ミトコンドリアの分離と培養細胞におけるミトコンドリアのカルシウム流入の解析

この手順の全体的な目標は、単離されたミトコンドリアと培養細胞におけるミトコンドリアカルシウム流入を測定することです。この方法は、ミトコンドリアが細胞質カルシウムのランドスケープの形成にどのように役立つか、疾患状態におけるミトコンドリアカルシウム動態の役割など、カルシウムシグナル伝達分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、当社のプロトコルをミトコンドリアのカルシウム流入容量を評価するためのさまざまなモデルシステムに適応できることです。

プレートリーダーベースのミトコンドリアカルシウム取り込み手順を実演します。また、小児科のインストラクターであるジョシュア・マクスウェル博士が、ミトコンドリアのカルシウム流入を測定するための共焦点顕微鏡ベースの手順を実演します。この実験は、以前に分離された心臓を25ミリリットルの氷冷one-X PBSで徹底的にすすぎ、血液が心室から完全に絞り出されることを確認することから始めます。

氷のように冷たい5ミリリットルのone-X PBSで、鋭利なハサミを使用して、心臓組織を細かく刻みます。PBSを慎重に廃棄し、組織を事前に冷却した7ミリリットルのガラステフロンダウンスホモジナイザーに移します。次に、氷冷したMSEGTAバッファーを5ミリリットル加え、組織片が見えなくなるまで均質化します。

ホモジネートを15ミリリットルのチューブに移し、その後、摂氏4度でGの600倍で5分間遠心分離して、不要な核と壊れていない細胞をペレット化します。上清を新鮮な15ミリリットルのチューブに移し、摂氏4度でGの10, 000倍で10分間遠心分離します。上清を捨てた後、ミトコンドリアペレットを氷の上に保ちます。

ペレットを洗浄するには、5ミリリットルの氷冷MSEGTA緩衝液を加え、再懸濁してから、摂氏4度でGの10,000倍で10分間遠心分離します。上清を捨てた後、洗浄を繰り返し、ペレットを氷の上に保ちます。プレートリーダーを使用してミトコンドリアカルシウム取り込み測定を開始するには、リーダーをプログラムして、Calcium Green-5N蛍光の動的読み取りを毎秒、合計1, 000秒実行します。

試薬インジェクターをプログラムして、さまざまな時点で5マイクロリットルの塩化カルシウム溶液を分注します。次に、使用する塩化カルシウム溶液をインジェクターにプライミングします。次に、200マイクログラムの単離ミトコンドリアを96ウェルプレートの1ウェルに添加し、適量の塩化カリウム緩衝液を添加して、総容量197マイクロリットルを達成します。

次に、1モルピルビン酸1マイクロリットル、500ミリモルリンゴ酸1マイクロリットル、および1ミリモルカルシウムグリーン-5Nストック1マイクロリットルを加え、ピペッティングで穏やかに混合します。光から保護して室温で2分間インキュベートし、ミトコンドリアが活性化します。最後に、事前にプログラムされたキネティックプロトコルを開始し、Calcium Green-5N蛍光をモニターします。

プロトコルのこの部分では、20 マイクロリットルの Rhod-2 AM、0.2 マイクロリットルの MitoTracker Green、2.5 マイクロリットルの 20% プルロン酸 F-127、および 1 ミリリットルの Tyrode 溶液を混合して、Rhod-2 AM MitoTracker Green 作業溶液を準備します。NIH/3T3細胞を播種したあらかじめ調製したカバースリップに、Rhod-2 AM MitoTracker Green溶液を覆うまで滴下します。細胞に色素をロードするには、光から保護されたカバーガラスを室温で30分間インキュベー

Rhod-2 AMを脱エステル化するには、Rhod-2 AM MitoTracker Green溶液を静かに除去し、約300マイクロリットルの新鮮なTyrode溶液と交換して細胞を覆います。遮光したカバーガラスを室温で30分間インキュベートします。次に、カバーガラスを顕微鏡イメージングチャンバーに移し、チャンバーに洗浄液を充填します。

焦点を調整して、40倍の倍率で細胞と位相差を観察します。Rhod-2 AM MitoTracker Greenロード細胞の原形質膜を透過処理するには、カバーガラスから洗浄液を取り出し、約300マイクロリットルの透過処理溶液と交換して細胞を覆います。このプロセスでは、原形質膜の形態を監視します。

透過処理すると、細胞は表面が粗くなります。完全透過化後すぐに透過化溶液を取り出し、カルシウムゼロの内服液と交換してください。次に、Rhod-2とMitoTracker Greenの明確な共局在を示す透過処理細胞に焦点を当て、Rhod-2とMitotracker Greenの蛍光を同時にイメージングします。

次に、顕微鏡のレーザーとゲイン設定を下げて、ミトコンドリアのRhod-2蛍光を暗くし、ほとんど見えないようにします。ミトコンドリアのカルシウム変化の動態を捉えるには、適切なフレームレートと時間経過で2次元スキャンを取得するための顕微鏡設定を選択します。カルシウムゼロの内部溶液を取り出し、細胞や顕微鏡の焦点を乱さないようにしてから、画像取得を開始します。

シリンジを使用して、カルシウムを豊富に含む内部溶液を10秒の時点で手動で追加します。最後に、画像取得ソフトウェアで、Rhod-2 と MitoTracker Green シグナルの共局在領域を含む関心領域を選択します。単離された心臓ミトコンドリアに塩化カルシウムを添加すると、ミトコンドリアが緩衝蛍光からカルシウムを取り込み、カルシウム色素からの蛍光が増加します。

しかし、カルシウムの第3版では、ミトコンドリアのカルシウム過剰とミトコンドリアの透過性遷移孔の開口部を示す低下後に突然蛍光が増加し始め、ミトコンドリアの内膜透過化につながる可能性があります。一方、ミトコンドリアにミトコンドリアカルシウム取り込み阻害剤を前処理すると、カルシウムが添加されるたびに蛍光が増加します。NIH/3T3細胞の培養では、ミトコンドリアネットワークをMitoTracker Green色素で染色します。

細胞もRhod-2色素で染色し、サポニン透過化後、細胞質のRhod-2を洗い流し、ミトコンドリア染色のみを残してMitoTrackerと共局在します。Rhod-2は非ミトコンドリア構造に蓄積する可能性があるため、MitoTrackerとRhod-2が共局在する領域のみに焦点を当てて分析する必要があります。カルシウムの添加は、対照細胞におけるRhod-2蛍光の増加を引き起こすが、ミトコンドリアカルシウム取り込み阻害剤で処理された細胞では、蛍光に変化はない。

これらのプロトコルは、不死化細胞株の心筋細胞やニューロンなどの初代細胞や、心臓、肝臓、脳などの多くの組織タイプから単離されたミトコンドリアを含む多くの細胞タイプにおけるミトコンドリアカルシウムの取り込みを測定するために適用できます。ミトコンドリアによるカルシウムの取り扱いは、さまざまな細胞の生理学的および病態生理学的プロセスの両方を調節する重要な機能です。ミトコンドリアからのカルシウムの流入を正確に測定する能力は、これらのプロセスにおけるミトコンドリアのカルシウム処理の役割を決定する上で重要な部分です。

このビデオを見れば、単離されたミトコンドリアと培養細胞におけるミトコンドリアのカルシウム流入を測定する方法について十分に理解できるはずです。