Name: 舌の細胞外マトリックスと舌扁平上皮癌生体外の再構成の作製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: 学ぶ舌扁平上皮癌の3次元培養モデル構築法。マウス舌組織の脱細胞化とミニバイオリアクターを用いて、臨床病理と類似した腫瘍特性を再現する細胞外マトリックススカフォールドを作成します。

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著者は、国家自然科学基金、中国の (31371390)、状態のハイテク開発プロジェクト (2014AA020702) のプログラムおよび広東省科学技術 (2016B030231001) のプログラムからの研究助成金のサポートを認めます。

すべての動物の仕事は、動物福祉法、制度のガイドラインに従って実施されますされ、機関動物ケアおよび使用委員会、孫逸仙大学によって承認されました。
1. TEM の準備
<ol><li>頚部転位によってマウスを実行し、滅菌手術用はさみとピンセットを使用して舌を削除します。</li>
	<li>3 分、75% エタノールで舌に没頭し、それぞれ舌を入れて 1.5 mL エッペン (EP) 10 mM 滅菌リン酸 1 mL 管バッファー ソリューション (PBS)。 注: すべての次の手順で PBS の濃度はこの手順で濃度と同じです。</li>
	<li>凍結融解によるセル換散:-80 ° c 1 時間、EP チューブで舌を凍結し、3 回 45 分間室温で舌を解凍します。</li>
	<li>手術針を使用して外科的縫合部分にそれぞれの舌を読み込み、滅菌アルミ箔の小片で縫合糸の端をラップします。無菌状態で 75% のエタノールを含む 3.5 cm や 6 cm の培養皿で操作を実行します。 注: 個々 の手術用縫合糸の適切な長さは約 20 cm、アルミ箔の各部分の適切な大きさは 0.3 cm2 (1 × 0.3 cm)。舌は、アルミ箔に近い読み込む必要があります。</li>
	<li>30 s. 実行無菌状態でこの操作のため 3.5 cm や 6 cm の培養皿で 3 ml の滅菌 PBS の各舌をすすいでください。</li>
	<li>超純水水で舌を洗う: 90 μ g/mL の最終的な集中に滅菌超純水の 250 ml 広口瓶の中にアンピシリンを追加。攪拌棒の入ったボトルに舌を入れてください。残りのボトル外縫合部とボトル キャップを締めます。無菌状態でこの操作を実行します。 注: 縫合の巻きつきを考慮した同じ瓶にで 5 舌までを置くことができます。アルミ箔は、舌をオフに滑りを防ぐためにボトルでは縫合糸の端。舌は、ボトルの内側に残り縫合糸の長さを調整することによって、ボトルの底から 2 センチ配置必要があります。このメモはまた 1.8、1.10、1.12、1.16 の手順です。</li>
	<li>マグネチックスターラー 12 h のためにボトルを置きます。</li>
	<li>塩化ナトリウムと舌を洗う: 滅菌 1 の 250 ml 広口瓶の中にアンピシリンを追加 M 塩化ナトリウム 90 μ g/mL の最終的な集中。舌と攪拌棒をボトルに移動します。残りのボトル外縫合部とボトル キャップを締めます。無菌状態でこの操作を実行します。</li>
	<li>マグネチックスターラー 24 h のためにボトルを置きます。</li>
	<li>セル換散によってトリトン X-100: 滅菌の 2% の 250 ml 広口瓶の中に 90 μ g/mL の最終的な集中にアンピシリンを追加 PBS でトリトン X-100。舌と攪拌棒をボトルに移動します。残りのボトル外縫合部とボトル キャップを締めます。無菌状態でこの操作を実行します。</li>
	<li>マグネチックスターラー 48 h のためにボトルを置きます。</li>
	<li>CaCl2/MgCl2舌を洗う: 90 μ g/mL の最終的な集中に滅菌 5 mM CaCl2/MgCl2の 250 ml 広口瓶の中にアンピシリンを追加。舌と攪拌棒をボトルに移動します。残りのボトル外縫合部とボトル キャップを締めます。無菌状態でこの操作を実行します。</li>
	<li>マグネチックスターラー 24 h のためにボトルを置きます。</li>
	<li>DNase によって消化: ハンクの 1 mL 平衡塩類溶液 (HBSS) 各 EP 管を追加。300 の最終的な集中にそれぞれ HBSS に DNase を追加 μ m 各 EP 管、管の外側の縫合部にそれぞれの舌を移動します。無菌状態でこの操作を実行します。 注: は前の手順でボトル内に残る縫合部がこのステップで EP チューブ内も残ることを確認し、前の手順でボトルの外に残る縫合部がこの手順で EP 管の外側もままかどうかを確認します。</li>
	<li>24 h の 37 ° C で EP チューブで舌を孵化させなさい。</li>
	<li>PBS で舌を洗う: 90 μ g/mL の最終的な集中に滅菌 PBS の 250 ml 広口瓶の中にアンピシリンを追加。舌と攪拌棒をボトルに移動します。残りのボトル外縫合部とボトル キャップを締めます。無菌状態でこの操作を実行します。</li>
	<li>マグネチックスターラー 24 h のためにボトルを置きます。</li>
	<li>使用するまで 4 ° C で滅菌 PBS に準備された TEM を格納します。</li>
</ol>2 TSCC の次元 (3 D) 再構成
<ol><li>
静的 TSCC モデルの構築
	<ol>
<li>種子 1.0 x 106 TSCC 単細胞 (Cal27) 3.5 cm 培養皿に。ダルベッコの 3 mL は、イーグルの中/F12 (DF12) 含む 10% 牛胎児血清 (FBS)、90 μ g/mL アンピシリン 90 μ g/mL カナマイシンを変更を追加します。</li>
		<li>2 〜 3 日の 37 ° C で Cal27 細胞を培養します。セルが少なくとも 60% をカバーすることを確認してください、皿の底のエリア。</li>
		<li>Cal27 単層培養皿の上に TEM をロードします。</li>
		<li>28 日の 37 ° C で CO2インキュベーターに皿を置きます。</li>
		<li>毎日、細胞培養プロセスの中に培養液を更新します。インキュベーターの CO2濃度は 5% です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
攪拌 TSCC モデルの構築
	<ol>
<li>
自作攪拌 minibioreactor の作製
		<ol>
<li>10 mL シリンジのプランジャーを取り出してください。</li>
			<li>ロッドのより低いターミナルのそば (直径 1 cm) 穴を掘り、穴に攪拌棒を読み込みます。</li>
			<li>広口ペットボトルのボトル キャップの中心に穴 (直径 0.5 cm) を掘るし、キャップを介してピストン棒を置きます。</li>
			<li>50 mL の遠心管の半分にカット、ボトル キャップの外側に溶接します。</li>
			<li>釣糸、釣針を結びつけたとロッドをラップすることによって、釣針をロッドに接続します。 注: をロッドで 4 釣針までを接続できます。</li>
			<li>オートクレーブ使用前に、自作の複合体。 注: は、プラスチック製の広口ボトル オートクレーブ滅菌を行います。細胞を培養しながら新しい滅菌プラスチック製の広口ボトルを使用します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
動的な細胞培養
	<ol>
<li>種子 1.0 x 106 Cal27 単細胞自作 minibioreactor で。10 %fbs、90 μ g/mL アンピシリンと 90 μ g/mL カナマイシンを含む DF12 媒体の 150 mL を追加します。</li>
		<li>TEM をロッドに接続されている釣針を使用して minibioreactor に乗せます。</li>
		<li>ボトル キャップを締めるし、磁性攪拌器に minibioreactor を置きます。7 〜 14 日 37 ° C で CO2インキュベーターで 200 rpm で minibioreactor をアクティブにします。 注: CO2インキュベーターで CO2の濃度は 5% です。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Elfring, T., Boliek, C. A., Winget, M., Paulsen, C., Seikaly, H., Rieger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+lingual+and+hypoglossal+nerve+function+and+quality+of+life+in+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Oral+Rehabil%22%5BJournal%5D)">The relationship between lingual and hypoglossal nerve function and quality of life in head and neck cancer.</a> J. Oral Rehabil. 41, 133-140 (2014).</li>
<li>Patel, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+incidence+of+oral+tongue+squamous+cell+carcinoma+in+young+white+women%2C+Age+18+to+44+Years%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Increasing incidence of oral tongue squamous cell carcinoma in young white women, Age 18 to 44 Years.</a> J. Clin. Oncol. 29, 1488-1494 (2011).</li>
<li>Zhao, L., Huang, L., Yu, S., Zheng, J., Wang, H., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+tongue+tissue+as+an+in+vitro.+model+for+studying+tongue+cancer+and+tongue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Decellularized tongue tissue as an in vitro. model for studying tongue cancer and tongue regeneration.</a> Acta Biomaterialia. 58, 122-135 (2017).</li>
<li>Ng, S. L., Narayanan, K., Gao, S., Wan, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+restricted+progenitors+for+the+repopulation+of+decellularized+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Lineage restricted progenitors for the repopulation of decellularized heart.</a> Biomaterials. 32, 7571-7580 (2011).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat. Med. 14, 213-221 (2008).</li>
<li>Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+decellularization+of+porcine+heart+by+retrograde+coronary+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion.</a> J. Vis. Exp. (6), e50059(2012).</li>
<li>Wainwright, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cardiac+extracellular+matrix+from+an+intact+porcine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C-ME%22%5BJournal%5D)">Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart.</a> Tissue Eng. Part C-ME. 16, 525-532 (2010).</li>
<li>Baptista, P. M., Siddiqui, M. M., Lozier, G., Rodriguez, S. R., Atala, A., Soker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+whole+organ+decellularization+for+the+generation+of+a+vascularized+liver+organoid%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid.</a> Hepatology. 53, 604-617 (2011).</li>
<li>Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+decellularization+of+intact+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Method for the decellularization of intact rat liver.</a> Organogenesis. 6, 134-136 (2010).</li>
<li>Soto-Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-organ+regenerative+medicine+approach+for+liver+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C-ME%22%5BJournal%5D)">A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement.</a> Tissue Eng. Part C-ME. 17, 677-686 (2011).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat. Med. 16, 814-820 (2010).</li>
<li>Bonvillain, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonhuman+primate+model+of+lung+regeneration%3A+detergent-mediated+decellularization+and+initial+in+vitro+recellularization+with+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Pt+A%22%5BJournal%5D)">A nonhuman primate model of lung regeneration: detergent-mediated decellularization and initial in vitro recellularization with mesenchymal stem cells.</a> Tissue Eng. Pt A. 18, 2437-2452 (2012).</li>
<li>Daly, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+binding+and+recellularization+of+decellularized+mouse+lung+scaffolds+with+bone+marrow-derived+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Initial binding and recellularization of decellularized mouse lung scaffolds with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells.</a> Tissue Eng. Pt A. 18, 1-16 (2012).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat. Med. 16, 927-933 (2010).</li>
<li>Petersen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+lungs+for+in+vivo+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered lungs for in vivo implantation.</a> Science. 329, 538-541 (2010).</li>
<li>Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+decellularized+lung+bioreactor+system+for+bioengineering+the+lung%3A+the+matrix+reloaded%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded.</a> Tissue Eng. Pt A. 16, 2581-2591 (2010).</li>
<li>Wallis, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+assessment+of+detergent-based+protocols+for+mouse+lung+de-cellularization+and+re-cellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C-ME%22%5BJournal%5D)">Comparative assessment of detergent-based protocols for mouse lung de-cellularization and re-cellularization.</a> Tissue Eng. Part C-ME. 18, 420-432 (2012).</li>
<li>Ross, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+proliferate+and+differentiate+when+seeded+into+kidney+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).</li>
<li>Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+experimental+orthotopic+transplantation+of+a+bioengineered+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney.</a> Nat. Med. 19, 646-651 (2013).</li>
<li>Sullivan, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+methods+of+porcine+kidneys+for+whole+organ+engineering+using+a+high-throughput+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system.</a> Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).</li>
<li>Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+whole-organ+assembly%3A+moving+toward+transplantation+on+demand%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand.</a> J. Clin. Invest. 122, 3817-3823 (2012).</li>
<li>Song, J. J., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+engineering+based+on+decellularized+matrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds.</a> Trends Mol. Med. 17, 424-432 (2011).</li>
<li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-organ+tissue+engineering%3A+decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).</li>
<li>Shamis, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+scaffolds+for+in+vitro+expansion%2C+differentiation%2C+and+organization+of+primary+lung+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C-ME%22%5BJournal%5D)">Organ-specific scaffolds for in vitro expansion, differentiation, and organization of primary lung cells.</a> Tissue Eng. Part C-ME. 17, 861-870 (2011).</li>
<li>Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+rhesus+monkey+kidney+as+a+three-dimensional+scaffold+for+renal+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering.</a> Tissue Eng. Pt A. 16, 2207-2216 (2010).</li>
<li>Cortiella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+acellular+natural+lung+matrix+on+murine+embryonic+stem+cell+differentiation+and+tissue+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation.</a> Tissue Eng. Pt A. 16, 2565-2580 (2010).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

脱 ECM 作製の十分に確立されたプロトコル組織で細胞成分を除去しながらネイティブの ECM 成分を保つべきほぼ完全に21。現在報告されている decellularization プロトコル対流輸送によって細胞を除去する血管を介して血流を必要とする、にもかかわらず機械的攪拌ここで採用した、22の伝統的なシンプルで安価な方法として知られています。,23,24,25,26します。 また、舌 lingualis が豊富です、いくつかの扱いにくい血管を持っているので、このプロトコルは上で説明したその他のプロトコルよりも舌組織に適しています。
さらに、TEM 用この議定書は実施適切な中等度強度 decellularizat...

舌は嚥下、構音、味など、様々 な重要な機能です。したがって、舌機能障害では、患者の生活の質の1が大きな影響を与える。口腔内の最も一般的な悪性腫瘍は舌扁平上皮癌 (TSCC) アルコールを飲酒や喫煙タバコ2人で通常発生します。
近年では、ほとんど進展は、TSCC に関する基礎的研究で達成されています。効率的な体外研究の欠如は、遺跡の最大の問題の 1 つをモデル化します。したがって、細胞外マトリックス (ECM) は、潜在的な解決策になることが判明します。ECM は、高度に組織化されたマトリックス成分から成る複雑なネットワーク フレームは、ECM のような構造と組成を持つ足場材料なので癌研究主務。脱 ECM は、同じ起源の in vitro、ECM の最も重要な利点であることが判明したから細胞の完全にニッチを提供できます。
ECM は、洗剤や酵素を使用して decellularization を組織から削除されている細胞成分を保持ことができます。脱マトリックスのコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンを含む各種の ECM コンポーネントは、生存、増殖、および3細胞の分化を促進、培養細胞のネイティブの組織のような微小環境を提供します。また、移植の免疫原性は、ECM の細胞成分の有無と最低限のレベルに削減できます。
これまでのところ、脱 ECM の作製方法は、さまざまな組織、器官、心臓4,5,6、7、肝8,9,10 などで試されています。 ,11、肺12,13,14,15,16,17、および腎臓18,19,20します。 ただし、関連研究が見つかりません我々 の知識を最大限に舌で同様の作業をします。
本研究では脱舌の細胞外マトリックス (TEM) は一連の物理・化学・酵素治療により効率的にそして安くを作製しました。TEM は、TSCC 動作と開発のための適切なシミュレーションを示す TSCC体外、要約に使用されました。TEM では、TEM TSCC 研究3で大きな可能性があることを示す組織固有のニッチにセルをガイドする機能のほか、良い生体適合性。ここに示すプロトコルは、病因または TSCC の臨床治療研究の選択肢を提供します。

<table><tbody><tr><td>C57-BL/6J マウス</td><td>中山大学 実験動物センター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>広州化学試薬工場</td><td>HB15-GR-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>サンゴンバイオテック</td><td>A501218</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>サンゴンバイオテック</td><td>A100395</td><td></td></tr><tr><td>二塩基性リン酸ナトリウム</td><td>広州化学試薬工場</td><td>BE14-GR-500G</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性&nbsp;</td><td>サンゴンバイオテック</td><td>A501211</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL EPチューブ</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-A</td><td></td></tr><tr><td>超低温冷凍庫&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.5 cm 細胞培養ディッシュ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>6 cm 細胞培養ディッシュ</td><td>グライナー</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>V900502</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td> シ<td>グマ・アルドリッチ</td><td>449164</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>Sangon Biotech</td><td>A601988</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158968</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9393</td><td></td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1487</td><td></td></tr><tr><td>外科用縫合糸</td><td>Shanghai Jinhuan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mL 広口ボトル</td><td>SHUNIU</td><td>1407</td><td></td></tr><tr><td>マグネチックスターラー</td><td>AS ONE</td><td>1-4602-32</td><td></td></tr><tr><td>CO2 インキュベーター</td><td>SHEL LAB</td><td>SCO5A</td><td></td></tr><tr><td>10 mL シリンジ</td><td>湖南平安</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL 遠心分離管</td><td>Greiner</td><td>227270</td><td></td></tr><tr><td>Cal27細胞</td><td>中国科学院、上海細胞バンク</td><td></td><td>舌状扁平上皮がん細胞株</td></tr><tr><td>U2OS細胞</td><td>中国科学院、上海細胞バンク</td><td></td><td>ヒト骨肉腫細胞株</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0547</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Hepes遊離酸</td><td>BBI</td><td></td><td></td>A600264</tr><tr><td>FBS</td><td>ハイクロン</td><td>SH30084.03</td><td></td></tr><tr><td>4 >C冷蔵庫</td><td>ハイアール</td><td></td><td></td></tr><tr><td>浄水器</td><td>ELGA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>BLAU</td><td>717805</td><td></td></tr></tbody></table>

舌の細胞外マトリックスと舌扁平上皮癌生体外の再構成の作製

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

舌扁平上皮細胞癌 (TSCC)の in vitroの効果的かつ現実的なモデルを構築するためにメソッドの作成された食材脱舌細胞外マトリックス (TEM) TSCC 建設のため機能的な足場を提供します。TEM は、細胞の増殖・分化・細胞の生体外でニッチを提供します。ネイティブの細胞外マトリックス (ECM) と decellularized のマトリックスで保持される生化学的組成の微細構造は、セルを固定の組織固有のニッチを提供します。TEM の作製は、深刻な有機または無機の前処理を伴うデオキシリボヌクレアーゼ (DNase) 消化によって実現できます。このプロトコルは操作が簡単ででき、decellularization の高効率。TEM は、TSCC モデルの構築を可能にする静的または撹拌培養条件下で TSCC 細胞の良好な細胞を示した。自作バイオリアクターは細胞培養のための永続的な撹拌条件にも使われました。TEM を使用して再建された TSCC を示した特性と TSCC 病理臨床に似たプロパティ TSCC 研究の可能性を示唆しています。

TEM の準備のためこのプロトコルは効率的かつ適切なをことが判明します。TEM は、母国語の組織と比較して完璧な decellularization を示した。ヘマトキシリン ・ エオジン (HE) 染色 (図 1A B) によって decellularization の有効性を確認した.染色の結果彼は、TEM (図 1B) の染色性が核の完全な消失を明らかにしました。また、以前の作品から DNA コンテンツの定量化は、DNA が TEM3からほぼ完全に削除されたことを示した。このプロトコルはまた細胞成分 (図 1B) を除去しながら組織の整合性にまれな損傷を示した。
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効率的な decellularization による舌の細胞外マトリックス (TEM) の準備のためのメソッドを示しています。TEM は、静的または撹拌培養条件下で舌扁平上皮癌 (TSCC) モデルの復興のため、機能的な足場として使用できます。

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

この方法は、適切なT-assistモデルをin vitroで構築する方法など、口腔がん研究分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、再構築されたTSCCが臨床TSCC組織病理学に非常に類似した腫瘍特性を発現することです。この方法を最初に考えたとき、2D培養TSCC細胞がTSCCのネイティブ表現型を適切に示していないことに気付きました。さらに、がんの生存回避や分化には細胞外マトリックスが重要であることを実感しました。ミニバイオリアクターを使用した舌細胞外マトリックスの調製と3D培養は、言葉だけで学ぶのが難しく、明確化のために見るのが最善であるため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。テキストプロトコルに従って安楽死させたマウスから舌を単離した後、組織を75%エタノールに3分間浸します。次に、各舌を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、1ミリリットルの10ミリモル滅菌PBSを入れます。細胞溶解を行うには、舌をマイナス80°Cで1時間凍結します。次に、ティッシュを室温で45分間解凍します。凍結/解凍をさらに2回繰り返します。次に、75%エタノールを含む3 1/2センチメートルまたは6センチメートルの培養皿で、外科用針を使用して各舌を外科用縫合糸にロードします。そして、滅菌スズホイルの小片で、縫合糸の端を包みます。3 1/2センチメートルまたは6センチメートルの培養皿で、3ミリリットルのPBSを使用して各舌を30秒間すすぎます。次に、広口ボトルに、250ミリリットルの滅菌超純水にアンピシリン1ミリリットルあたり90マイクログラムを調製し、攪拌子を追加します。5つの舌までボトルに下げ、底から約2センチメートルになるまで下げ、縫合糸の一部がボトルの外側に残っている状態でキャップを締めます。ボトルをマグネチックスターラーに12時間置きます。次に、インキュベーション後、アンピシリン1ミリリットルあたり90マイクログラムの250ミリリットルを滅菌1モル塩化ナトリウムに調製します。舌と攪拌棒をボトルに移し、キャップをねじ込みます。ボトルをマグネチックスターラーに24時間置きます。細胞溶解を行うには、PBS中の250ミリリットルの滅菌2%TritonX-100中にアンピシリン1ミリリットルあたり90マイクログラムを調製します。タンと攪拌子をボトルに移し、キャップを締めます。その後、ボトルを48時間攪拌します。塩化カルシウムと塩化マグネシウムをアンピシリンで調製した後、ティッシュと攪拌バーをボトルに移し、ボトルを24時間攪拌します。舌サンプルごとに1mLのHBSS中の300マイクロモルDNaseを1本の微量遠心チューブに調製します。舌をチューブに移し、縫合糸の同じ部分を外側にぶら下げます。次に、組織を摂氏37度で24時間インキュベートし

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

標識された細胞の多光子顕微鏡を通して舌内に口腔癌と腫瘍浸潤の定量的なモニタリングのマウスモデルの生成に関わる技術の包括的な概要が表示されます。このシステムは、抗浸潤化合物の分子の評価と薬効のための有用なプラットフォームとして機能することができます。...

口腔扁平上皮癌の同所性マウスモデルにおける腫瘍細胞の浸潤の多光子イメージング

このビデオでは、マウスの舌から上皮細胞が分離される様子を説明しています。これらの細胞をさらに培養して、細胞コロニーを生じさせることができます。...

マウス舌上皮細胞の単離と培養:マウスモデルから舌上皮細胞を単離および培養する手順

このビデオは、採取した舌を一連の物理的、化学的、および酵素的処理にさらす脱細胞化法を使用して、マウスの舌細胞外マトリックスを調製する方法を示しています。得られたTEMスキャフォールドは、本来の細胞外マトリックス組成を保持し、細胞成分を除去します。...

マウスモデルからの細胞外マトリックスの作製:マウス舌から脱細胞化舌細胞外マトリックスを調製するための効果的な手順

組織操作された線維芽細胞由来の天然のマトリックスは、上皮細胞の増殖および分化を支持する間質基質を生成するための新興のツールである。ここでは、腫瘍細胞の生物学上の異なる間質細胞タイプの影響を評価するためにこの方法を適用するプロトコルが提示される。...

癌細胞浸潤への応用による腫瘍間質微小環境の組織工学

この原稿は、生産、特性評価および正常な初代ヒト食道線維芽細胞および脱細胞化ブタの足場内に播種した扁平上皮細胞から調製した組織工学3D食道構造物の潜在的な用途を説明しています。結果は、正常なヒトの食道に似成熟重層上皮の形成を実証します。...

生産、特性評価および3D組織工学ヒト食道粘膜モデルの使用可能性

頭頸部癌患者で変異した特定の遺伝子を有するマウスモデルの開発は、新生物の理解のために必要とされる。ここでは、アデノ関連ウイルス-Cas9系を用いた原発マウス舌細胞の体外変換に関するプロトコルを提示し、特定のゲノム改変を有するマウスHNC細胞株を生成する。...

アデノ関連ウイルス-Cas9システムを用いた遺伝子操作マウス頭頸部癌細胞株のインビトロ確立

我々は、胚および成体マウス舌の上皮および間線質/結合組織から大量の高品質単一細胞を解離するための一般化されたプロトコルを開発した。...

12.5日目および8週齢マウスの舌上皮・間分性/結合組織からの細胞解離

このプロトコルは、成体マウスの後味乳頭から単離された味覚幹細胞に由来する言語オルガノイドを培養および処理するための方法を提示する。...

成人マウス味幹細胞由来の舌下オルガノイドの生成と培養

このプロトコルでは、化学的発がんによって誘発される正常、腫瘍前、および扁平上皮がんの病変を表すマウスの口腔食道3Dオルガノイドを生成および特性評価するための重要なステップについて説明します。...

3Dオルガノイドによる口腔食道扁平上皮癌のモデリング

口腔内に形成された口腔扁平上皮がん腫瘍を外科的に切除する独自の方法をここに示します。...

マウスの口腔扁平上皮細胞癌の前臨床モデルにおけるトランスレージ関連腫瘍切除モデル

学ぶ舌扁平上皮癌の3次元培養モデル構築法。マウス舌組織の脱細胞化とミニバイオリアクターを用いて、臨床病理と類似した腫瘍特性を再現する細胞外マトリックススカフォールドを作成します。

舌の細胞外マトリックスと舌扁平上皮癌生体外の再構成の作製

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