Name: 重複2法による相乗効果の薬剤の組合せの高スループット識別 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 学ぶ 重複²法による高スループットスクリーニングで相乗効果を示す薬剤組み合わせを同定する手法。薬剤耐性感染症の治療戦略改善に貢献し、前臨床評価への応用が期待されます。

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この作品は、J.C.S.B. にユタ大学の病理からのスタートアップ助成金によって支えられました。

1. 重複2法 (O2M) による化学遺伝学データセットから相乗効果予測の突然変異を識別します。
注: これはニコルズらから公開されたデータセットを使用したシナジー予測変異を識別する方法です。17 大腸菌。ただし、これは任意の化学遺伝学データセットや微生物を行うことができます。これらのデータ セットには、各変異体それぞれの小さな分子の量的成長スコアを与える以上 100 の小さな分子の存在下で成長してノックアウト変異のライブラリが含まれています。知られなければ 1 つ相乗ペアと、データセットに含まれる両方の小さい分子の成長スコアする必要があります。
<ol><li>
各小分子の単一濃度の存在下で成長してすべての突然変異体の平均成長スコアと標準偏差を計算します。 メモ: これは実行することができます、スプレッドシート ソフトウェアを使用します。ブラウンの実験室を使用して、Excel や関数 =AVERAGE(B3:B3981) および小分子の各列の計算のための =STDEV(B3:B3981)。<ol>
<li>別のデータセットを使用している場合、この方向が異なる可能性がありますが、手段と小分子の各列からの標準偏差を計算します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>・ ニコルズらから同じデータセットを使用した小分子の各濃度の Z スコアを計算します。スプレッドシート プログラムで17 。このため、負の z スコアになります Z(2.5) = 意味 - 2.5 * 標準偏差と正の z スコア Z(2.5) になります = 平均 + 2.5 * 標準偏差。</li>
	<li>遺伝子変異体を含むそれらの分子のすべての濃度を確認されている既知の相乗ペアを作る小さな分子で重要な Z スコアを決定します。否定的な Z (2.5) 未満の変異体のスコアは、成長スコアまたはその小さな分子のための肯定的な Z (2.5) のスコアをより大きく、重要なと見なされます。</li>
	<li>オペロンに属している重大な遺伝子変異体のいずれかを決定します。 注:エシェリヒア属大腸菌、著者チェックお勧めします「Ecoli wiki」の情報について遺伝子がコードする RNA の一部として書き換えられます。</li>
	<li>異なる濃度で興味の小さい分子の大部分に共通する遺伝子/オペロン変異体を特定 (e.g抗生物質のトリメトプリムと相乗作用分子を識別する重要な Z を示す変異体を探しているとき、。スコア トリメトプリムとスルファメトキサゾールなど sulfamethizole 知られている相乗パートナーの存在下で育てられたとき)。これらは推定上シナジー予測変異体です。</li>
</ol>2. O2M によって化学遺伝学データセット内の Synergizers の予測
<ol><li>データセット17に戻ると、シナジー予測突然変異体から大きな成長スコアを引き出す小さな分子の各濃度を特定します。これは、Z スコアの小さい分子の各濃度の計算を見ることによって行われます。もう一度、大きな成長スコアは小分子の濃度の正の Z スコアを超える負の Z スコアよりも小さいかです。 注: 分子は、1 つでもその濃度に表示されている場合は、予測 synergizer が分子で見なされます。大きな成長スコアは発生しませんすべての分子は、予測非 synergizer です。</li>
</ol>3. 予測の相乗作用の検証
<ol><li>予測 synergizers の最小発育阻止濃度 (MIC) を見つけます。
	<ol>
<li>M9 最小媒体を 37 ° C での大腸菌の一晩の文化を育てる 注: 任意の一晩の文化は興味の有機体のための適切に定義された媒体で栽培できます。ブラウンの実験室では、LB や YPD のようなリッチ メディアは推奨しません。M9 最小媒体で構成される 10.5 g/L M9 スープ 0.2% カザミノ酸、0.1 M CaCl20.4% グルコース、1 M MgSO40.25% ニコチン酸 0.33% チアミン H2o.</li>
		<li>MIC データの関心の病原体は小分子を受け取ったら文学溶解する場合ないジメチルスルホキシド (DMSO) で高濃度 (&gt; 10 mg/mL)。</li>
		<li>96 ウェル プレートで、M9 媒体の 100 μ L を各ウェルに追加します。200 μ L の合計が含まれていますので、M9 媒体の余分な 100 μ L を列 1 に追加します。</li>
		<li>1 列目の集中の小分子ソリューションの任意の量 (~ 10 μ L) を追加します。列 1 (プレートごと 8 小分子) の井戸あたり 1 つの小さい分子。 注: これらは相乗効果と予測されている関心の小さな分子です。ブラウンの実験室は一般に大腸菌を抑制することができます 100 %dmso 量以下である高濃度低分子溶液 10 μ L を追加します。</li>
		<li>小さな分子を追加すると、プレートの x 軸では小分子を希釈します。1 列からソリューションの 100 μ L を取る、2 列の配置し、混ぜます。列 2 から 100 μ L を取るの 3 列配置し、混ぜます。100 μ L は 11 の列に配置されるまで、このプロセスを続けます。ミックス 11 列、その列から 100 μ L を取るし、破棄します。データを正規化するだけのメディアで 12 列をまま。</li>
		<li>プレートを接種します。一晩かけて培養から光学濃度 (OD600) を取得します。文化と 0.002 の OD600 M9 メディア ソリューションを準備 (または興味の目的の有機体のための 500 細胞/μ L を表す濃度を適切な)。ウェルあたり 1000 個の細胞がありますので、プレートの各ウェルに培養液 2 μ L をピペットします。</li>
		<li>優しくプレートを振るし、読んで 0 h の OD600を取得します。24 時間取得を読んで 24 時間外径600の 37 ° C で成長板ができます。 注: 適切な関心を持つ他の有機体の条件を成長しています。</li>
		<li>よくスプレッドシート プログラムを使用してそれぞれの純成長率を計算します。</li>
		<li>取得平均ない薬成長する 12 柱の純成長率を平均します。スプレッドシート ソフトウェアを使用していない薬剤成長のなかに他の井戸を正規化します。10% 未満で、よく探して、MIC90 を識別するために成長します。50% 未満でも成長を示します、MIC50。これらの井戸で小さな分子の濃度を計算します。</li>
	</ol></li>
	<li>相乗作用の市松模様の試金
	<ol>
<li>前に、として M9 最小媒体のエシェリヒア属大腸菌の一晩の文化を育てます。 注: 適切な成長する他の有機体のための条件。</li>
		<li>M9 媒体の 100 μ L を各ウェルの 96 ウェル プレートと 1 列目の余分な 100 μ L に追加します。</li>
		<li>テスト小分子を追加 (~ 8 時マイク x) 各列 1 でよく、濃度 2 倍を追加 (~ 16 マイク x) も A1 に (1 つの小さな分子テスト プレートごと)。 注: この金額マイク テスト完了前から決定され、それぞれの潜在的な synergizer は異なります。</li>
		<li>X 軸の列 1 から 100 μ L を取り、列 2 に転送することによってグラデーションの希釈を作成します。11 列に 100 μ L を追加するまで、このプロセスを続けます。ミックス、列 11 から 100 μ L を取るし、処分します。12 (図 1 a) の列に任意の薬物を追加しないでください。</li>
		<li>入力の薬を y 軸に 2 つ目の薬のグラデーションを設定します。A. ミックスの行入力分子のマイクと行 A および B. 続行に 100 μ L が g. ミックスの行に配置されるまでを置くことから前に、希釈として、100 μ L x 2 を含むメディアの 100 μ L を追加、100 μ L と dispose をように行秀の任意入力の薬剤を追加これにより、H の行と列 (図 1 b) テスト薬ペアの個々 のマイクを含む 12。</li>
		<li>プレートを接種します。外径600 0.002 の大腸菌培養の 2 μ L を各ウェル (ウェルあたり 1,000 セル) に追加します。</li>
		<li>0 h 読書用プレートの各ウェルの OD600を測定します。</li>
		<li>37 ° C で 24 時間のプレートを孵化させなさい</li>
		<li>24 h での OD600を測定します。</li>
	</ol></li>
	<li>チェッカー ボードから小数の発育阻止濃度指数 (FICI) を計算します。
	<ol>
<li>スプレッドシート プログラムで 24 h で OD600 0 h 外径600を減算することによって、プレートの各ウェルの純成長率を計算します。</li>
		<li>除して各も H12 は、小分子が含まれていないソフトウェアの成長を正常化します。</li>
		<li>12 欄入力分子の MIC90 と行英に潜在的なレチノイドシナジストの MIC90 を見つける</li>
		<li>90% の成長を阻害するすべての井戸を探します。</li>
		<li>いずれか最も低い (相乗) 以下よくのため FICI90 を計算または最高 (拮抗) 上記方程式を使用して、両方の MIC90 値。 <img alt="FIC指数式、薬物相互作用解析の方程式、相乗効果定量法" src="/files/ftp_upload/57241/57241eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1">
</li>
		<li>任意 FICI ≤ 0.5 として相乗効果を検討、FICI ≥ 4 拮抗 (図 2)。 注: これも行えます MIC50 と (成長の 50% 阻害) それらの MIC の値に基づいて、FICI50 を取得します。</li>
	</ol></li>
	<li>ブリス独立アッセイ 注: 至福の独立は、独自に、マイクを持っていなかったすべての潜在的なレチノイドシナジストが実行されます。<ol>
<li>37 ° C で M9 媒体のエシェリヒア属大腸菌の一晩文化を前に成長します。 注: 再度、関心を持つ他の有機体の適切な成長条件使用できますこの手順で。</li>
		<li>潜在的な相乗的分子、入力分子、組み合わせ、および無処理コントロール テストの 96 ウェルのプレートを準備します。</li>
		<li>M9 媒体の 50 μ L を各ウェルに追加することによって潜在的なレチノイドシナジスト プレートを作成します。行の各ウェルに、潜在的なレチノイドシナジストの設定濃度 (10 μ M または 100 μ M) を含むメディアの 50 μ L を追加します。プレートごと 8 分子をテストします。</li>
		<li>メディアの 50 μ L を各ウェルに追加することによって入力分子プレートを作成します。4 x を含む 50 μ L を追加 1 列目のウェルに入力薬剤の MIC。マイク板、列 1 から 50 μ L を取り、分散、2 カラムで混合する x 軸に沿ってグラデーション希釈を作成します。列、12 列 12 から 50 μ L を破棄までこのプロセスを続行します。各ウェルの最後の合計は 100 μ L 各ウェルにメディアの追加の 50 μ L を追加します。</li>
		<li>96 ウェル プレートを使用したコンビネーション プレートの作成、メディアの 50 μ L を各ウェルに追加します。4 x を含む 50 μ L を追加 1 列目のウェルに入力薬剤の MIC。X 軸のマイク プレート、列 1 から 50 μ L を取り、分散、列 2 の混合のように希釈します。これは列、12 列 12 から 50 μ L を破棄に全体の方法を続けます。10 μ M または行の各ウェルに 100 μ M で潜在的なレチノイドシナジストを含むメディアの 50 μ L を追加します。もう一度、1 つの濃度または行ごと薬する必要があります。</li>
		<li>無処理コントロールを作成するには、プレートのすべての井戸に M9 媒体の 100 μ L を追加します。</li>
		<li>前に各同様に 0.002 や 1000 個の細胞の OD600細菌培養の 2 μ L を追加することによってすべてのプレートを接種します。</li>
		<li>0 から 24 h での OD600を測定します。</li>
	</ol></li>
	<li>至福の独立性スコアを計算します。
	<ol>
<li>スプレッドシート プログラムを使用して 24 h に成長から 0 h 外径600を減算することによって、プレートの各ウェルの純成長率を計算します。</li>
		<li>スプレッドシート プログラムでない薬板から平均成長率に井戸を正規化します。</li>
		<li>表計算ソフトを使用して、1 から純増を差し引くことによって阻害を計算します。</li>
		<li>表計算ソフトで入力のグラデーションのみを含む制御板の列を平均します。</li>
		<li>式により各ウェルのブリス スコアを計算します。 至福のスコアも X を組み合わせる- (よく X + 入力列 X) =
</li>
		<li>入力の MIC90 の下の井戸で負のスコアを探してください。 注: 複数の濃度間で負のスコアの相乗作用を示します。</li>
	</ol></li>
</ol>4. 高スループット画面新規相乗ペアを識別するシナジー予測変異
<ol><li>
シナジー予測変異体を特定します。 注: ステップ 1.5 には、推定されるシナジー予測変異が識別されます。ここでは、相乗効果の薬剤のための高スループット画面で最高機能するこれらの変異体を決定します。Bioscreen マシンでこのアッセイを行ったが、96 well プレート リーダーは許容する必要があります。<ol>
<li>各推定シナジー予測変異体と野生型細胞 M9 最小媒体を成長します。</li>
		<li>100 の設定も適切な成長媒体、成長培地 + 入力薬、成長培地 + 入力薬物と成長培地 + 知られていた非相乗薬剤知られている相乗パートナー プレート (または 96 ウェル プレート) をハニカムします。車両のコントロールを含めることを確認します。 注: 各ひずみ/薬/集中のための井戸を複製 4 をお勧めします。</li>
		<li>まあ、空白制御井戸を含むあたり 1000 個の細胞を接種します。</li>
		<li>37 ° c、振動、48 h を成長し、OD600 20 分毎を読みます。</li>
		<li>予測入力の薬と知られている相乗パートナーの存在下で変異細胞に野生型との相乗効果の最大の成長の違いを示す薬物濃度と時間のポイントを決定します。最適な時点で濃度、べきである多く成長違い野生型と相乗効果予測変異細胞 (図 3) の入力の薬物と相乗的行動に知られている薬の存在下で成長しました。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
相乗効果の薬剤のための高スループット画面
	<ol>
<li>野生型細胞とシナジー予測変異細胞 M9 最小媒体を成長します。 注: は、関心の有機体の適切な成長媒体を使用します。</li>
		<li>ライブラリからメディアにそれぞれを前の手順で設定濃度で低分子 100 μ L メディアが含まれる薬を追加します。(セル) を持たない空井戸などの車両コントロールと井戸 (e.g。、DMSO) 薬剤希釈車両によって任意の成長の抑制を考慮します。<ol>
<li>プレート、よく位置の影響を考慮して板に理想的に散在しているあたり、少なくとも 4 つの車両制御井戸を準備します。試金は変数である場合、行/列あたりも、少なくとも 1 つの車両の制御を含めるし、全体板 (ステップ 4.2.5) の代わりに各の行/列の Z スコアを計算するコントロールとしてよく行/列の各コントロールを使用します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>前に各同様に文化の 2 μ L を追加します。(野生型細菌と予測シナジー変異バクテリア用プレート 1 枚用プレート 1 枚)。</li>
		<li>クリプトコッカスに対する 0 と 18 h大腸菌または 48 h で OD600を評価します。</li>
		<li>表計算ソフトを使用して、車両制御井戸から空白の井戸の OD600を引いて純成長率を計算します。Z スコアが-2.5 の井戸を識別 (Z スコア = 平均 - 2.5 * 標準偏差)。これらの井戸には、潜在的なレチノイドシナジスト小分子が含まれています。</li>
		<li>手順 3 で説明した方法を使用して画面のヒットを検証します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

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相乗効果の小さい分子のペアは、微生物感染症の治療に強力なツールをすることができますまだ彼ら相乗ペアが識別するために挑戦的なのでその完全臨床的可能性に達していません。本稿では、シンプルなペアの組み合わせよりもはるかに高速の相乗組み合わせを識別するためのメソッドについて説明します。化学遺伝学データセットを使用して、O2M は相乗的組み合わせを予測するために小分子の画面サイズの大きなライブラリに読み出しとして使用することができます遺伝子ノックアウトと変異を識別します。小さな分子を予測する能力は相乗パートナーの大規模識別のため順番に画面の高いスケーラビリティのためことができます。相乗ペアを識別した後 1 つは、分子機構の基になる相乗作用を解明し、追加相乗ペア11の合理的設計できます。
O2M は、化学遺伝学的データセットと知られている相乗ペアに必要です。幸いにも、化学遺伝学データセットはさまざまな微生物19,20,<...

抗生物質耐性菌は、1CDC によると米国の毎年以上 200 万感染症や 23,000 の死を引き起こします。新しい治療法は、これらの感染症を克服するために必要です。これらの新しい治療法を特定する戦略には、新しい抗菌薬の開発や小さな分子微生物感染症2,3、4を治療するために他の条件のために承認の転用が含まれます。しかし、新しい薬剤の発見は非常に高価な時間のかかるです。新薬を識別できないことがあります薬を転用または薬剤ターゲット5,6。私たちの研究室は、相乗的組み合わせ療法として知られている 3 番目の戦略について説明します。相乗的な組み合わせは、2 つの小さい分子は一緒に彼らの個々 の効能7の添加効果より大きい薬効を持つ場合に発生します。さらに、相乗的な組み合わせすることができますレンダリングすること偉大な潜在的な8,9、以下の不要なオフターゲット効果だけでなくペアの小さな分子のいずれかに耐性病原体に対して有効であります。 10。
相乗ペアは、薬物の組み合わせ11,12,13の約 4-10% に発生するまれな。このように、ペアワイズ画面などの伝統的な技法、挑戦的な 100 分子の小さなライブラリからの潜在的な組み合わせの何千もの時間がかかる。さらに、相乗作用通常予測できない化合物14の活動から。ただし、相乗的組み合わせは、重複2メソッド (O2M)12と呼ばれる画面に高スループットのアプローチを開発しました。このメソッドは、ここで説明はこれらの相乗のペアをより速くより効率的な識別するためことができます。O2M は、知られている相乗ペアと化学遺伝学データセットの使用を必要とします。ノックアウト変異体のライブラリは、多くの異なる小さな分子の存在下で育てられたとき、化学遺伝学データセットが生成されます。その同じ突然変異体の表現型を引き出す他の小さな分子が既知の各メンバーと相乗効果も知られている相乗ペアで 1 つの分子が 2 番目の相乗的分子として特定ノックアウト変異体から同じ表現型を引き起こす場合相乗のペア。この根拠は、相乗抗生物質ペアエシェリヒア属大腸菌 (E. 大腸菌)に対してアクティブと病原性の真菌クリプトコッカス ・ ネオフォルマンス(c. に対してアクティブな相乗的抗真菌薬のペアを識別するブラウンの実験室で使用されていますネオフォルマンス)11,12。O2M は様々 な病原体に適応できるだけでなく、分子の大規模なライブラリのスクリーニングは、簡単かつ迅速に相乗のペアを識別します。O2M によって識別される遺伝的変異スクリーニングの相乗効果の予測小さな分子のみを検証することができます。したがって、あった場合のみ 20 分子の相乗効果を予測したライブラリで、今相乗効果の試験日の問題を受け取る一方で、2,000 分子ライブラリーのペアワイズ テストと、月がかかるでしょう。O2M は、プログラミングスキルは不要、必要な機器はほとんどのラボや中核施設で利用可能です。薬の組み合わせに興味がある研究者に加えて O2M 分析薬物画面が完了し、重要な薬物相互作用を識別することによって彼らのヒット曲を拡大したい人誰にも興味深いものです。以下、細菌、相乗効果の小さい分子を識別するだけでなく、よく知られている試金15,16の予測の相乗作用を検証するプロトコルです。

<table><tbody><tr><td>Bioscreen C</td><td>の器械</td><td>の成長のカーブUSA</td><td></td></tr><tr><td>相乗効果H1</td><td>器械</td><td>BioTek</td><td></td></tr><tr><td>M9のスープ</td><td>の試薬</td><td>Amresco</td><td>J863-500G</td></tr><tr><td>Casaminoの酸の</td><td>試薬</td><td>フィッシャー科学</td><td>BP1424-500</td></tr><tr><td>ブドウ糖</td><td>の試薬</td><td>ΣG7021-10KG</td><td></td></tr><tr><td>のニコチン酸</td><td>の試薬</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12683</td></tr><tr><td>Thiamine</td><td>reagent</td><td>Acros Organics 148991000</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 二水和物</td><td>試薬</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td></tr><tr><td>MgSO4 Heptahydrate</td><td>reagent</td><td>Fisher</td><td>M63-500</td></tr><tr><td>化学遺伝学データセット</td><td>データセット</td><td>の例には、Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others が含まれます本文中で引用されています。</td><td></td></tr><tr><td>トリメトプリム(インプット薬の例;どれでも使用可能)</td><td>試薬</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>ICN19552701</td></tr><tr><td>スルファメトキサゾール(試験薬の例;どれでも使用可能)</td><td>試薬</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td><td>ック ICN15671125</td></tr></tbody></table>

重複2法による相乗効果の薬剤の組合せの高スループット識別

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

抗菌薬は20 世紀に劇的に寿命や生活の質を増加している、抗菌薬耐性は、全身性の感染症を治療するために私たちの社会全体の能力を脅かしています。単独で米国で抗生物質耐性感染症は年とコスト追加医療で約 200 億米ドル約 23,000 人を殺します。抗菌薬耐性に対処する方法の 1 つは療法前に感染源の生物とその薬剤耐性プロファイルが確認されている感染症の重要な初期段階で特に有用であります。多くの抗菌薬治療は併用療法を使用します。しかし、これらの組み合わせのほとんどは、添加剤、結合された効果は個々 の抗生物質の効果の合計と同じであることを意味します。いくつかの併用療法は相乗効果: 結合された効果は添加物よりもはるかに大きい。相乗的な組み合わせは、抗菌薬耐性菌の成長を抑えることができますので特に便利です。ただし、これらの組み合わせが珍しいとを識別することは困難です。これはペアの方法でテストするために必要な分子の膨大な数によるもの: 1,000 分子のライブラリには 100 万の潜在的な組み合わせ。したがって、相乗効果のための分子を予測する努力がされました。この資料では、重複2法 (O2M) として知られている小分子で相乗ペアを予測するための私たちの高スループット方法について説明します。O2M が過敏相乗ペアの各分子が他の分子に変異を識別するのに化学遺伝的データセットのパターンを使用します。ブラウンの実験室は、変異がない野生型の細胞の増殖を抑制する分子の高スループットの画面を実行することによってこの成長の違いを悪用します。ラボの仕事は、以前抗生物質のトリメトプリムと抗真菌薬のフルコナゾールこの戦略を使用して相乗効果の分子を識別されます。著者らは、複数の微生物のため変更することができます新しい相乗的な組み合わせの方法画面を紹介します。

市松模様の試金は、相乗作用を測定するための半定量的方法です。出力の最終的なスコア、FICI、決定薬の組み合わせ相乗 (FICI ≤0.5) を考えると、非相互作用 (0.5 &lt; FICI &lt; 4)、または拮抗 (FICI ≥4.0)。図 1は、市松模様のアッセイで薬物グラデーションを設定する方法を示しています。図 2は、一般的な結果を示しています。90% の成長阻害未満表示成長 (紫井戸) を検討してください。プレートの各ウェルの OD600を測定した後我々 はすべてなしの薬物コントロールにも正規化します。正規化された値で何か &gt; 0.1 (よくコントロールの OD600の 10%) を獲得して「成長」.FICI スコアすることができますが異なりますも拾うは、;よくは、各プレートの最も低い FICI を選択します。図 2 a、よく f...

相乗効果の薬剤の組み合わせは難しいと経験的に識別するために時間がかかるです。ここでは、識別し相乗小分子を検証する手法について述べる。

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

この方法論の全体的な目標は、ハイスループットスクリーニングを通じて組み合わせた場合に、互いの活性を増幅する相乗分子を特定することです。相乗効果のある薬剤ペアは、薬剤耐性感染症と闘うための有望な戦略ですが、特定するのが困難です。この手法は、感染症の治療に用いられている既存の抗菌薬と相互作用する分子を同定することができます。長期的には、これらの組み合わせは前臨床評価に入り、最終的には患者ケアを改善することができます。この技術の主な利点は、関心のある任意の生物および小分子の任意のライブラリで実行できることです。この技術の意味は、関心のあるあらゆる生物に作用するため、複数の感染症の治療にまで及びます。標準的なスプレッドシートを使用して、特定の濃度の低分子が添加された存在下で、すべての変異体の平均成長スコアと標準偏差を計算します。次に、各小分子濃度のZスコアを計算します。次に、有意なZスコアを持つ遺伝子変異体を強調表示します。まず、大腸菌培養物をM9最小培地で、摂氏37度で一晩育てます。次に、小分子をジメチルスルホキシドに10ミリグラム/ミリリットルを超える高濃度で溶解します。次に、100マイクロリットルのM9培地を96ウェルプレートの各ウェルに加えます。さらに 100 マイクロリットルの M9 培地をカラム 1 にピペットで入れ、そのカラムの容量が 200 マイクロリットルになるようにします。次に、約10マイクロリットルの濃縮小分子溶液をカラム1に追加します。小分子を加えた後、プレートのX軸全体で希釈を開始します。11列目に100マイクロリットルになるまで希釈を続けます。カラム11を混合した後、そのカラムから100マイクロリットルを廃棄する。データを正規化するために、列12にmediumのみが存在するとします。次に、M9最小培地で成長させた一晩培養物の600ナノメートルでの光学密度値を記録します。次に、各ウェルに2マイクロリットルの培養物を追加します。ウェルあたり1000個の細胞が存在するようなものです。その後、プレートを軽く振ってください。また、ゼロ時間時点の600ナノメートルでの光学密度の読み取り値に注意してください。読み取り値が記録されたら、プレートを摂氏37度で1日インキュベートします。再度、24時間時点の600ナノメートルでの光学密度値を測定します。チェッカーボードアッセイを行うには、大腸菌培養物をM9最小培地で摂氏37度で一晩増殖させます。次に、100マイクロリットルのM9培地を各ウェルに加え、96ウェルプレートの列1に同じ培地を100マイクロリットル追加します。次に、カラム1の各ウェルにテスト用小分子を追加します。そして、A1井戸に2倍の濃度を加えます。次に、1列目から2列目に100マイクロリットルを移すことにより、X軸に沿って希釈勾配を作成します。100マイクロリットルがカラム11に追加されるまで、希釈プロセスを続けます。カラム11を混合した後、そのカラムから100マイクロリットルを廃棄し、カラム12を薬剤を含まない培地のみで放置します。2 番目の薬物希釈用に別の勾配を作成します。これを行うには、2つのXを含む培地の100マイクロリットルを追加し、列Aの入力分子の最小阻害濃度次に、行AからBに100マイクロリットルを移します。希釈プロセスを続行し、100マイクロリットルが列Gに追加されるまで、行Gを混合した後、ウェルから100マイクロリットルを廃棄します。次に、プレートに2マイクロリットルの培養物を各ウェルに接種します。ウェルあたり1000個の細胞が存在するようなものです。次に、ゼロ時間時点の600ナノメートルでの光学密度の読み取り値を測定します。読み取り値が記録されたら、プレートを摂氏37度で24時間インキュベートします。次に、24時間時点の600ナノメートルでの光学密度値を測定します。ハイスループットスクリーニングを行うには、相乗的医薬品について、野生型と相乗性予測変異体細胞の両方をM9最小培地で培養します。次に、ライブラリから培地に薬剤を追加します。次に、ライブラリー医薬品の1つのプレートに野生型を接種し、もう1つのプレートに相乗効果予測変異菌を接種します。このプレートは、相乗的な薬物の組み合わせを調査するために使用されるチェッカーボードアッセイを表しています。このプレートでは、FICIスコアが最も低いウェルF9が0.07であり、低分子ペアが相乗的であることを示しています。このプレートは、相互作用しない薬物の組み合わせを調査するためのチェッカーボードアッセイを表しています。このプレートでは、FICIスコアが最も低いウェルC3が1.0であり、低分子ペアが互いに相互作用しないことを示しています。このプレートは、拮抗薬の組み合わせを調査するために使用されるチェッカーボードアッセイを表しています。このプレートでは、FICIスコアが最も低いA1が8.0であり、薬物分子間の相互作用が拮抗していることを示しています。次に、フルコナゾールの低分子医薬品であるベフェルジンAは、CおよびUホルミンの増殖を研究するために使用されます。プロットは、野生型とシナジー予測変異体の両方の成長がわずかに、そして同じ程度に阻害されることを示しています。これは、ベフェルジンAとフルコナゾールが非相乗的な薬物パートナーであることを示しています。.それどころか、CおよびUホルミンの相乗効果予測変異体の成長は、RefromisynおよびFluconazoleの存在下で有意に阻害されます。薬剤が相乗的なパートナーであることを示します。興味深いことに、野生型の成長はまったく阻害されません。ここでは、接種後32時間から49時間の間に、最大の成長差が観察されます。この手法を習得すると、相乗的な薬物相互作用を特定する時間を短縮できます。この手順を実行する際には、チェッカーボードアッセイの最後の行の最後の列で薬物を組み合わせないように注意することが重要です。この手順に続いて、追加の相乗的薬物相互作用を同定するために、共乗的分子同定の他の方法を実施することができる。このビデオを見た後、O2M方法論を使用して推定シナジーマーカーを特定し、関心のある生物とのシナジーな薬物相互作用を見つける方法を十分に理解しているはずです。一部の小分子を扱う作業は危険である可能性があり、このプロトコルを実行する際にはMSDSの注意事項に従う必要があることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

タンパク質のリン酸化は、細胞が細胞外の環境における情報を解釈し、それに対してどのように反応するかの中心的な特徴です。ここでは、哺乳類細胞から精製したキナーゼを使用して、目的の基質をリン酸化するキナーゼを迅速に同定するためのハイスループットスクリーニングプロトコルを紹介します。...

ハイスループットスクリーニングを使用したキナーゼ基質ペアの同定

(1)細胞内細菌性病原体を標的とする真核生物の細胞浸透性抗菌薬を同時に同定し、(2)真核生物の細胞毒性を評価するために、ハイスループットのリアルタイムアッセイが開発されました。その後、同じ技術のバリエーションをデジタル分注技術と組み合わせて、簡便で高解像度の用量反応、および 2 次元および 3...

高スループット、リアルタイム、細胞内抗菌活性のデュアル読み出しテストおよび真核細胞の細胞毒性

このプロトコルでは、作り方ロエベ加法性基づかせていた薬剤の相互作用の測定ペアと 3...

任意の数の薬のメジャーの相乗効果に対角線論法

このプロトコルでは、シュー クリームと Talalay...

抗がん剤抗体抗悪性腫瘍薬による効果の増強: 組み合わせインデックス式を用いた抗体医薬の相乗作用の検出

抗菌相乗効果テストの組み合わせで使用される 2 つ以上の抗生物質の効果を評価するために使用し、は通常 2 つの方法のいずれかで実行されます: 市松模様配列または時間を殺すの試金。ここでは、自動、インク ジェット...

インクジェットプリンター支援によってテスト自動チェッカー ボード配列および手動で時間を殺す方法抗菌の相乗効果

モデル生物の大きな遺伝的スクリーンは、陰性の遺伝的相互作用の同定につながっている。ここでは、モデル生物の遺伝的スクリーンからのデータを用いて、がんにおける合成致死的相互作用を標的とした薬物の組み合わせを描写するデータ統合ワークフローについて述べている。...

合成致死的相互作用を対象とした薬剤の組み合わせを特定するためのデータ統合ワークフロー

本研究は、薬物とペプチドの相互作用を同定するための戦略を提示することを目的とした。この戦略は、水晶結晶マイクロバランス(QCM)バイオセンサーに基づく薬物認識短いペプチドのバイオパンニングを含み、続いてタンパク質上の薬物認識および薬物結合部位の注釈のために得られた情報を定量的に評価するためのバイオインフォマティクス分析を行う。...

バイオセンサーベースの高スループットバイオパンニングおよびバイオインフォマティクス分析戦略による、薬物-タンパク質相互作用のグローバル検証

このプロトコルは、1回の実験で4つの薬剤の間で得ることができるすべての可能な組み合わせを研究する方法を説明します。この方法は、標準の96ウェルプレートマイクロ希釈アッセイと、結果を評価するための分数抑制濃度(FICs)の計算に基づいています。...

4倍のチェッカーボード:薬物の組み合わせを研究するための三次元チェッカーボードの変形

ハイスループット、自動化され、タバコプロトプラストの生産と変換方法について説明します。ロボットシステムは、非モデル作物に翻訳可能であるべきであるBY-2システムモデルにおける大規模並列遺伝子発現と発見を可能にします。...

ハイスループットプロトプラスト単離と変革のためのロボットプラットフォーム

温度感受性(ts)致死変異体は、本質的な機能を特定し分析するための貴重なツールです。ここでは、ts致死変異体をハイスループットで生成および分類する方法について説明します。...

ハイスループットは、ロボットに温度に敏感な致死変異体の単離を支援します<em&gt;クラミドモナス</em

学ぶ 重複²法による高スループットスクリーニングで相乗効果を示す薬剤組み合わせを同定する手法。薬剤耐性感染症の治療戦略改善に貢献し、前臨床評価への応用が期待されます。

重複²法による相乗効果の薬剤の組合せの高スループット識別

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