ヒトの膵島抗体の電気化学発光アッセイ

この電気化学発光アッセイの全体的な目標は、自己免疫性1型糖尿病の膵島アツト抗体を高感度かつ高い特異性で検出することです。この方法は、膵島自己免疫の開始時期や1型糖尿病の高リスク予測など、1型糖尿病分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、現在の標準的な放射線アッセイと比較して、より感度が高く、疾患特異的で、非放射性であることです。

この技術の意味は、これらの膵島自己抗体が症候性臨床疾患の数か月から数年前に現れるため、1型糖尿病の予測と診断にまで及びます。この方法は、1型糖尿病の予測に関する洞察を提供することができますが、セリアック病のトランスグルタミナーゼに対する自己抗体から、自己免疫性甲状腺疾患のTPOおよびサイログロブリンなど、他の自己免疫疾患の研究にも適用できます。この手法のアイデアが最初に浮かんだのは、この技術が高感度で非放射能に基づいていることを発見したときでした。

従来のELISA法とは対照的に、膵島自己抗体の検出にはうまく機能しません。血清酸治療を伴うインスリン自己抗体アッセイはテキストで説明するのが難しいため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。その手順を実演するのは、私の研究室のポスドクであるYong Guです。

まず、ヒト膵島自己抗原とビオチンまたはSULFO-TAGをチューブ内で1〜5モル比で混合します。また、両方のタグが感光性であるため、チューブをアルミホイルで覆います。その後、チューブを室温で1時間インキュベートします。

その間、インキュベーションが進行しているときは、スピンカラムに2重リン酸緩衝生理食塩水を供給します。次に、カラムを重力の1, 000倍で毎回2分間遠心分離します。次に、スピンカラム内の自己抗原タグ混合物を1, 000倍の重力で2分間遠心分離します。

次に、標識された抗原を分注し、摂氏マイナス80度で保存します。次に、抗原バッファーのチェッカーボードアッセイに基づいて、ビオチンSULFO-TAG標識抗原の合理的な濃度を使用して、96ウェルプレートあたり3ミリリットルの抗原溶液を調製します。次に、各ウェルに4マイクロリットルの血清を加え、1倍リン酸緩衝生理食塩水で最終容量を20マイクロリットルに調整します。

次に、各ウェルに20マイクロリットルの標識抗原溶液を加えます。そして、プレートをシーリングホイルで覆い、光を防ぎます。その後、プレートを室温のシェーカーに2時間移します。

シェーカーが止まったら、プレートを摂氏4度で冷蔵庫に18〜24時間放置します。次に、各サンプルについて15マイクロリットルの血清と18マイクロリットルの0.5モル酢酸を混合し、室温で45分間インキュベートします。チェッカーボードアッセイに基づいて、ビオチンSULFO-TAG標識抗原の合理的な濃度を使用して抗原溶液を調製します。

次に、新しいPCRプレートの各ウェルに35マイクロリットルの抗原緩衝液を分注します。血清混合物のインキュベーションが完了する直前に、抗原プレート上の各ウェルの横に沿って、PH 9で3.8マイクロリットルの1モルTrisバッファーを追加します。インキュベーションが終了したら、抗原プレートの各ウェルに25マイクロリットルの酢酸処理血清を迅速に移し、溶液を攪拌します。

次に、光を避けるためにPCRプレートをシーリングホイルで覆い、室温で2時間シェーカーに置きます。完了したら、プレートを4°Cで冷蔵庫に移し、18〜24時間インキュベートします。ストレプトアビジンプレートを4°Cで冷蔵庫から取り出し、プレートを室温に戻します。

ストレプトアビジンプレートが室温に達した後、各ウェルに150マイクロリットルの3%ブロッカーAを加え、PCRプレートをシーリングホイルで覆い、冷蔵庫で一晩インキュベートします。翌日、ストレプトアビジンプレートを冷蔵庫から取り出し、バッファーをウェルから排出します。次に、プレートを逆さまにしてペーパータオルの上に置き、残りのバッファーを浸して乾かします。

次に、1フォールドPBSTバッファー150マイクロリットルを加えてウェルを洗浄し、3回連続して洗浄します。次に、ストレプトアビジンプレートの各ウェルで30マイクロリットルの血清抗原をインキュベートし、光を避けるためにプレートをホイルで覆います。次に、プレートを室温のシェーカーに1時間移します。

1時間後、血清抗原を廃棄し、プレートからインキュベートし、150マイクロリットルの1フォールドPBSTバッファーを加えてウェルを3回洗浄します。洗浄が終わったら、各ウェルに150マイクロリットルの読書バッファーを追加して、プレートリーダーで読み取ります。未知のサンプルを分析する前に、各自己抗体アッセイのアッセイカットオフを設定し、約100人の1型糖尿病患者と約100人の健康な対照者を試験しました。

次に、ROC曲線をプロットして、GADAアッセイの正常上限の最適な指数である0.023を決定し、最高の感度と特異度を得ました。次に、未知のサンプルの結果は、高陽性、低陽性、および陰性の制御標準から導出された式を使用して計算されました。次に、酸処理の存在下と非存在下でインスリンモノクローナル抗体を正常なヒト血清とインキュベートすることについて、膵島オートアチボディアッセイで得られたシグナルを決定するためにグラフをプロットしました。

プロットは、酸処理がない場合に正常な血清を添加すると、シグナルが著しくブロックされることを示しています。それどころか、インスリンモノクローナル抗体とのインキュベーション前に血清を酸処理した場合、得られるシグナルは比較的高くなります。同様のグラフもプロットして、酸治療の存在下と非存在下で外国の患者血清を使用して得られた信号を決定しました。

抗体とのインキュベーション前に患者血清を酸で治療すると、治療がない場合と比較して、膵島自己抗体アッセイのシグナルが大幅に増加します。この手法を習得すると、適切に準備されていれば、1日で数百のサンプルを簡単に行うことができます。この手順を試行する際は、アッセイ条件を最適化するために、各自己抗体アッセイに対してチェッカーボードアッセイを実行することを忘れないでください。

開発後、この技術は、自己免疫性1型糖尿病の研究者が予測と予防のための道を開きました。このビデオを見れば、このアッセイをいかに簡単に実行できるかを十分に理解できるはずです。血清サンプルの取り扱いは危険で伝染性があることを忘れないでください。

この手順を実行するときは、直接皮膚に触れないように常に予防措置を講じる必要があります。