カスタム設計されたレーザー エッチングのマスターから培養金型

この方法は、組織発生、細胞アラインメント、およびポリマーと人工組織の機械的分析に関連する組織工学分野の研究を促進することができます。この手法の主な利点は、低コストで使いやすく、高速であることです。私の研究室でこの手法を開発したのは、現場ではミリメートルからセンチメートルスケールの人工組織の幾何学的制御が行われておらず、人工組織のサイズのスケールアップについて並進的に考える必要があると考えたからです。

この技術により、ポストやさまざまな形状を使用した作製技術により、細胞生理学や人工組織に対する幾何学的なキューの利点を活用できます。この方法により、制御されたサイズ、形状、および整列した人工組織の作製に関する洞察を得ることができます。また、さまざまな疾患モデル、個別化再生医療、および人工組織の前臨床研究への翻訳にも適用できます。

まず、コンピューターでベクターグラフィックスプログラムを開きます。目的の金型形状とベクトル形式を準備するには、RGB カラー形式で適切な寸法の新しいキャンバスを開きます。次に、左側のパネルから形状ツールを選択し、ウィンドウの上部に寸法を入力して目的のジオメトリを作成し、形状サイズを正確に定義します。

最も外側のフィーチャの端から少なくとも 6 mm の境界が得られるように金型形状を設計し、金型鋳造後に PDMS メニスカスをトリミングできるように切断線を設計します。これにより、完成した型を培養皿の底と同じ高さに置くことができます。次に、ウィンドウの左上隅にあるカラーピッカーを開き、レーザーカッターソフトウェアと互換性のある新しいカラースウォッチを定義します。

各パスを選択し、カットスウォッチから適切なカラーを割り当てます。終了したら、塗りつぶしの色に None を割り当てます。同様に、エッチングパスにスウォッチカラーを割り当てるには、オブジェクトを選択し、カラーピッカーで塗りのカラーにエッチングパスを選択し、パスカラーに「なし」を選択します。

ベクターグラフィックプログラムとレーザーカッターに適した形式に応じて、デザインをAI形式or. pdfファイル形式のいずれかとして保存します。メーカーの仕様に従ってレーザーカッターを切断する準備をし、十分な換気が使用されていることを確認してください。

次に、1/4インチのアクリルシートをレーザーベッドに置きます。ベッドの高さを調整して、アクリルに適切に調整します。次に、レーザーカッターに接続されたコンピューターでデザインファイルを開き、[印刷]メニューを開きます。

レーザーカッターがプリンターとして設定されていること、およびデザインの歪みを防ぐために、[スケーリング]ドロップダウンメニューで[スケーリングしない]が選択されていることを確認します。次に、 印刷 ダイアログの下部にあるボタン。レーザーカッター印刷ユーティリティで、設定ボタンをクリックして、各設計機能のカットエッチングパラメータを設定します。

ここでは、以前に選択した各色のパワー、速度、およびパルス/インチのパラメーターを設定します。設定を入力したら、レーザーカッターソフトウェアの大きな緑色のボタンをクリックします。これにより、レーザーカッターがネガマスターモールドのエッチングとカットを開始します。

最後に、小さなブラシまたは圧縮空気を使用して、ネガティブマスターモールドから残留物を取り除きます。これにより、PDMSキャスティング用の表面が準備されます。PDMSキャスティングミックスは、メーカーの仕様に従って調製します。

準備したPDMSを、標準ラインの真空ラボに接続された真空チャンバー内で1時間、またはすべての気泡が除去されるまで脱気します。PDMSの脱気中に、金型の外縁をビニールテープまたはマスキングテープで取り、テープがネガマスター金型のエッチング面から少なくとも3ミリメートル上に伸びるようにします。テープを型枠の側面にしっかりと押し付けて、後から漏れないようにしてください。

次に、PDMSの厚さが最小1.5mmに達するように、PDMSをマスターモールドに約0.35ミリリットル/センチメートルの正方形を流し込みます。PDMSコーティングされたネガティブマスターモールドを真空チャンバーに入れ、1時間またはすべての気泡が除去されるまで再度脱気します。次に、脱気したPDMSコーティングされたネガティブマスターモールドを、摂氏60度のオーブンの水平棚に少なくとも6時間置き、PDMSを硬化させます。

硬化したら、かみそりの刃を使用して、ネガマスターモールドに残っている間に個々のモールドを切断します。次に、各PDMSモールドをネガティブマスターモールドからゆっくりと慎重に剥がします。半月板のある領域を鋳造から切り取り、金型が平らになるのを防ぎ、余分な材料や破片を防ぎます。

最後に、標準的なオートクレーブサイクルを使用して型をオートクレーブし、組織培養のために型を滅菌します。まず、未処理のプラスチックプレートに金型を接着します。フィブリノーゲン、トロンビン、および中和コラーゲン溶液を調製し、添付のテキストプロトコールに記載されているように目的の細胞を回収します。

フィブリノーゲン、中和コラーゲン、細胞懸濁液を組み合わせ、キャスティングミックスを作製します。キャスティングミックスを氷の上に保ちます。次に、ハンドヘルド高周波発生器を使用して、鋳造混合物にさらされる金型の表面を処理し、PDMSの疎水性を軽減します。

材料を鋳造する約5分前に、表面をプラズマ処理に3〜5秒さらします。タンパク質細胞混合物をキャストする直前に、トロンビンをキャスティングミックスに加え、気泡を入らないように静かに上下にピペットで動かします。迅速に作業し、キャスティングミックスを金型にピペットで固定し、金型のすべてのコーナーと隙間に混合物を堆積させます。

コンストラクト内で気泡が形成されるのを防ぐために、ピペットの最初のストップを超えて混合物を排出しないでください。次に、サンプルを加湿した摂氏37度のインキュベーターに45分間入れます。45分後、コンストラクトをフードに戻し、細胞培地で覆ってからインキュベーターに戻します。

細胞培地は、細胞およびコンストラクトの種類に応じて、必要に応じて48〜72時間ごとに交換します。最後に、添付のテキストプロトコールに従って、コンストラクトの組織圧縮および引張特性を定量化し、さまざまな染色技術を準備し、細胞のアライメントを測定します。時間と培養が進むと、細胞化したコンストラクトはマトリックスのリモデリングによりコンパクトになります。

これは、周囲のマトリックスの再編成と劣化の両方を通じて発生し、通常は機械的剛性の増加と関連しています。指向性圧縮は、組織内にストレスフィールドを誘導することもでき、これを細胞化コンストラクトで操作して細胞の整列を促進することができます。これらの2つの画像は、両端に支柱がある3ミリメートル×17ミリメートルの長方形の型で成長した心臓組織構築物から撮影されました。

そして、これらの2つの画像は、制約を受けずに成長した心臓組織の構築物です。制約された2つのコンストラクトは、残りの2つの方向にのみ圧縮することができ、ストレスによる細胞の整列につながりました。この手法を習得すると、1日未満でカスタムティッシュ金型の設計、製造、実装に使用できます。

組織形成後、機械的試験や組織学などの他の方法を実行して、細胞の形態と組織機能に対するアライメントの影響をさらに理解することができます。このビデオを見れば、レーザーカットされたアクリルマスターからカスタムPDMSティッシュモールドを作製する方法を十分に理解できるはずです。