Name: カスタム設計されたレーザー エッチングのマスターから培養金型 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 学ぶレーザー加工アクリルマスターからPDMS培養金型を作製する手法。低コストで迅速に組織工学用ハイドロゲル金型を製作し、幾何学的制御による細胞配向と機械的特性解析を可能にする。

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著者は NIH R00 HL115123 とブラウン大学工学部からの資金を認めます。彼らは訓練のためブラウン デザイン ワーク ショップおよびクリス牛に感謝しています、レーザー カッターでサポートします。

<ol><li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscale+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Soft lithography for micro- and nanoscale patterning.</a> Nat. Protoc. 5, 491(2010).</li>
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</ol>

著者が明らかに何もありません。

組織培養と互換性のあるカスタムの PDMS 金型形状はあるセルの配置、拡散率、有効剛性などの重要なエンジニア リング組織プロパティをチューニングするための素晴らしいユーティリティです。さらに、これらの金型、ジオメトリは機械的テスト16,17など、重要な分析アプリケーションの組織を準備するため非常に便利です。否定的なマスター金型を提供しています時間と伝統的な微細加工に関連するコストと比べると、これらのツールを利用した迅速・簡便には、・低コスト法をカット レーザーからこれらのデバイスの準備します。レーザー切断は、カッターのベッドのサイズによってのみ制限さ最大金型の大きいサイズも可能です。我々 は正常にさまざまな設計された心臓ティッシュ、活動電位伝搬の光学マッピング、力生産とパッシブの機械的特性、および注入の評価などの研究を実行するのにこれらの汎用性の高い金型を使用しています。心筋梗塞13,18のラット モデル...

過去二十年以上ソフト リソグラフィに使用されています作製技術として広く特にマイクロ流体システム、材料研究と組織工学1、2の分野で科学的な研究をサポート 3。負のマスター型から所望の形状を持つオブジェクトを作成するレプリカ成形ヒドロゲルを形鋳造用、便利で低コストの製造方法 PDMS に複製は、正を使用ことができます提供しています。ただし、必要な負マスター金型は高価な時間のかかる、サイズに制限は、微細加工技術を使用して生成される通常、クリーン ルーム空間と高度な機器を必要とします。3 D プリントは、潜在的な代替手段を提供、その有用性はやや低価格プリンターと共通の 3 D プリンターのポリマーと硬化を阻害することができます PDMS の化学相互作用の解像度制限により限られています。
大幅により少なく高価なしたがってより研究ツールを製造するためのアクセス両方を切断、プラスチック、木材、ガラス、金属などの材料をエッチングできるレーザー カッター システムは近年します。商業用等級レーザー カッターは 25 μ m より小さい最小機能を備えたセンチ スケール上のオブジェクトの加工が可能なさらに最小限のトレーニング、専門知識、および使用する時間を必要とします。PDMS のアブレーションは、マイクロ流体デバイスの作製で以前使用されています、一方我々 の知識に原稿がプロセスを説明ないレーザー切断された否定的なマスター金型4 からミリとセンチ スケール金型を加工できます。.
栄養素の拡散、細胞の配置、および機械的性質5,6,7を向上させるために設計された組織の形状を操作する主にこのテクニックを使いました。ただし、この手法の汎用性は、成形ゲルが薬剤配達および材料科学研究8など、関心のある任意のフィールドで利用できます。レーザー カッターへのアクセス、PDMS 金型複製はほぼすべてジオメトリの場合 (つまり、本稿の範囲を超えているマルチパート金型なしの除去を阻害するだろう) のオーバー ハングせず作ることができるレーザーのベッドの寸法内に収まる。

<table><tbody><tr><td>Item</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウシフィブリノーゲン</td><td>シグマ</td><td>F8630-5G</td><td>コンストラクトウ</td></tr><tr><td>シマトロンビン</td><td>シグマ</td><td>T6634-250UN</td><td>コンストラクトウ</td></tr><tr><td>シマ</td><td></td><td>10820-25MGコンストラクトウシマ10820-25MG</td><td>コンストラクトラット</td></tr><tr><td>テールコラーゲンI、4mg / mL</td><td>アドバンスドバイオマトリックス</td><td>5153-100MG</td><td>コンストラクト</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td>フィ<td>ッシャーBP358-10</td><td>コンストラクト</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ14190-250</td><td>コンストラクト</td></tr><tr><td>ファインフォーセプス</td>ファイン<td>サイエンスツール</td><td>11252-20</td>コン<td>ストラクト</td></tr><tr><td>シルガード184シリコーンエラストマー</td><td>コーニング</td><td>4019862</td><td>PDMSモールド</td></tr><tr><td>ラボテープ</td><td>フィッシャー15-901-5R</td><td></td><td>PDMSモールド</td></tr><tr><td>アクリル、1/4" 厚い</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K356</td><td>PDMS金型</td></tr><tr><td>HEPES緩衝液、1メートル</td><td>シグマ</td><td>H3537-100ML</td><td>コンストラクト</td></tr><tr><td>RPMI 1640ミディアム、粉末</td><td>フィ</td><td>ッシャー31800-089</td>コン<td>ストラクト塩化</td></tr><tr><td>カルシウム二水和物</td>フィ<td>ッシャー</td><td>AC423520250</td>コン<td>ストラクトマグネシウム</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td>フィ<td>ッシャーM33 500</td><td>コンストラクト</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td>シ<td>グマ</td><td>P9541-500G</td><td>コンストラクトリン酸</td></tr><tr><td>ナトリウム二塩基性七水和物</td>シ<td>グマ</td><td>S9390-500G</td><td>コンストラクト</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>シグマ</td><td>G5767-25G</td><td>コンストラクトOCT</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>25608-930</td>組織<td>学</td></tr><tr><td>凍結ブロック金型VWR</td><td></td><td>25608-916</td>組織<td>学</td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td><td>フィッシャー</td><td>3530 1</td><td>Histology</td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Fisher</td><td>AC152880250</td><td>Histology</td></tr><tr><td>Fast green FCF</td><td>Fisher</td><td>AC410530250</td><td>Histology</td></tr><tr><td>SoftwareIllustrator</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Adobe Systems</td><td></td><td>Vector Graphics</td></tr><tr><td>Inkscape</td><td>(オープンソース)</td><td></td><td>Vector Graphics</td></tr><tr><td>UCP (ユニバーサルコントロールパネル)</td><td>ユニバーサルレーザーシステム レーザーカッター</td><td></td><td>インターフェース</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLS6.75 レーザーカッター</td><td>ユニバーサルレーザーシステム</td><td></td><td>レーザーカッター</td></tr><tr><td>マイクロメカニカルアナライザー</td><td>オーロラサイエンティフィック</td><td>1530A 5 mNロードセル付き</td><td>機械分析</td></tr></tbody></table>

カスタム設計されたレーザー エッチングのマスターから培養金型

Custom Engineered Tissue Culture Molds from Laser-etched Masters

組織工学の分野が成熟するにつれ組織形状を含む組織パラメーターの広い範囲で関心の高まりがあった。センチメートルのスケールにマイクロメータの組織形状を操作するで、セルの配置を直接し、効果的な機械的性質を変更し、栄養素の拡散に関連する制限に対処できます。さらに、ティッシュが用意されて容器は組織細胞とマトリックスの両方の構造に影響を与えることができますさらに応力場での機械的な制約を与えることができます。再現性の高い次元の形をした組織も、サンプルの寸法は、全体組織力学的解析など、重要なの in vitroアッセイするためのユーティリティがあります。
この原稿は、レーザー エッチングされたアクリルから調製した負のマスター金型を活用した代替製造方法をについて説明しますこれらの金型ポリジメチルシロキサン (PDMS) を発揮、センチ スケールと機能寸法とデザインを許可。25 μ m より小さいサイズし急速に設計し、作製、低コストと最小限の専門知識を持つ。最小限の時間とコストの要件は、最適なデザインを決定するまでに急速に反復処理してティッシュ エンジニア リングの分野を超えても含め関心の任意のアッセイに合わせて簡単に適応するレーザー エッチングされた金型の許可します。

レーザー カッターの光学系エッチング深さの増加と寸法は非常にわずかに減少するエッチング エリアとレーザー ビームの先を細くための結果金型の非常に微妙な傾斜が付いている壁。これはキャスト PDMS カビの除去を容易にするのに役立ちますが、負のマスター型を非常に深くエッチングする場合慎重に検討する必要があります (&gt; 6 mm) が必須です (図 1)。
培養時間をかけて cellularized 構造がマトリックス割合と程度をこれに足場構成、セルの負荷によって異なりますが発生しますしかし、改造、培養条件により圧縮されます。
マトリックス改造再編と、周囲マトリックス (と同様の新しいマトリックスの沈着)、劣化を発生しますが、通常断面積の減少に伴う機械的剛性の増加に関連付け...

ここハイドロゲルを用いた複雑な形状設計組織を生成するために使用できるカスタム ポリジメチルシロキサン金型を製造するため急速な安易なと低コスト手法を提案します。さらにこの手法を使用して生産設計された心臓ティッシュの実施される力学的および組織学的評価の結果について述べる。

As the field of tissue engineering has continued to mature, there has been increased interest in a wide range of tissue parameters, including tissue ...

この方法は、組織発生、細胞アラインメント、およびポリマーと人工組織の機械的分析に関連する組織工学分野の研究を促進することができます。この手法の主な利点は、低コストで使いやすく、高速であることです。私の研究室でこの手法を開発したのは、現場ではミリメートルからセンチメートルスケールの人工組織の幾何学的制御が行われておらず、人工組織のサイズのスケールアップについて並進的に考える必要があると考えたからです。この技術により、ポストやさまざまな形状を使用した作製技術により、細胞生理学や人工組織に対する幾何学的なキューの利点を活用できます。この方法により、制御されたサイズ、形状、および整列した人工組織の作製に関する洞察を得ることができます。また、さまざまな疾患モデル、個別化再生医療、および人工組織の前臨床研究への翻訳にも適用できます。まず、コンピューターでベクターグラフィックスプログラムを開きます。目的の金型形状とベクトル形式を準備するには、RGB カラー形式で適切な寸法の新しいキャンバスを開きます。次に、左側のパネルから形状ツールを選択し、ウィンドウの上部に寸法を入力して目的のジオメトリを作成し、形状サイズを正確に定義します。最も外側のフィーチャの端から少なくとも 6 mm の境界が得られるように金型形状を設計し、金型鋳造後に PDMS メニスカスをトリミングできるように切断線を設計します。これにより、完成した型を培養皿の底と同じ高さに置くことができます。次に、ウィンドウの左上隅にあるカラーピッカーを開き、レーザーカッターソフトウェアと互換性のある新しいカラースウォッチを定義します。各パスを選択し、カットスウォッチから適切なカラーを割り当てます。終了したら、塗りつぶしの色に None を割り当てます。同様に、エッチングパスにスウォッチカラーを割り当てるには、オブジェクトを選択し、カラーピッカーで塗りのカラーにエッチングパスを選択し、パスカラーに「なし」を選択します。ベクターグラフィックプログラムとレーザーカッターに適した形式に応じて、デザインをAI形式or. pdfファイル形式のいずれかとして保存します。メーカーの仕様に従ってレーザーカッターを切断する準備をし、十分な換気が使用されていることを確認してください。次に、1/4インチのアクリルシートをレーザーベッドに置きます。ベッドの高さを調整して、アクリルに適切に調整します。次に、レーザーカッターに接続されたコンピューターでデザインファイルを開き、[印刷]メニューを開きます。レーザーカッターがプリンターとして設定されていること、およびデザインの歪みを防ぐために、[スケーリング]ドロップダウンメニューで[スケーリングしない]が選択されていることを確認します。次に、 印刷 ダイアログの下部にあるボタン。レーザーカッター印刷ユーティリティで、設定ボタンをクリックして、各設計機能のカットエッチングパラメータを設定します。ここでは、以前に選択した各色のパワー、速度、およびパルス/インチのパラメーターを設定します。設定を入力したら、レーザーカッターソフトウェアの大きな緑色のボタンをクリックします。これにより、レーザーカッターがネガマスターモールドのエッチングとカットを開始します。最後に、小さなブラシまたは圧縮空気を使用して、ネガティブマスターモールドから残留物を取り除きます。これにより、PDMSキャスティング用の表面が準備されます。PDMSキャスティングミックスは、メーカーの仕様に従って調製します。準備したPDMSを、標準ラインの真空ラボに接続された真空チャンバー内で1時間、またはすべての気泡が除去されるまで脱気します。PDMSの脱気中に、金型の外縁をビニールテープまたはマスキングテープで取り、テープがネガマスター金型のエッチング面から少なくとも3ミリメートル上に伸びるようにします。テープを型枠の側面にしっかりと押し付けて、後から漏れないようにしてください。次に、PDMSの厚さが最小1.5mmに達するように、PDMSをマスターモールドに約0.35ミリリットル/センチメートルの正方形を流し込みます。PDMSコーティングされたネガティブマスターモールドを真空チャンバーに入れ、1時間またはすべての気泡が除去されるまで再度脱気します。次に、脱気したPDMSコーティングされたネガティブマスターモールドを、摂氏60度のオーブンの水平棚に少なくとも6時間置き、PDMSを硬化させます。硬化したら、かみそりの刃を使用して、ネガマスターモールドに残っている間に個々のモールドを切断します。次に、各PDMSモールドをネガティブマスターモールドからゆっくりと慎重に剥がします。半月板のある領域を鋳造から切り取り、金型が平らになるのを防ぎ、余分な材料や破片を防ぎます。最後に、標準的なオートクレーブサイクルを使用して型をオートクレーブし、組織培養のために型を滅菌します。まず、未処理のプラスチックプレートに金型を接着します。フィブリノーゲン、トロンビン、および中和コラーゲン溶液を調製し、添付のテキストプロトコールに記載されているように目的の細胞を回収します。フィブリノーゲン、中和コラーゲン、細胞懸濁液を組み合わせ、キャスティングミックスを作製します。キャスティングミックスを氷の上に保ちます。次に、ハンドヘルド高周波発生器を使用して、鋳造混合物にさらされる金型の表面を処理し、PDMSの疎水性を軽減します。材料を鋳造する約5分前に、表面をプラズマ処理に3〜5秒さらします。タンパク質細胞混合物をキャストする直前に、トロンビンをキャスティングミックスに加え、気泡を入らないように静かに上下にピペットで動かします。迅速に作業し、キャスティングミックスを金型にピペットで固定し、金型のすべてのコーナーと隙間に混合物を堆積させます。コンストラクト内で気泡が形成されるのを防ぐために、ピペットの最初のストップを超えて混合物を排出しないでください。次に、サンプルを加湿した摂氏37度のインキュベーターに45分間入れます。45分後、コンストラクトをフードに戻し、細胞培地で覆ってからインキュベーターに戻します。細胞培地は、細胞およびコンストラクトの種類に応じて、必要に応じて48〜72時間ごとに交換します。最後に、添付のテキストプロトコールに従って、コンストラクトの組織圧縮および引張特性を定量化し、さまざまな染色技術を準備し、細胞のアライメントを測定します。時間と培養が進むと、細胞化したコンストラクトはマトリックスのリモデリングによりコンパクトになります。これは、周囲のマトリックスの再編成と劣化の両方を通じて発生し、通常は機械的剛性の増加と関連しています。指向性圧縮は、組織内にストレスフィールドを誘導することもでき、これを細胞化コンストラクトで操作して細胞の整列を促進することができます。これらの2つの画像は、両端に支柱がある3ミリメートル×17ミリメートルの長方形の型で成長した心臓組織構築物から撮影されました。そして、これらの2つの画像は、制約を受けずに成長した心臓組織の構築物です。制約された2つのコンストラクトは、残りの2つの方向にのみ圧縮することができ、ストレスによる細胞の整列につながりました。この手法を習得すると、1日未満でカスタムティッシュ金型の設計、製造、実装に使用できます。組織形成後、機械的試験や組織学などの他の方法を実行して、細胞の形態と組織機能に対するアライメントの影響をさらに理解することができます。このビデオを見れば、レーザーカットされたアクリルマスターからカスタムPDMSティッシュモールドを作製する方法を十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

マルチコンパートメントのCNSニューロングリア共培養マイクロ流体プラットフォーム

このプロトコルでは、我々は技術がベースとなっている垂直方向に変位の記事のマイクロアクチュエータアレイの製作、そしてどのようにこの基盤技術は2次元と3次元の両方の文化の中でハイスループット機械的にダイナミックな細胞培養を実施するように変更することができますを示していますパラダイム。...

機械的にダイナミックな細胞培養のための微細加工プラットフォーム

がん幹細胞の移動を調査するための区分するマイクロ流体デバイスが記載されている。この小説のプラットフォームは、生存細胞の微小環境を作成し、生細胞運動の微視的な可視化を可能にします。非常に運動性のがん細胞は、潜在的に、より効果的な将来の治療法につながる積極的な浸潤の分子メカニズムを研究するために隔離されています。...

区分するマイクロ流体デバイスとライブセルイメージングを使用した癌幹細胞の移行の評価

この記事では、細胞の自己組織化による細胞由来の組織のリングを作成するには、汎用的な方法を概説します。平滑筋細胞は、リング状のアガロース井戸の集合体と7日以内に強固な3次元（3D）の組織を形成するために契約に播種。ミリスケールの組織のリングは機械的なテストに資するものであり、組織の組み立てのためのビルディングブロックとして機能する。...

生体力学的解析と組織工学のための細胞由来の組織のリングを製作する監督セルラーセルフアセンブリ

ここでは、組織工学のための異なった層の間の連続的なインタフェースを備えた生体適合性、階層化行列を作成するための独自の戦略を説明します。このような足場は、様々な生物学的、化学的または機械的な手がかりによって細胞の挙動を調節するのに理想的なカスタマイズ可能な環境を提供することができます...

密度勾配多層重合（DGMP）：マルチコンパートメントを作成するための新規な技術、組織工学のためのカスタマイズ可能な足場

この原稿は、細胞外マトリックスに囲まれた定義された幾何学的形状の3次元（3D）上皮組織の均一な配​​列を操作するソフトリソグラフィーベースの技術が記載されています。この方法は、細胞の種類および実験の文脈の多種多様に適していると同一の​​複製のハイスループットスクリーニングを可能にします。...

細胞外マトリックス内に埋め込まれたエンジニアリング三次元上皮組織

このプロトコルでは、カスタマイズされた 3 D プリントのプラスチック金型を使用して可変サイズの自己生成組織リングを製造するためのプラットフォームについて説明します。3 D プリントされた鋳型の硬化 PDMS ネガアガロースは硬化の PDMS ネガのキャストになります。セルがどこ彼らは組織リングに集計結果の agarose...

細胞播種用カスタム Agarose 井戸とティッシュ リング自己組織型の 3 D プリントを使用しての作製

ここで提示されるプロトコルは、機械研究、疾患モデリング、およびスクリーニング用途に適した、二重極を有するマルチウェルプレートで48組織の平行培養のための設計された結合組織を生成するプロトコルである。プロトコルは、異なる臓器や種からの線維芽細胞と互換性があり、ヒトの原発性心臓線維芽細胞とここで例示される。...

スクリーニング用途のための線維芽細胞由来ヒト工学的結合組織

この論文は、オルガノイドを培養し、高解像度顕微鏡を使用して観察できる、mm2あたり数百のマイクロコンテナを備えた新しいタイプの培養基質の製造プロトコルを提示します。細胞播種および免疫染色プロトコルも詳述されています。...

オルガノイドの培養および3Dイメージングのためのハイスループットプラットフォーム

in vitro の配偶子形成を補完する新しい足場を含まないアガロースカビで卵胞を培養する方法について説明します。...

足場のないマウス卵胞培養のためのカスタマイズ可能なアガロースモールドの製造と使用

学ぶレーザー加工アクリルマスターからPDMS培養金型を作製する手法。低コストで迅速に組織工学用ハイドロゲル金型を製作し、幾何学的制御による細胞配向と機械的特性解析を可能にする。

カスタム設計されたレーザーエッチングのマスターから培養金型

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