリア Ca2 +細胞の共焦点レーザー顕微鏡の実験手順です。
<ol><li>タイロード液 (130 mM NaCl, 4 mM KCl、2 mM CaCl2MgCl2、10 mM グルコース 1 mM, 10 mM HEPES、島と pH 7.2) を確認します。4 ° C で保存します。それを使用する前に室温に温めてください。</li>
	<li>洗浄ソリューション (100 mM カリウム酢酸 15 mM KCl、5 mM KH2PO4、5 mM Mg-ATP、0.35 ミリメートル グリコールエーテルジアミン四酢酸、0.12 mM CaCl2、0.75 mM MgCl2、クレアチンリン酸 10 mM、10 mM HEPES、島と pH 7.2) を準備します。4 ° C で保存します。それを使用する前に室温に温めてください。</li>
	<li>洗浄ソリューションで 0.005% サポニンを含む透過ソリューションを準備します。それは新鮮な毎日を準備します。</li>
	<li>準備 0 Ca2 +内部ソリューション (100 mM カリウム酢酸、15 mM KCl、0.35 mM 0.75 mM MgCl2、グリコールエーテルジアミン四酢酸 10 mM HEPES、pH 7.2 島の調整)。4 ° C で保存します。それを使用する前に室温に温めてください。</li>
	<li>Ca2 +を含む内部の溶液を準備します。無料 Ca2 +目的の濃度に到達する上内部ソリューションに CaCl2を追加します。CaCl2追加する量は、MaxChelator プログラム (maxchelator.stanford.edu) を使用して計算されます。</li>
	<li>DMSO のロード-2/午前株式 1 mM を準備し、使用するまで-20 ° C で保存します。</li>
	<li>1 mM MitoTracker DMSO でグリーン ・ ストックを準備し、使用するまで-20 ° C でそれを保存します。</li>
</ol>5. めっき細胞イメージング
<ol><li>22 × 22 cm2ガラス coverslips 100% エタノールを洗浄し、乾燥空気に coverslips を許可します。</li>
	<li>6 ウェル培養皿の個々 の井戸にガラス coverslips を配置します。 注: Coverslips はラミニン、ポリ-L-リジン、または細胞接着を促進するために類似のマトリックスでコーティングすることができます。</li>
	<li>Trypsinize し、イメージングの日の約 70% の合流を目指してカバーガラス上細胞をプレートします。</li>
</ol>6. 読み込みロード-2/午前および MitoTracker グリーンの細胞
<ol><li>ロード 2/AM MitoTracker の準備作業ソリューションをグリーンします。ロード-2/午前 1 mM 在庫の 20 μ L、MitoTracker グリーン 1 mM 株の 0.2 μ L と 20% プルロニック F-127 タイロード液の 1 ml の 2.5 μ L を追加します。実用的なソリューションのロード 2 の最終濃度が 20 μ M と MitoTracker グリーンの最終濃度は 200 nM。</li>
	<li>優しく、coverslip から成長メディアを削除します。 注意: 洗浄ステップは染付のソリューションの前に必要ではありません。</li>
	<li>ロード-2/AM-MitoTracker を追加 coverslip の coverslip がちょうどになるまでに滴下しファッションで緑のソリューション (coverslip あたり約 3-4 滴) を覆われています。</li>
	<li>それをセルが染料を使用して読み込むように光から保護部屋の温度で 30 分間インキュベートします。</li>
	<li>ロード 2/午前を脱エステル化します。優しくロード-2/AM-MitoTracker を削除ソリューションをグリーン、新鮮な室温タイロード液に置き換えて、光から保護部屋の温度で 30 分間インキュベートします。</li>
</ol>7 ミトコンドリア ロード 2/午前の MitoTracker グリーン蛍光共焦点イメージング
<ol><li>商工会議所をイメージング顕微鏡、coverslip を転送し、チャンバー洗浄ソリューション。</li>
	<li>40 X の位相コントラストで細胞を観察するための設定の下のセルが表示されるまで、フォーカス フォーカスを調整します。</li>
	<li>
ロード 2/AM MitoTracker の膜を permeabilize グリーン ロード細胞ミトコンドリアのローカライズされた色素を保持したまま細胞質局在ロード-2 を削除します。
	<ol>
<li>Coverslip から洗浄ソリューションを削除します。</li>
		<li>約 1 分の透過ソリューションで置き換えること。</li>
		<li>透過プロセス全体を通じて細胞膜の形態を視覚的に監視します。グリセリンの細胞は粗面を開発する.</li>
		<li>透過が完了したら、すぐに透過ソリューションを削除し、置き換えます 0 Ca2 +内部ソリューション。</li>
	</ol>
</li>
	<li>同時に画像のロード 2 蛍光 (559 nm レーザー ラインおよび排出 575 675 nm の間の波長で収集を使用して励起) と MitoTracker グリーン蛍光 (488 nm レーザー ラインと収集間の波長で放射を使用して励起505-525 nm)。ロード 2 と MitoTracker グリーンの明確な共存を表示するグリセリンの細胞に焦点を当てます。</li>
	<li>顕微鏡レーザーを減少し、ミトコンドリアのロード 2 蛍光がぼんやりと見えるようになるよう設定を得る。</li>
	<li>特定のアプリケーションのための適切なフレーム率と時間コースで 2 次元スキャンを取得する顕微鏡の設定を選択します。少なくとも 30 フレーム/秒のフレーム レート推移ミトコンドリア Ca2 +の動態を正確にキャプチャする勧めします。</li>
	<li>セルまたは顕微鏡の焦点を乱すことがなく、0 Ca2 +内部ソリューションを削除します。</li>
	<li>画像の取得を開始します。</li>
	<li>追加 Ca2 +-10 秒の時に十分に備えて内部ソリューション ポイント手動または灌流システムを使用します。</li>
	<li>対象 (ROIs) ミトコンドリア ロード 2 と画像集録ソフトウェアの MitoTracker 緑信号との間の共存の領域を包含する領域を選択します。 注: 記録の各時点の任意蛍光 (F) 値は、各投資収益率が取得されます。これらの値はバック グラウンド減算 (Ca2 +添加; する前に最初の蛍光に正規化し、F0) とデータの表示およびミトコンドリア Ca2 +の変動の振幅の定量化のための時間をかけて F0としてプロットします。</li>
</ol>

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<li>Chamberlain, B. K., Volpe, P., Fleischer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+calcium-induced+calcium+release+from+purified+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Inhibition of calcium-induced calcium release from purified cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles.</a> J Biol Chem. 259 (12), 7547-7553 (1984).</li>
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著者があるレポートへの開示。

ここでは、ミトコンドリアの Ca2 +流入を測定する 2 つの異なるアプローチについて述べる。プレート リーダー ベース カルシウム グリーン 5N 法モニター extramitochondrial Ca2 +レベルであり、Ca2 +取り込みアッセイは、分離ミトコンドリアでの測定に適しています。我々 は分離されたマウス心筋ミトコンドリアから代表的な結果を示している、このアッセイことが高いミトコンドリアの豊富な肝臓、骨格筋、脳などの組織から分離したミトコンドリアに容易に適応できます。さらに、プレート リーダー システムには、昔から Ca2 +測定ヘマトフロロのような特殊な機器をすぐに使用できない所のための理想的なオプションがあります。期間限定で最大スパン プレート リーダーをスキャンすることができ、あらかじめ試薬の追加をプログラムする必要がありますこの手法の弱点へヘマトフロロ、ただし、コストを比較し、ヘマトフロロの可用性は、この利点を上回る可能性があります。Ca2 +試薬インジェクターでの濃度を変化させることによりミトコンドリア、...

ミトコンドリアは、細胞内 Ca2 +貯蔵とシグナル伝達の重要なサイトです。数十年の研究は、ミトコンドリアがインポートし、Ca2 + 1,2を隔離する能力を持っていることを示しています。しかし、ミトコンドリアは Ca2 +貯蔵の単なる受動的なサイトではありません。Ca2 +ミトコンドリアのコンパートメントで代謝の出力の調節などの基本的なシグナリング機能を実行し、ミトコンドリアを介した細胞死経路の活性化されている見直し以前3。代謝調節の Ca2 +活性を高めるトリカルボン酸だけでなく、呼吸鎖複合体、ミトコンドリアのエネルギー生産4,5 を増加する 3 マトリックス ローカライズ脱水素酵素の.ミトコンドリアの Ca2 +過負荷と調節不全ミトコンドリアの Ca2 +ハンドリング、Ca2 +トリガー ミトコンドリア膜透過性遷移孔 (MPTP) 入り口、ミトコンドリア内膜の透過膜の潜在的な損失、ミトコンドリア機能障害、腫脹、破裂し、最終的には、細胞死6,7,8,9。細胞生命と死の経路を通じて代謝制御と MPTP 死の軸がこのように、ミトコンドリアの Ca2 +シグナリング直接影響します。
近年が急速に普及したためミトコンドリア Ca2 +動態の研究に関心のミトコンドリアの Ca2 +細胞複雑な分子成分の同定に大きい部分、ミトコンドリア内Ca2 +の主なモードは、膜輸送体は、ミトコンドリアのマトリックス10、11,12にインポートします。細胞の構造および調節サブユニットの同定はミトコンドリアの機能と機能障害を調節するためのミトコンドリアの Ca2 +流入をターゲット遺伝子の可能性をもたらしたし、の研究を促進、細胞複合体とミトコンドリア Ca2 +流入病13,14,15への貢献。確かに、様々 な神経変性疾患、および癌16,17,18、心臓病に至る疾患の病態に関与しているミトコンドリアの Ca2 +シグナル伝達 19,20。
ミトコンドリア Ca2 +代謝と細胞死のシグナル伝達の基本的な重要性を与えられ、生物学的システムの広い範囲と組み合わせるそのミトコンドリア Ca2 +シグナル伝達への影響、ミトコンドリアの Ca 2 +を評価する手法流入が大きな関心を集めています。当然ながら、さまざまな技術やミトコンドリア Ca2 +を測定するためのツールが開発されています。蛍光 Ca2 +などのツールを利用する方法が含まれます-敏感な染料21,22と遺伝子にコードされた Ca 2 +センサー cameleon、イクオリン23など、ミトコンドリアを対象と 24。この記事の目的は、さまざまな方法やミトコンドリアの Ca2 +吸収を測定できるモデル システムを強調することです。ミトコンドリアの Ca2 +流入能力を評価する 2 つの実験的手法を提示します。例として心臓のミトコンドリアを使用、プレート リーダー ベースのプラットフォームの詳細に説明してミトコンドリア Ca2 +の測定を使用して、Ca2 +敏感な吸収色素分離組織のミトコンドリア14 に最適ですカルシウム グリーン 5N.共焦点顕微鏡イメージングを用いたのミトコンドリア Ca2 + Ca2 +敏感な染料ロード-2/午前25を用いたグリセリンの細胞の測定の測定について述べるも NIH 3T3 細胞を使用して、.

<table><tbody><tr><td>オリンパスFV1000レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>シナジーNeo2マルチモードマイクロプレートリーダー(インジェクター付き</td>) <td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>組織ホモジナイザー</td><td>キンブル</td><td>886000-0022</td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm カバースリップ</td><td>コーニング</td><td>2850-22</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>3628</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Green-5N</td><td>Invitrogen</td><td>C3737</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker green FM</td><td>Invitrogen</td><td>M7514</td><td></td></tr><tr><td>Rhod-2, AM</td><td>Invitrogen</td><td>R1244</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>シグマ</td><td>M9546</td><td></td></tr>ショ<tr><td>糖</td><td>EMDミリポア</td><td>8510</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>シグマ</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>シグマ</td><td>E8145</td><td></td></tr>塩化<tr><td>カリウム</td>フィ<td>ッシャーBP366-500</td><td></td><td></td></tr>リン酸<tr><td>カリウム一塩基性</td><td>シグマ</td><td>P0662</td><td></td></tr>塩化<tr><td>マグネシウム</td><td>シグマ</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>L-リンゴ酸</td><td>シグマ</td><td>M1125</td><td></td></tr>塩化<tr><td>カルシウム</td>シ<td>グマ</td><td>C4901</td><td></td></tr>酢<tr><td>酸カリウム</td><td>フィッシャーBP364-500</td><td></td><td></td></tr>ア<tr><td>デノシン5&プライム;-三リン酸マグネシウム塩</td><td>シグマ</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>ホスホクレアチン二ナトリウム塩</td><td>シグマ</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>サポニン</td><td>シグマ</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>Ru360</td><td>カルビオケム</td><td>557440</td><td></td></tr></tbody></table>

ミトコンドリアの分離と培養細胞におけるミトコンドリアのカルシウム流入の解析

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Ca2 +ミトコンドリアによって処理細胞の広範なスペクトルでの生理学的および病態生理学的プロセスを調節する重要な機能です。Ca2 +ミトコンドリアからの流出や流入を正確に計測する能力は、ミトコンドリア Ca2 +これらのプロセスでの処理の役割を決定するため重要です。本報告では、ミトコンドリアの Ca2 +ハンドリング分離ミトコンドリアや培養細胞での測定のための 2 つの方法を提案する.我々 はまず、Ca2 +敏感な染料カルシウム グリーン-5N を使用してミトコンドリアの Ca2 +吸収を測定プレート リーダー ベースのプラットフォームを詳しく説明します。プレート リーダー ベースの形式は、特殊な装置の必要性を回避し、カルシウム グリーン 5N 色素は Ca2 +分離組織のミトコンドリアからの測定に最適です。アプリケーションでは、マウス心臓組織から分離されたミトコンドリア ミトコンドリアの Ca2 +吸収の測定について説明します。ただし、肝臓、骨格筋、脳など他の組織から分離されたミトコンドリア ミトコンドリアの Ca2 +吸収を測定するこの手順を適用することができます。第二に、共焦点顕微鏡を用いたミトコンドリア Ca2 + Ca2 +敏感な染料ロード-午前/2 を使用して、2 次元レーザー走査型顕微鏡を用いたイメージング グリセリン細胞の測定の測定について述べる。この透過プロトコルは、ミトコンドリア Ca2 +での変更の特定の録音を可能にする細胞内色素汚染を排除します。また、レーザ走査型顕微鏡高フレーム レートのミトコンドリア Ca2 +に様々 な薬や試薬の外部のソリューションの適用応答で急激な変化をキャプチャすることができます。このプロトコルは、初代培養細胞不死化細胞株や神経細胞、心筋細胞などを含む多くの細胞タイプのミトコンドリアの Ca2 +吸収を測定に適用できます。

図 1ミトコンドリア Ca2 +取り込み測定プレート リーダー ベースのプラットフォームを使用して分離心筋ミトコンドリアで、Ca2 +カルシウム グリーン-5N を染めます。制御条件 (図 1 a) 心筋ミトコンドリアいたカルシウム グリーン-5N を含む KCl バッファー中に浮遊し、30 の追加 CaCl2 (0.6 mM CaCl2ソリューションの 5 μ L) の連続したパルスを挑戦し s、150 s, 300 s, 480s、および 690 秒時点。ユーザーによって追加された Ca2 +後の追加前に完全なミトコンドリアの取り込みを可能にするのにはタイミングと CaCl2追加の数を調整できます。このアッセイ カルシウム グリーン 5N 信号の増加は、上昇バッファー Ca2 +レベルを反映していま...

ここでは、ミトコンドリアの分離および培養細胞のミトコンドリアの Ca2 +流入の測定のための 2 つのプロトコルを提案する.我々 のプレート リーダー ベース Ca2 +インポート詳細分離ミトコンドリアの試金を使用して、Ca2 +敏感なカルシウム グリーン-5N を染めます。培養細胞の Ca2 +染料ロード-2/AM を用いた共焦点顕微鏡法について述べる。

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

この手順の全体的な目標は、単離されたミトコンドリアと培養細胞におけるミトコンドリアカルシウム流入を測定することです。この方法は、ミトコンドリアが細胞質カルシウムのランドスケープの形成にどのように役立つか、疾患状態におけるミトコンドリアカルシウム動態の役割など、カルシウムシグナル伝達分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、当社のプロトコルをミトコンドリアのカルシウム流入容量を評価するためのさまざまなモデルシステムに適応できることです。プレートリーダーベースのミトコンドリアカルシウム取り込み手順を実演します。また、小児科のインストラクターであるジョシュア・マクスウェル博士が、ミトコンドリアのカルシウム流入を測定するための共焦点顕微鏡ベースの手順を実演します。この実験は、以前に分離された心臓を25ミリリットルの氷冷one-X PBSで徹底的にすすぎ、血液が心室から完全に絞り出されることを確認することから始めます。氷のように冷たい5ミリリットルのone-X PBSで、鋭利なハサミを使用して、心臓組織を細かく刻みます。PBSを慎重に廃棄し、組織を事前に冷却した7ミリリットルのガラステフロンダウンスホモジナイザーに移します。次に、氷冷したMSEGTAバッファーを5ミリリットル加え、組織片が見えなくなるまで均質化します。ホモジネートを15ミリリットルのチューブに移し、その後、摂氏4度でGの600倍で5分間遠心分離して、不要な核と壊れていない細胞をペレット化します。上清を新鮮な15ミリリットルのチューブに移し、摂氏4度でGの10, 000倍で10分間遠心分離します。上清を捨てた後、ミトコンドリアペレットを氷の上に保ちます。ペレットを洗浄するには、5ミリリットルの氷冷MSEGTA緩衝液を加え、再懸濁してから、摂氏4度でGの10,000倍で10分間遠心分離します。上清を捨てた後、洗浄を繰り返し、ペレットを氷の上に保ちます。プレートリーダーを使用してミトコンドリアカルシウム取り込み測定を開始するには、リーダーをプログラムして、Calcium Green-5N蛍光の動的読み取りを毎秒、合計1, 000秒実行します。試薬インジェクターをプログラムして、さまざまな時点で5マイクロリットルの塩化カルシウム溶液を分注します。次に、使用する塩化カルシウム溶液をインジェクターにプライミングします。次に、200マイクログラムの単離ミトコンドリアを96ウェルプレートの1ウェルに添加し、適量の塩化カリウム緩衝液を添加して、総容量197マイクロリットルを達成します。次に、1モルピルビン酸1マイクロリットル、500ミリモルリンゴ酸1マイクロリットル、および1ミリモルカルシウムグリーン-5Nストック1マイクロリットルを加え、ピペッティングで穏やかに混合します。光から保護して室温で2分間インキュベートし、ミトコンドリアが活性化します。最後に、事前にプログラムされたキネティックプロトコルを開始し、Calcium Green-5N蛍光をモニターします。プロトコルのこの部分では、20 マイクロリットルの Rhod-2 AM、0.2 マイクロリットルの MitoTracker Green、2.5 マイクロリットルの 20% プルロン酸 F-127、および 1 ミリリットルの Tyrode 溶液を混合して、Rhod-2 AM MitoTracker Green 作業溶液を準備します。NIH/3T3細胞を播種したあらかじめ調製したカバースリップに、Rhod-2 AM MitoTracker Green溶液を覆うまで滴下します。細胞に色素をロードするには、光から保護されたカバーガラスを室温で30分間インキュベートします。Rhod-2 AMを脱エステル化するには、Rhod-2 AM MitoTracker Green溶液を静かに除去し、約300マイクロリットルの新鮮なTyrode溶液と交換して細胞を覆います。遮光したカバーガラスを室温で30分間インキュベートします。次に、カバーガラスを顕微鏡イメージングチャンバーに移し、チャンバーに洗浄液を充填します。焦点を調整して、40倍の倍率で細胞と位相差を観察します。Rhod-2 AM MitoTracker Greenロード細胞の原形質膜を透過処理するには、カバーガラスから洗浄液を取り出し、約300マイクロリットルの透過処理溶液と交換して細胞を覆います。このプロセスでは、原形質膜の形態を監視します。透過処理すると、細胞は表面が粗くなります。完全透過化後すぐに透過化溶液を取り出し、カルシウムゼロの内服液と交換してください。次に、Rhod-2とMitoTracker Greenの明確な共局在を示す透過処理細胞に焦点を当て、Rhod-2とMitotracker Greenの蛍光を同時にイメージングします。次に、顕微鏡のレーザーとゲイン設定を下げて、ミトコンドリアのRhod-2蛍光を暗くし、ほとんど見えないようにします。ミトコンドリアのカルシウム変化の動態を捉えるには、適切なフレームレートと時間経過で2次元スキャンを取得するための顕微鏡設定を選択します。カルシウムゼロの内部溶液を取り出し、細胞や顕微鏡の焦点を乱さないようにしてから、画像取得を開始します。シリンジを使用して、カルシウムを豊富に含む内部溶液を10秒の時点で手動で追加します。最後に、画像取得ソフトウェアで、Rhod-2 と MitoTracker Green シグナルの共局在領域を含む関心領域を選択します。単離された心臓ミトコンドリアに塩化カルシウムを添加すると、ミトコンドリアが緩衝蛍光からカルシウムを取り込み、カルシウム色素からの蛍光が増加します。しかし、カルシウムの第3版では、ミトコンドリアのカルシウム過剰とミトコンドリアの透過性遷移孔の開口部を示す低下後に突然蛍光が増加し始め、ミトコンドリアの内膜透過化につながる可能性があります。一方、ミトコンドリアにミトコンドリアカルシウム取り込み阻害剤を前処理すると、カルシウムが添加されるたびに蛍光が増加します。NIH/3T3細胞の培養では、ミトコンドリアネットワークをMitoTracker Green色素で染色します。細胞もRhod-2色素で染色し、サポニン透過化後、細胞質のRhod-2を洗い流し、ミトコンドリア染色のみを残してMitoTrackerと共局在します。Rhod-2は非ミトコンドリア構造に蓄積する可能性があるため、MitoTrackerとRhod-2が共局在する領域のみに焦点を当てて分析する必要があります。カルシウムの添加は、対照細胞におけるRhod-2蛍光の増加を引き起こすが、ミトコンドリアカルシウム取り込み阻害剤で処理された細胞では、蛍光に変化はない。これらのプロトコルは、不死化細胞株の心筋細胞やニューロンなどの初代細胞や、心臓、肝臓、脳などの多くの組織タイプから単離されたミトコンドリアを含む多くの細胞タイプにおけるミトコンドリアカルシウムの取り込みを測定するために適用できます。ミトコンドリアによるカルシウムの取り扱いは、さまざまな細胞の生理学的および病態生理学的プロセスの両方を調節する重要な機能です。ミトコンドリアからのカルシウムの流入を正確に測定する能力は、これらのプロセスにおけるミトコンドリアのカルシウム処理の役割を決定する上で重要な部分です。このビデオを見れば、単離されたミトコンドリアと培養細胞におけるミトコンドリアのカルシウム流入を測定する方法について十分に理解できるはずです。

analyses-mitochondrial-calcium-influx-isolated-mitochondria-cultured

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

このプロトコルは、蛍光イメージングによるミトコンドリアのカルシウムフラックスのリアルタイム測定のための方法を説明します。方法は、選択的にミトコンドリアで発現する循環permutated YFPベースのデュアル励起レシオメトリックカルシウムセンサー（レシオメトリックpericam -...

遺伝的にコードされたカルシウムのセンサを用いたアポトーシス時のミトコンドリア内カルシウム濃度の動的変更の監視

単離ミトコンドリアマウス心臓におけるミトコンドリア透過性遷移孔の開口部を測定するための分光蛍光プロトコルがここに提示されます。アッセイは、ミトコンドリアCaの同時測定を含む...

単離ミトコンドリアマウス心臓における透水性遷移孔の開口部のマルチパラメータ測定

このビデオでは、単離されたミトコンドリアにおけるミトコンドリアカルシウムの取り込みを測定するためのプレートリーダーベースのアッセイについて説明しています。このアッセイは、カルシウム感受性蛍光色素の蛍光シグナルを解析し、ミトコンドリアのカルシウム取り込みとカルシウム過剰の動態を研究します。...

ミトコンドリアカルシウム取り込みアッセイ:単離されたミトコンドリアにおけるカルシウム取り込みを測定するためのプレートリーダーベースの方法

このビデオでは、培養細胞におけるミトコンドリアカルシウムの取り込みを測定するための共焦点顕微鏡イメージングベースのアッセイについて説明しています。このアッセイでは、カルシウム感受性蛍光色素Rhod-2/AMを使用して、透過処理された培養細胞のミトコンドリアカルシウムを測定します。...

培養細胞におけるミトコンドリアカルシウム取り込みを測定するためのカルシウム注入アッセイ

このビデオは、ミトコンドリアがカルシウムを吸収する際の蛍光のリアルタイムな変化を監視することにより、ミトコンドリアのカルシウム保持能力を評価する手順を示しています。このアッセイは、ミトコンドリアの機能や、アポトーシスや神経変性疾患などのカルシウム関連プロセスの研究に役立ちます。...

単離されたミトコンドリアのカルシウム保持能力の決定

本稿では、生理学的に定義された生物試料中の細胞下解像度で、全カルシウム含有量や分布を定量的に測定するcryoanalytical電子顕微鏡の応用について説明しています。...

電子プローブX線マイクロアナリシスによるニューロンにおける総カルシウムの測定

サンプル間のミトコンドリア膜電位の比較は、細胞の状態に関する貴重な情報をもたらします。ミトコンドリアを単離し、蛍光を使用して阻害剤およびアンカプラーに対する反応を評価するための詳細な手順について説明します。このプロトコルの方法と有用性は、細胞培養と細胞ストレスの動物モデルの使用によって説明されています。...

培養細胞およびマウス組織から単離とミトコンドリアの機能解析

ミトコンドリアは、それらが細胞内の細胞質ゾルのCa 2+シグナル伝達を形成することができ、カルシウム（Ca 2+）隔離する彼らの内膜（ΔΨm）を横切って電気化学ポテンシャルを利用することができます。我々は、同時に、蛍光色素、共焦点顕微鏡を使用して、生細胞中のミトコンドリアの Ca 2+取り込みおよびΔΨmを測定するための方法を記載します。...

蛍光顕微鏡による生細胞内のミトコンドリアのカルシウムとミトコンドリア膜電位の同時測定

このプロトコルが Ca2 +保持能力と Ca2 +を調べる方法を説明することを目的 - トリガー SH SY5Y 分離ミトコンドリアの膨潤ミトコンドリア細胞ステップバイ...

ミトコンドリアの Ca2 +保持容量測定と Ca2 +-ミトコンドリアの膨潤アッセイをトリガー

このプロクトーコルは、アストロサイトおよびニューロン におけるインビトロ および インビボ ミトコンドリアCa2+...

遺伝子組み換えCa2+ 指標(GEC)を用いたアストロサイトとニューロンのイメージングミトコンドリアCa2+ 取り込み

この方法は、低コンダクタンスプロトンリークに対するミトコンドリア透過性遷移細孔の寄与を利用して、野生型対照と比較して心筋細胞ミトコンドリアコエンザイムQ含量が増加した新生児脆弱X症候群マウスにおける細孔開放の電圧閾値を決定する。...

コエンザイムQ過剰の設定におけるミトコンドリア透過性転移細孔の開放確率の評価

学ぶミトコンドリアのカルシウム流入測定法。プレートリーダーと共焦点顕微鏡を用いて、分離ミトコンドリアと培養細胞におけるカルシウム動態を解析する。神経科学や細胞生物学の研究に応用可能です。

ミトコンドリアの分離と培養細胞におけるミトコンドリアのカルシウム流入の解析

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