ピン分離側壁を持つ再構成可能なマイクロ流路

この手順の全体的な目標は、ピンの配列で構成された側壁を持つリコンフィギャラブルマイクロ流体デバイスを作製することです。このマイクロ流体デバイスの主な利点は、流路設計段階ではわからない可能性のある流れにくい物体や状況に対処できることです。一般的に、この方法に不慣れな個々の人は、犬の骨の形に小さなピンをエッチングするのに苦労します。

多くのマイクロ流体部品の組み立てとベースへの取り付けは、書かれたプロトコルだけでは習得が難しいため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。この写真は、リコンフィギャラブルチャネルを備えた完成したマイクロ流体デバイスです。ここでは、リコンフィギャラブルな部分は画像の上部に沿っています。

分解図の概略図は、その主要なコンポーネントの一部を明らかにします。特に、マイクロチャネルとそれを再構成するために使用されるピンに注意してください。最初のステップとして、ピンをエッチングします。

脱脂した厚さ0.3mmのL字型のステンレス製ピンから始めます。4ミリリットルの10%硝酸を用意し、ピンを浸します。次に、容器を摂氏65度のオーブンに30分間入れます。

ピンを取り出したら、ピンセットで1つずつ脱イオン水の容器に移します。次に、それらを水中で5分間超音波処理します。終わったら、ペーパータオルで乾かします。

0.5ミリリットルの離型剤を用意し、ピンを浸します。2時間後、ピンを脱イオン水に入れ、5分間超音波処理します。継続するにはエッチング皿が必要です。

エッチング皿はガラスとシリコーン接着剤で構成されています。エッチングプロセスを開始するには、皿のピン端にシリコーン接着剤を塗布します。ピンの直線端の先端が接着剤に浸るようにピンを配置します。

これは、すべてのピンが所定の位置に配置され、次のステップの準備ができた後の皿です。エッチング皿を摂氏38度に加熱した加湿発酵槽に移し、接着剤が硬化するまで一晩待ちます。準備ができたら、ピン付きのエッチング皿を摂氏65度のホットプレートに置きます。

ピンの覆われていない領域に0.8ミリリットルのエッチング酸を注ぎます。10分後、マイクロピペッターを使用して酸をビーカーに移します。次に、皿にエッチング酸をさらに追加して、エッチング手順を繰り返します。

エッチング後、エッチング領域の幅が約0.2mmであることを確認してください。その場合は、5ミリリットルの重炭酸ナトリウム溶液をエッチング皿にマイクロピペットで注入し、残りの酸を中和します。次に、ピンセットを使用して、縦方向に引っ張ってピンを取り外します。

まずは製作した金型から製作します。この図のように、金型は固定された側壁とピン用のスペースを持つデバイス用です。リソグラフィーを使用してスライドガラス上に金型を作成します。

準備したスライドをプラスチック皿の底に置きます。次に、PDMSのプレポリマーを金型に3mmの厚さで流し込みます。皿を真空デシケーターに10分間入れます。

その後、65°Cのオーブンに1時間ほど移します。その結果、部分的に硬化したスラブが得られます。メスを使用して、次の手順のためにスラブを型から外します。

スラブを摂氏120度のオーブンに1時間入れて、完全に硬化させます。次に、完全に硬化したスラブで作業します。ガイドラインパターンに沿って不規則なエッジがあります。

メスを使用して、不規則なエッジを正確かつきれいにトリミングします。ピン挿入スロットの表面には特に注意を払い、最適なデバイスを作成します。メインチャンバーの入口/出口やその他の場所には、生検パンチを使用して穴を開けます。

次に、マイクロチャネルアセンブリを作製します。洗浄液を60°Cに加熱し、4番のカバーガラスを用意します。カバーガラスのサイズは 10 mm x 20 mm です。

カバーガラスを溶液に10分間浸します。すすぎ乾燥させたカバーガラスとPDMSスラブをスパッタコーターの下部電極に置きます。30秒間、空気真空プラズマを発生させます。

取得したアイテムを接着して、エッジが揃い、チャネルの特徴がカバーガラスを通して見えるようにします。滅菌容器を使用して、接着された層を層流フードに運び、滅菌します。完了したら、ピンをスロットに挿入します。

隣接するピンの長さは異なる必要があります。ピンはマイクロチャンバーのもう一方の側壁を形成します。層流フードでの作業を続けます。

次のステップでは、デバイス用のベースを準備します。白色ワセリンとポリテトラフルオロエチレン粉末の混合物を均質化することにより、ギャップフィラーを調製します。均質化された混合物をディスペンサーシリンジに注ぎ、プランジャーを挿入します。

プランジャーを押してシリンジの先端を埋めます。次に、針を取り付け、針がいっぱいになるまでプランジャーを押します。同様の方法でシリコーン接着剤を使用した2番目のシリンジを準備し、それぞれを空気圧ディスペンサーに接続します。

次に、シリコーン接着剤をベースに塗布します。ポケットの1つに沿わせます。次に、ポケットに4番のカバーグラスを置き、しっかりと押して接着します。

次に、ベースの2つの外側のスロットに沿って、約1ミリメートルの深さのセグメントを描画することにより、シリコーン接着剤をディスペンスします。中央の別のスロットに沿って、ギャップフィラーを深さ1ミリメートルのセグメントに分配します。もう一方のポケットの端に接着剤を塗ります。

マイクロチャネルアセンブリをポケットに置き、しっかりと押します。もう一度、ベースの中央に沿ったスロットにギャップフィラーを入れます。これに続いて、隣接するスロットに接着剤を貼り付けます。

デバイスを滅菌フードで1日放置します。硬化後、層流フード内で、各ピンを隣接するピンに沿って最大1ミリメートル動かして、エラストマーバリアから解放します。イオン化水で緑色蛍光色素を希釈することにより、漏れの蛍光試験を設定します。

次に、マイクロチャネルを開いて、全体に一貫した幅を確保します。マイクロピペットを使用して、マイクロチャネルの一方の端ポートに色素を移し、溶液を充填します。大きなプラスチック皿に、脱イオン水で濡らした吸収紙2枚とデバイスを中に入れます。

皿を5%二酸化炭素で摂氏37度で少なくとも24時間インキュベートします。回収したデバイスを倒立型蛍光顕微鏡で観察し、画像を記録します。ピンの周囲に漏れがないことを確認するためにご使用ください。

これらの画像は、漏れているサンプルと漏れていないサンプルです。別のテストには、細胞の播種が含まれます。マイクロチャネルを開いて、側壁が全体的にできるだけ平らになるように、幅400ミクロンの直線チャネルを作成します。

セルサスペンションを1つのエンドポートに追加して、チャネルを充填します。細胞培養を開始する領域の側壁を定義するピンを見つけ、それらを閉じると領域内の細胞を囲みます。領域の近くから始めて、チャネル内のセルを排出するために、すべてのピンを閉じます。

エンドポートからサスペンションを吸引した後、ミディアムを追加します。デバイスを濡れた吸収紙の入ったプラスチック容器に入れます。最低24時間インキュベートします。

囲まれた領域内のセルが1個あたり約10個あることを確認します。次に、ピンをゆっくりと引っ込めて、カルチャーエリアを広げます。これらの画像は、リコンフィギャラブルマイクロチャネルで増殖したCOS-7細胞のものです。

9日間でマイクロチャネルの培養領域を拡大しました。収集されたデータにより、セル数と密度を時間の関数としてプロットできます。青色のポイントと曲線の適合は、セル数用です。

赤い記号とフィットは密度を表しています。密度については、縦矢印は2日、5日、6日での細胞培養面積の拡大を示しています。密度は、同じカルチャ エリアに対して計算されます。

このビデオを見れば、小さなピンからマイクロ流体チャネルの漏れのない側壁を構築する方法をよく理解できるはずです。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば1週間で習得できます。この手順を試行する際には、プロトコルの各ステップを慎重かつ徹底的に行うことが重要です。

強酸での作業は非常に危険である可能性があるため、適切な量の中和剤の準備などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。これらの手順に続いて、より複雑な細胞培養を確立するために、液体を含む他の細胞を導入することができます。