Name: 耐久性のある遺伝子発現により一般的な頚動脈移植に頸静脈の家兎モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 58 s
Description: 学ぶ頸静脈移植術による遺伝子治療法。家兎モデルを用いて耐久性のある遺伝子発現を達成し、血管移植片の病態メカニズムを解明する。遺伝子機能の長期的研究に有用な手法です。

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このプロトコルの重要なステップには、麻酔の管理、動脈/グラフト静脈の抗凝固、手術操作、グラフト静脈の血行動態の測定が含まれます。2 つの比較的長い操作 (二国間静脈グラフトの通常 3 〜 3.5 h および二国間移植伝達の 1.5 〜 2.5 h) を含む複数この生存手術モデルの麻酔の適切な管理が欠かせません。両方、粗野で、気管内挿管による麻酔を投与し、挿管を考える肯定的な圧力換気、無気肺を防止、生存を伝達術後改善し、関連付けられていることを発見した呼吸不全。ウサギは、挿管に挑戦しているし、気管挿管による気道外傷術後喘鳴を引き起こすことができます。しかし、課題と、挿管の合併症、周術期合併症と静脈グラフト手術に関連付けられている死亡のほとんどを排除するために支払うために小さな価格です。
抗凝固療法は生存の手術のいずれかの後に発生することができますグラフト静脈の血栓症を防ぐために不可欠です。血栓は、経皮的超音波検査時に特許 5-7 日術後静脈グラフト、収穫時特許ほぼ常に早期術後イベントに表示されます。最初の手術後、血栓症を防ぐために (すなわち。、静脈移植)、最初の外...

動脈硬化は、脂質蓄積と血管壁の炎症で血管内腔、心臓発作、ストロークおよび手足1,2の損失の縮小につながる慢性炎症性疾患です。経皮的介入 (e.g、血管形成術とステント留置術) と薬物療法 (e.g。、スタチン系薬剤と抗血小板薬のエージェント); アテローム性動脈硬化症の治療は、。ただし、彼らはしばしば冠動脈および末梢循環に重度の閉塞性疾患の両方の治療に効果的です。バイパス術、自家静脈セグメントを使用して深刻なびまん性冠動脈および末梢血管疾患3,4の患者を治療するための一般的な手順のままです。ただし、両方の冠は、移植を静脈し、末梢循環悪い長期開存率があります。冠循環の静脈グラフトが 1 年間で 50% 遮蔽の約 10-20% は 10 年5,6に遮蔽されました。末梢循環の静脈グラフト故障率、5 年間7時 30-50% です。
病気のサイトに正確に治療遺伝子産物を配信できるため、遺伝子治療は静脈グラフト障害の防止のための魅力的なアプローチです。したがって、多くの前臨床研究は静脈グラフト遺伝子療法8,9をテストしています。ただし、本質的にこれらの研究のすべては、早い時間 (2-12 週) のポイント10、11,12,13,14,15,の有効性を調べられます16,17. 遺伝子療法の介入が耐久性を提供できるという証拠はないと意識しております (年) 通常起因する新生内膜過形成や動脈硬化4後半の静脈グラフト障害に対する保護。グラフト静脈で耐久性のある遺伝子発現をでき、後半と初期の時点で遺伝子治療介入のテストによりメソッドを開発しました。耐久性のある遺伝子発現を成し遂げるためには、メソッドには、HDAd ベクトルと遅延伝達戦略が組み込まれています。HDAd ベクトル免疫18,19,によって導入された細胞の認識 (と拒絶)20,を防止するウイルスの遺伝子がないために長期の遺伝子発現を提供する21. 遅延伝達 (グラフト留置後実行される 28 日) は22移植後早期に発生する大量の処理中に導入された細胞の損失を防ぐことができます。
移植配置10、11,12,15,16 時静脈グラフトの伝達に依存して静脈の血管壁における治療導入遺伝子発現を達成する他の方法 ,17。連続的に測定したとき遺伝子発現のこのアプローチを使用してすばやく伝達22,23後低下します。したがって、このアプローチを用いた研究がほとんどない 4 週間を超えて有効性を評価すると、グラフト静脈後 12 週を超えて有効性を検討していません。これに対し、本方式による静脈グラフトと-同じような研究に基づいて動脈可能性がありますで実行される、少なくとも 24 数週間安定持続する遺伝子発現のはるかに長い22,24を続けています。その他静脈グラフト遺伝子療法の介入なしこの期間の遺伝子発現の安定を実現すると意識しております。
家兎モデルを使用して、本手法を開発しました。他の齧歯動物、ウサギ、使用したまたは静脈をテストするより大きい動物移植遺伝子療法10、11,12,15,16,17,25、 26。齧歯動物モデルと比較して、ウサギはより高くより厳格な規制要件が適用されます。しかしより大きい動物に比較 (e.g。、ブタおよび犬)、ウサギを購入し家にはるかに高価な、はるかに扱いやすい。ウサギ血管生理人間の血管のようにまた、27、彼らが経皮的介入28,29をテストするため使用することができます、彼らは十分な組織を提供する十分に大きい複数のエンドポイント (e.g。、組織学、タンパク質、RNA) 単一の血管標本22,30を使用して調べることができます。さらに、静脈グラフトのウサギは、高脂肪食にうんざりした、彼ら開発静脈移植動脈硬化31,32, 冠動脈バイパス静脈グラフト障害4,5 の一般的な原因であります。.これらの動脈硬化家兎静脈グラフトは、遺伝子治療の介入は、この方法をテストするための基板として使用できます。指定されたプロトコルは、ウサギ静脈グラフトにおける遺伝子発現の耐久性を達成するために必要な技術的なスキルを習得する捜査官を助けることができます。

<table><tbody><tr><td>Disposables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3mLシリンジ、24G針付き</td><td>Becton Dickinson</td><td>309571</td><td>2x、静脈移植手術用2倍、遺伝子導入用2倍&nbsp; 手術</td></tr><tr><td>1mLシリンジ、27G針</td>付き <td>Becton Dickinson</td><td>309623</td><td>静脈移植手術用2倍、遺伝子移植手術用5倍</td></tr><tr><td>19G針</td><td>Becton Dickinson</td><td>305187</td><td>Geneトランスファー手術</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 mL シリンジ、ルアーロック</td><td>Nipro Medical Corp</td><td>JD+20L</td><td></td></tr><tr><td>カテーテル、24Ga x 3/4 インチ</td><td>テルモメディカルプロダク</td>ツ<td>SROX2419V</td><td></td></tr><tr><td>21Gニードル</td><td>ベクトンディキンソン</td><td>305165</td><td>遺伝子導入手術および生理食塩水</td></tr><tr><td>ガーゼ4 "x 4"</td>の20mLシリンジ用<td>ダイナレックス</td><td>3242</td><td>~10-15 手術あたり</td></tr><tr><td>3-0 シルク縫合</td>糸 <td>Covidien Ltd.</td><td>S-244</td><td></td></tr><tr><td>5-0 シルク縫合</td>糸 <td>Covidien Ltd.</td><td>S-182</td><td></td></tr><tr><td>7-0 ポリプロピレン縫合</td>糸 <td>CP Medical</td><td>8703P</td><td>静脈移植手術</td></tr><tr><td>7-0 ポリプロピレン縫合糸</td><td>CP Medical</td><td>8648P</td><td>遺伝子導入手術</td></tr><tr><td>5-0 ポリグリコール酸縫合</td>糸 <td>CP Medical</td><td>421A</td><td></td></tr><tr><td>3-0 ポリグリコール酸縫合</td>糸 <td>CP Medical</td><td>398A</td><td></td></tr><tr><td>アルコール綿棒</td><td>Covidien Ltd.</td><td>6818</td><td>I.V.ラインの留置用</td></tr><tr><td>カテーテルプラグ</td><td>Vetoquinol</td><td>411498</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine HCl, 100 mg/mL</td><td>Vedco Inc.</td><td></td><td></td>5098916106</tr><tr><td>キシラジン、100 mg / mL</td><td>Akorn Inc.</td><td>4821</td><td></td></tr><tr><td>リドカイン、20 mg/mL</td><td>ファイザー</td><td>409427702</td><td></td></tr><tr><td>マルカイン 0.5%</td><td>ファイザー</td><td>409161050</td><td></td></tr><tr><td>Beuthanasia D-Special</td><td>Intervet Inc.</td><td>NDC 00061047305</td><td>収穫手術のみ</td></tr><tr><td>ブプレノルフィン HCl、0.3 mg/mL</td><td>パターソン獣医</td><td>12496075705</td><td></td></tr><tr><td>生理食塩水 IV バッグ、0.9% 塩化ナトリウム</td><td>Baxter</td><td>2B1309</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン&nbsp;(5000 U/mL)</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>NDC 63323-047-10</td><td></td></tr><tr><td>パパベリン (3.5 mg/ml)</td><td>American Reagent Inc.</td><td>NDC 0517-4002-25</td><td>30mg/mL ストックから希釈;最大 1 mL</td></tr><tr><td>のフェンタニルパッチ、25 mcg/h</td><td>Apotex Corp. を使用します。</td><td>NDC 60505-7006-2</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>複数のベンダー</td><td>カタログ番号はありません</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;ウイルスベクター</td><td></td><td></td><td>遺伝子導入手術のみ</td></tr><tr><td><ストロング>手術器具</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>メッツェンバウム ニードルホルダー 7インチ ストレート</td><td>ロボズ</td><td>RS-7900</td><td></td></tr><tr><td>手術ハサミ 6.5インチ ストレート ブラント/ブラント</td><td>ロボズ</td><td>RS-6828</td><td></td></tr><tr><td>ニードルホルダー/縫合糸ハサミ付き</td><td>ミルテックス</td><td>8-14-IMC</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejoはさみ</td><td>Roboz</td><td>RS-5658</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejoニードルホルダー、ロック付き5.75インチストレート</td><td>Roboz</td><td>RS-6412</td><td></td></tr><tr><td>スティーブンスはさみ4.25 "湾曲した鈍い/鈍い</td><td>Roboz</td><td>RS-5943</td><td></td></tr><tr><td>Almリトラクター 4" 4X4 5mm鈍いプロング</td><td>Roboz</td><td>RS-6514</td><td>2x</td></tr><tr><td>バックハウスタオルクランプ3.5 "</td><td>Roboz</td><td></td><td>4x</td></tr><tr><td>マイクロクリップセッティング鉗子 4.75インチ</td> <td>Roboz</td><td>RS-6496</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ血管クリップ、11 mm</td><td>Roboz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surg-I-Loop</td><td>Scanlan International</td><td>1001-81M</td><td>5 cm 長さ</td></tr><tr><td>Bonaccolto 鉗子、4インチ(10 cm) 長い縦方向の鋸歯状、交差鋸歯状の先端、1.2mm 先端幅</td><td>Roboz</td><td>RS-5210</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3 鉗子 Inox 先端サイズ .17 &times; .10 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-5042</td><td></td></tr><tr><td>Graefe 鉗子、4 インチ(10 cm)長い鋸歯状のストレート、0.8 mmチップ</td><td>Roboz</td><td>RS-5280</td><td></td></tr><tr><td>Halstead蚊鉗子、&nbsp; 5インチストレート、1.3 mmチップ</td><td>Roboz</td><td>RS-7110</td><td>2x</td></tr><tr><td>Halstead蚊鉗子、&nbsp; 5インチ湾曲、1.3mmチップ</td><td>Roboz</td><td>RS-7111</td><td></td></tr><tr><td>ジェイコブソン蚊鉗子 5インチ湾曲超繊細、0.9mmチップ</td><td>Roboz</td><td>RS-7117</td><td></td></tr><tr><td>カントロウィッツ鉗子、7.25インチ 90度繊細、1.7mmチップ</td><td>Roboz</td><td>RS-7305</td><td></td></tr><tr><td>組織鉗子 5インチ、1X2歯、2mm先端幅</td><td>Roboz</td><td>RS-8162</td><td></td></tr><tr><td>Allis-Baby鉗子、12cm、4x5歯、3mm先端幅</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11092-12</td><td>2x</td></tr><tr><td>Adson鉗子、12cm、鋸歯状、ストレート</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>獣医電気外科用ハンドピースと電極</td><td>MACAN Manufacturing</td><td>HPAC-1;R-F11</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Suite 機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>循環温水ブランケットとポンプ</td><td>複数のベンダー</td><td>カタログ番号はありません</td><td></td></tr><tr><td>ベアハガー加温ユニット</td><td>3M</td><td>Model 505</td><td></td></tr><tr><td>IV 輸液ポンプ</td><td>Heska</td><td>Vet IV 2.2</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン気化器とスカベンジャー</td><td>複数のベンダー</td><td>カタログ番号は利用できません</td><td></td></tr><tr><td>獣医用マルチパラメータモニター</td><td>Surgivet</td><td>Surgivet Advisor</td><td></td></tr><tr><td>獣医用電気手術ユニット</td><td>MACAN Manufacturing</td><td>MV-9</td><td></td></tr><tr><td>手術用顕微鏡</td><td>D.F. Vasconcellos</td><td>M900</td><td>静脈移植手術の倍率25倍、遺伝子導入手術の倍率16倍</td></tr></tbody></table>

耐久性のある遺伝子発現により一般的な頚動脈移植に頸静脈の家兎モデル

A Rabbit Model of Durable Transgene Expression in Jugular Vein to Common Carotid Artery Interposition Grafts

静脈グラフト バイパス手術は、閉塞性動脈疾患の一般的な治療法ただし、長期的な成功は、血栓症、肥厚、動脈硬化など血管障害によって制限されます。この記事の目標は、ウサギの二国間静脈移植を配置し、遺伝子発現の耐久性を実現する遺伝子の転送ベクトルと移植を伝達する方法を示すことです。メソッドは、通常静脈グラフトの恒常性の遺伝子とその蛋白質製品の生物学的役割の調査をことができます。例えば静脈グラフト障害を防ぐことができる活動のための遺伝子のテストを実行できます、transgene の式に新生内膜増殖を防ぐかどうかは、血管の炎症を軽減メソッドまたは家兎動脈硬化を軽減供給。高脂肪食。初期生残手術中に右と左の外頚静脈のセグメントは摘出、逆側の端に一般的な頚動脈移植として両側に配置されます。28 日後を実行、2 番目の生存手術中にグラフトのそれぞれは血管クリップで循環から隔離され、ルーメンがヘルパー依存 (HDAd) アデノウイルスベクターを含むソリューション (すなわち) 経由で満ちています。20 分インキュベーション後ベクトル ソリューションを吸気、切開を修理し、流れを復元します。静脈は、個々 の実験的プロトコルによって決まります時点で収穫されます。移植配置と情報伝達系の 28 日間の遅延は動脈循環の静脈グラフトの適応を確保するため必要です。この適応は、静脈グラフト導入前に、または直後移植で発生する遺伝子発現の急速な損失を回避できます。メソッドは、耐久性、安定した遺伝子発現によりグラフト静脈を達成するためにその能力でユニークです。ウサギ他動物大静脈血管モデルと比較して、低コストと簡単な処理の利点があります。ウサギ齧歯動物の静脈グラフトのモデルと比較して、解析のための豊富な組織を提供する大きく、操作が簡単の血管があります。

オペレーターは、実験データを生成するこのメソッドを使用できます前に、new 演算子の技術的な習熟度を検証する必要があります。New 演算子を実現する必要があります最初のマイルス トーンは、一貫性のある静脈グラフトの開存を初回血管移植手術とその後の遅延伝達手術後です。以上手術のそれぞれが望ましいと達成した後 90% 開存性。開存は、我々 は通常術後 5-7 日に行う経皮的超音波を用いた非侵襲的評価できます。特許の葉脈のあるウサギ、超音波試験は前方首 (図 3A) の両側に活発な尾-脳血流と血管を明らかにします。静脈グラフトのいずれかが遮蔽された場合がありますありません検出尾-脳血流閉塞血管の端に。ただし、頭蓋仙骨の血流は、内頸静脈 (図 3B) でまだ検出されます。
N...

このメソッドでは、ウサギの介在静脈グラフトの配置、移植の伝達と遺伝子発現の耐久性の達成をについて説明します。これは遺伝子とグラフト静脈でタンパク質製品の生理学的および病理学的役割と静脈グラフト病に対する遺伝子治療のテストの調査をことができます。

Vein graft bypass surgery is a common treatment for occlusive arterial disease; however, long-term success is limited by graft failure due to thrombosis, ...

この方法は、静脈移植不全の病因に関する重要な質問に答えることができます。例えば、移植片の失敗のメディエーターを特定し、移植片の失敗を防ぐことを目的とした戦略をテストすることができます。この技術の主な利点は、静脈グラフト内皮における耐久性と安定性のある導入遺伝子発現を達成する能力です。テキストプロトコルに従ってウサギに麻酔をかけた後、動物を胸骨のノッチから下顎の端まで剃ります。外科的セットアップが完了したら、電気焼灼を使用して、胸骨のノッチと下顎の間の正中線に沿って皮膚を切断します(長さは約7〜9センチメートル)。次に、切開部を開くためのタオルクランプを取り付けます。正中線全体に沿って筋膜の下を鈍く解剖します。次に、電気焼灼を使用して、正中線に沿って解剖された筋膜層を切断します。次に、右側から始めて、気管を覆う胸骨舌骨筋と胸骨筋を解剖して、総頸動脈を露出させます。次に、総頸動脈の4〜5センチメートルのセグメントとその大きな枝を周囲の組織から解放して慎重に解剖します。5-0シルク縫合糸を使用して、総頸動脈の大きな枝を結紮してから、縫合糸の遠位にある各枝を切断します。左総頸動脈の解剖を繰り返した後、組織保持鉗子を使用して皮下組織層を一時的に閉じます。次に、外部頸静脈が露出するまで、右側の皮膚から表在筋膜を解剖します。外頸静脈の4〜5センチメートルのセグメントを解剖し、その枝を周囲の組織から解放します。5-0シルク縫合糸を使用して枝を結紮し、次に枝を切ります。次に、両端の孤立した静脈を結紮し、頭蓋端を切断し、内腔をヘパリン化生理食塩水で洗い流します。静脈移植を行うには、血管クリップを使用して、孤立したセグメントの頭蓋端で右総頸動脈をクランプします。次に、尾側の端に血管クリップを配置します。次に、静脈セグメントの頭蓋端の直径と同じ長さの尾側クランプに対して、頭蓋側だけの尾側動脈切開術を行います。次に、尾側動脈切開術を通じてヘパリン処理された生理食塩水のシリンジに接続されたIVカテーテルを挿入し、頸動脈内腔を洗い流します。液体は動脈切開術を介して排出されます。頸静脈に戻り、静脈を切除し、齲蝕動脈の隣に横たえます。7-0ポリプロピレン縫合糸のシングルステッチを使用して、尾側動脈切開術の尾側端を静脈セグメントの頭蓋端まで縫合します。次に、最初のステッチから180度2番目のステッチを配置して、尾側動脈切開術の頭蓋端を静脈セグメントの頭蓋端に縫合します。吻合の外側の最初の2つのステッチから等距離のポイントに3番目のステッチを配置します。次に、最初の2つのステッチから等距離で、3番目のステッチの向かい側に、吻合の内側に4番目のステッチを配置します。1から4までの各ステッチの間に4つのステッチを追加で配置します。遠位クリップの尾側で頭蓋動脈切開術を行います。頭蓋動脈切開術の頭蓋端と尾動脈切開術の尾側端との間の距離は、静脈セグメントの長さと同じである必要があります。頭蓋動脈切開術の長さは、静脈セグメントの尾側端の直径に等しくなります。静脈を吻合部から頸動脈に沿って頭蓋状に伸ばした状態で、静脈がねじれていないことを確認します。次に、ヘパリン処理された生理食塩水を使用して、頭蓋動脈切開術を介して頸動脈と静脈を洗い流します。次に、頭蓋動脈切開術の尾側端を静脈セグメントの尾側端に縫合するために最初のステッチを配置します。次に、最初のステッチから180度に2番目のステッチを配置して、頭蓋動脈切開術の頭蓋端を静脈セグメントの尾側端まで縫合します。ビデオの前半で示したように、吻合を完了します。頭蓋クリップを一時的に解放して、静脈移植片が血液で満たされるようにし、乾いたガーゼで穏やかな圧力をかけて出血を止めます。吻合が出血しなくなるまで、この手順を繰り返します。次に、頭蓋クリップと尾側クリップの両方を取り外します。ガーゼを使用して、吻合部での追加の出血を止めます。3-0シルク縫合糸を使用して、吻合部の間の総頸動脈セグメントの両端を結紮します。次に、頸動脈を合字の中間に分割します。活発な脈動が静脈グラフトに見られるはずです。左側で静脈グラフトの配置を繰り返します。5-0 PGA縫合糸で、連続パターンで皮下組織を閉じます。次に、3-0 PGA縫合糸を使用して皮内パターンで皮膚を閉じ、両端の結び目を埋めます。術後ケアと経皮的超音波検査をテキストプロトコルに従って実施します。遺伝子導入手術を行うには、移植片に隣接する頸動脈の1.5〜2センチメートルを含む右静脈移植片を頭蓋側と尾側の両方で慎重に分離します。同様に左側で解剖を繰り返します。正常な生理食塩水を使用して右側の外科的創傷腔を埋め、音波の伝達を可能にします。2mm血管周囲流量プローブを体積流量計に接続し、創傷腔内の生理食塩水にプローブを浸します。流量をゼロに設定します。フロープローブを頸動脈の周囲、静脈グラフトの尾側または頭蓋側に配置します。次に、電子データ収集システムを使用して、フロープローブからのデータを記録します。IVカテーテルを介してウサギにヘパリンを注入し、生理食塩水で洗い流した後、血管クリップを使用して、静脈グラフトの頭蓋端で総頸動脈をクランプします。次に、尾側吻合部から尾側約10ミリメートルの頸動脈に2番目のクリップを適用して、動脈切開のためのスペースを確保します。次に、静脈移植片のすぐ尾側にある頸動脈の周りに2本の絹のネクタイをゆるく配置します。次に、事前に準備した曲げた21ゲージの針を使用して、頸動脈尾側をグラフトに穿刺し、頭蓋のみを尾側血管クリップに穿刺します。針を内腔に2回前後に進めて、内腔が透明であることを確認します。次に、針を慎重に引き出します。テキスト プロトコルに従って DMEM を使用したシリンジと IV カテーテルを準備した後、総頸動脈切開術に曲げ点まで挿入し、0.5 ミリリットルの DMEM を 2 回充填して静脈移植管内腔を洗浄します。手袋をはめた指を使用して、グラフトの頭蓋端を軽く押して、DMEMをグラフトから取り外します。次に、移植片に沿って指をグラフトの尾側の端に向かって慎重にスライドさせ、動脈切開術によって管腔内容物を洗い流します。DMEMシリンジをカテーテルから取り外し、カテーテルを血管に残します。ウイルス溶液の入ったシリンジを接続し、カテーテルに空気が入らないようにします。ゆるく結ばれた絹の結束バンドをカテーテルの先端の周りに来るまで動脈の下に動かしますが、締めないでください。0.03ミリリットルのウイルス溶液を注入して、残りのDMEMをカテーテルから押し出します。次に、指を使用して、頭蓋から尾側に優しく押し込む静脈グラフト内腔からすべての液体を取り除きます。動脈とカテーテルの先端の周りの2本のタイを締めて、内腔を密閉します。次に、静脈が膨張するまでウイルス溶液を注入します。注射器をガーゼの巣にそっと置きます。20分後、空の注射器を使用して、血管が崩壊するまで移植片からウイルス含有溶液を穏やかに吸引します。カテーテルを所定の位置に残したままシリンジを取り外します。次に、絹の縫合糸を切断してほどき、カテーテルを血管から引き抜きます。次に、7-0ポリプロピレン縫合糸をXパターンで使用して、動脈切開を閉じます。次に、縫合糸の端をそっと引っ張り、2つの四角い結び目で結びます。テキストプロトコルに記載されているように右静脈移植片の血流を回復した後、左側でウイルス注入を繰り返します。形質導入された移植片を採取するには、静脈移植片と総頸動脈を解剖し、前に示したように左側と右側の両方で流量測定を行います。3-0シルク縫合糸を使用して、右総頸動脈頭蓋を移植片に結紮します。次に、3-0シルク縫合糸を使用して、頸動脈尾側を移植片に結紮します。隣接する頸動脈を各結紮と隣接する吻合部の間で分割することにより、右静脈移植片を切除します。次に、ウサギから静脈移植片を取り除き、生理食塩水を使用して内腔を洗い流します。新しいオペレーターが達成しなければならない最初のマイルストーンは、最初の静脈移植手術とその後の遅延形質導入手術の両方の後に、一貫した静脈移植片の開存性です。静脈移植片が特許を取得した場合、超音波検査では、尾側から頭蓋への血流が活発な大きな血管が明らかになります。移植片は形質導入の3日後に採取され、切片に切断され、X-galで染色されました。管腔表面の顔面イメージングでは、効率的な形質導入と不十分な形質導入を伴う静脈移植片が示されました。このプロットに示されているように、新しいオペレーターが形質導入した静脈移植片中のβガラクトシダーゼmRNAのレベルは、経験豊富なオペレーターが形質導入した静脈移植片中のβガラクトシダーゼmRNAのレベルと有意差はありませんでした。このプロトコルを実行するときは、吻合にかかる前に静脈移植片の頭蓋骨を尾側に戻すことを覚えておくことが重要です。これは、静脈ボーラスによる血流の妨害を避けるために必要です。.これらの手術をマスターすると、静脈移植手術で約3時間、静脈移植遺伝子導入手術で約2時間、収穫手術で約45分で完了できます。このプロトコルではウイルスベクターや鋭利な物体を扱う必要があるため、適切なバイオセーフティと鋭利物の手順に従う必要があることを忘れないでください。

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Research

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