耐久性のある遺伝子発現により一般的な頚動脈移植に頸静脈の家兎モデル

この方法は、静脈移植不全の病因に関する重要な質問に答えることができます。例えば、移植片の失敗のメディエーターを特定し、移植片の失敗を防ぐことを目的とした戦略をテストすることができます。この技術の主な利点は、静脈グラフト内皮における耐久性と安定性のある導入遺伝子発現を達成する能力です。

テキストプロトコルに従ってウサギに麻酔をかけた後、動物を胸骨のノッチから下顎の端まで剃ります。外科的セットアップが完了したら、電気焼灼を使用して、胸骨のノッチと下顎の間の正中線に沿って皮膚を切断します(長さは約7〜9センチメートル)。次に、切開部を開くためのタオルクランプを取り付けます。

正中線全体に沿って筋膜の下を鈍く解剖します。次に、電気焼灼を使用して、正中線に沿って解剖された筋膜層を切断します。次に、右側から始めて、気管を覆う胸骨舌骨筋と胸骨筋を解剖して、総頸動脈を露出させます。

次に、総頸動脈の4〜5センチメートルのセグメントとその大きな枝を周囲の組織から解放して慎重に解剖します。5-0シルク縫合糸を使用して、総頸動脈の大きな枝を結紮してから、縫合糸の遠位にある各枝を切断します。左総頸動脈の解剖を繰り返した後、組織保持鉗子を使用して皮下組織層を一時的に閉じます。

次に、外部頸静脈が露出するまで、右側の皮膚から表在筋膜を解剖します。外頸静脈の4〜5センチメートルのセグメントを解剖し、その枝を周囲の組織から解放します。5-0シルク縫合糸を使用して枝を結紮し、次に枝を切ります。

次に、両端の孤立した静脈を結紮し、頭蓋端を切断し、内腔をヘパリン化生理食塩水で洗い流します。静脈移植を行うには、血管クリップを使用して、孤立したセグメントの頭蓋端で右総頸動脈をクランプします。次に、尾側の端に血管クリップを配置します。

次に、静脈セグメントの頭蓋端の直径と同じ長さの尾側クランプに対して、頭蓋側だけの尾側動脈切開術を行います。次に、尾側動脈切開術を通じてヘパリン処理された生理食塩水のシリンジに接続されたIVカテーテルを挿入し、頸動脈内腔を洗い流します。液体は動脈切開術を介して排出されます。

頸静脈に戻り、静脈を切除し、齲蝕動脈の隣に横たえます。7-0ポリプロピレン縫合糸のシングルステッチを使用して、尾側動脈切開術の尾側端を静脈セグメントの頭蓋端まで縫合します。次に、最初のステッチから180度2番目のステッチを配置して、尾側動脈切開術の頭蓋端を静脈セグメントの頭蓋端に縫合します。

吻合の外側の最初の2つのステッチから等距離のポイントに3番目のステッチを配置します。次に、最初の2つのステッチから等距離で、3番目のステッチの向かい側に、吻合の内側に4番目のステッチを配置します。1から4までの各ステッチの間に4つのステッチを追加で配置します。

遠位クリップの尾側で頭蓋動脈切開術を行います。頭蓋動脈切開術の頭蓋端と尾動脈切開術の尾側端との間の距離は、静脈セグメントの長さと同じである必要があります。頭蓋動脈切開術の長さは、静脈セグメントの尾側端の直径に等しくなります。

静脈を吻合部から頸動脈に沿って頭蓋状に伸ばした状態で、静脈がねじれていないことを確認します。次に、ヘパリン処理された生理食塩水を使用して、頭蓋動脈切開術を介して頸動脈と静脈を洗い流します。次に、頭蓋動脈切開術の尾側端を静脈セグメントの尾側端に縫合するために最初のステッチを配置します。

次に、最初のステッチから180度に2番目のステッチを配置して、頭蓋動脈切開術の頭蓋端を静脈セグメントの尾側端まで縫合します。ビデオの前半で示したように、吻合を完了します。頭蓋クリップを一時的に解放して、静脈移植片が血液で満たされるようにし、乾いたガーゼで穏やかな圧力をかけて出血を止めます。

吻合が出血しなくなるまで、この手順を繰り返します。次に、頭蓋クリップと尾側クリップの両方を取り外します。ガーゼを使用して、吻合部での追加の出血を止めます。

3-0シルク縫合糸を使用して、吻合部の間の総頸動脈セグメントの両端を結紮します。次に、頸動脈を合字の中間に分割します。活発な脈動が静脈グラフトに見られるはずです。

左側で静脈グラフトの配置を繰り返します。5-0 PGA縫合糸で、連続パターンで皮下組織を閉じます。次に、3-0 PGA縫合糸を使用して皮内パターンで皮膚を閉じ、両端の結び目を埋めます。

術後ケアと経皮的超音波検査をテキストプロトコルに従って実施します。遺伝子導入手術を行うには、移植片に隣接する頸動脈の1.5〜2センチメートルを含む右静脈移植片を頭蓋側と尾側の両方で慎重に分離します。同様に左側で解剖を繰り返します。

正常な生理食塩水を使用して右側の外科的創傷腔を埋め、音波の伝達を可能にします。2mm血管周囲流量プローブを体積流量計に接続し、創傷腔内の生理食塩水にプローブを浸します。流量をゼロに設定します。

フロープローブを頸動脈の周囲、静脈グラフトの尾側または頭蓋側に配置します。次に、電子データ収集システムを使用して、フロープローブからのデータを記録します。IVカテーテルを介してウサギにヘパリンを注入し、生理食塩水で洗い流した後、血管クリップを使用して、静脈グラフトの頭蓋端で総頸動脈をクランプします。

次に、尾側吻合部から尾側約10ミリメートルの頸動脈に2番目のクリップを適用して、動脈切開のためのスペースを確保します。次に、静脈移植片のすぐ尾側にある頸動脈の周りに2本の絹のネクタイをゆるく配置します。次に、事前に準備した曲げた21ゲージの針を使用して、頸動脈尾側をグラフトに穿刺し、頭蓋のみを尾側血管クリップに穿刺します。

針を内腔に2回前後に進めて、内腔が透明であることを確認します。次に、針を慎重に引き出します。テキスト プロトコルに従って DMEM を使用したシリンジと IV カテーテルを準備した後、総頸動脈切開術に曲げ点まで挿入し、0.5 ミリリットルの DMEM を 2 回充填して静脈移植管内腔を洗浄します。

手袋をはめた指を使用して、グラフトの頭蓋端を軽く押して、DMEMをグラフトから取り外します。次に、移植片に沿って指をグラフトの尾側の端に向かって慎重にスライドさせ、動脈切開術によって管腔内容物を洗い流します。DMEMシリンジをカテーテルから取り外し、カテーテルを血管に残します。

ウイルス溶液の入ったシリンジを接続し、カテーテルに空気が入らないようにします。ゆるく結ばれた絹の結束バンドをカテーテルの先端の周りに来るまで動脈の下に動かしますが、締めないでください。0.03ミリリットルのウイルス溶液を注入して、残りのDMEMをカテーテルから押し出します。

次に、指を使用して、頭蓋から尾側に優しく押し込む静脈グラフト内腔からすべての液体を取り除きます。動脈とカテーテルの先端の周りの2本のタイを締めて、内腔を密閉します。次に、静脈が膨張するまでウイルス溶液を注入します。

注射器をガーゼの巣にそっと置きます。20分後、空の注射器を使用して、血管が崩壊するまで移植片からウイルス含有溶液を穏やかに吸引します。カテーテルを所定の位置に残したままシリンジを取り外します。

次に、絹の縫合糸を切断してほどき、カテーテルを血管から引き抜きます。次に、7-0ポリプロピレン縫合糸をXパターンで使用して、動脈切開を閉じます。次に、縫合糸の端をそっと引っ張り、2つの四角い結び目で結びます。

テキストプロトコルに記載されているように右静脈移植片の血流を回復した後、左側でウイルス注入を繰り返します。形質導入された移植片を採取するには、静脈移植片と総頸動脈を解剖し、前に示したように左側と右側の両方で流量測定を行います。3-0シルク縫合糸を使用して、右総頸動脈頭蓋を移植片に結紮します。

次に、3-0シルク縫合糸を使用して、頸動脈尾側を移植片に結紮します。隣接する頸動脈を各結紮と隣接する吻合部の間で分割することにより、右静脈移植片を切除します。次に、ウサギから静脈移植片を取り除き、生理食塩水を使用して内腔を洗い流します。

新しいオペレーターが達成しなければならない最初のマイルストーンは、最初の静脈移植手術とその後の遅延形質導入手術の両方の後に、一貫した静脈移植片の開存性です。静脈移植片が特許を取得した場合、超音波検査では、尾側から頭蓋への血流が活発な大きな血管が明らかになります。移植片は形質導入の3日後に採取され、切片に切断され、X-galで染色されました。

管腔表面の顔面イメージングでは、効率的な形質導入と不十分な形質導入を伴う静脈移植片が示されました。このプロットに示されているように、新しいオペレーターが形質導入した静脈移植片中のβガラクトシダーゼmRNAのレベルは、経験豊富なオペレーターが形質導入した静脈移植片中のβガラクトシダーゼmRNAのレベルと有意差はありませんでした。このプロトコルを実行するときは、吻合にかかる前に静脈移植片の頭蓋骨を尾側に戻すことを覚えておくことが重要です。

これは、静脈ボーラスによる血流の妨害を避けるために必要です。.これらの手術をマスターすると、静脈移植手術で約3時間、静脈移植遺伝子導入手術で約2時間、収穫手術で約45分で完了できます。このプロトコルではウイルスベクターや鋭利な物体を扱う必要があるため、適切なバイオセーフティと鋭利物の手順に従う必要があることを忘れないでください。