重複²法による相乗効果の薬剤の組合せの高スループット識別

この方法論の全体的な目標は、ハイスループットスクリーニングを通じて組み合わせた場合に、互いの活性を増幅する相乗分子を特定することです。相乗効果のある薬剤ペアは、薬剤耐性感染症と闘うための有望な戦略ですが、特定するのが困難です。この手法は、感染症の治療に用いられている既存の抗菌薬と相互作用する分子を同定することができます。

長期的には、これらの組み合わせは前臨床評価に入り、最終的には患者ケアを改善することができます。この技術の主な利点は、関心のある任意の生物および小分子の任意のライブラリで実行できることです。この技術の意味は、関心のあるあらゆる生物に作用するため、複数の感染症の治療にまで及びます。

標準的なスプレッドシートを使用して、特定の濃度の低分子が添加された存在下で、すべての変異体の平均成長スコアと標準偏差を計算します。次に、各小分子濃度のZスコアを計算します。次に、有意なZスコアを持つ遺伝子変異体を強調表示します。

まず、大腸菌培養物をM9最小培地で、摂氏37度で一晩育てます。次に、小分子をジメチルスルホキシドに10ミリグラム/ミリリットルを超える高濃度で溶解します。次に、100マイクロリットルのM9培地を96ウェルプレートの各ウェルに加えます。

さらに 100 マイクロリットルの M9 培地をカラム 1 にピペットで入れ、そのカラムの容量が 200 マイクロリットルになるようにします。次に、約10マイクロリットルの濃縮小分子溶液をカラム1に追加します。小分子を加えた後、プレートのX軸全体で希釈を開始します。

11列目に100マイクロリットルになるまで希釈を続けます。カラム11を混合した後、そのカラムから100マイクロリットルを廃棄する。データを正規化するために、列12にmediumのみが存在するとします。

次に、M9最小培地で成長させた一晩培養物の600ナノメートルでの光学密度値を記録します。次に、各ウェルに2マイクロリットルの培養物を追加します。ウェルあたり1000個の細胞が存在するようなものです。

その後、プレートを軽く振ってください。また、ゼロ時間時点の600ナノメートルでの光学密度の読み取り値に注意してください。読み取り値が記録されたら、プレートを摂氏37度で1日インキュベートします。

再度、24時間時点の600ナノメートルでの光学密度値を測定します。チェッカーボードアッセイを行うには、大腸菌培養物をM9最小培地で摂氏37度で一晩増殖させます。次に、100マイクロリットルのM9培地を各ウェルに加え、96ウェルプレートの列1に同じ培地を100マイクロリットル追加します。

次に、カラム1の各ウェルにテスト用小分子を追加します。そして、A1井戸に2倍の濃度を加えます。次に、1列目から2列目に100マイクロリットルを移すことにより、X軸に沿って希釈勾配を作成します。100マイクロリットルがカラム11に追加されるまで、希釈プロセスを続けます。

カラム11を混合した後、そのカラムから100マイクロリットルを廃棄し、カラム12を薬剤を含まない培地のみで放置します。2 番目の薬物希釈用に別の勾配を作成します。これを行うには、2つのXを含む培地の100マイクロリットルを追加し、列Aの入力分子の最小阻害濃度次に、行AからBに100マイクロリットルを移します。希釈プロセスを続行し、100マイクロリットルが列Gに追加されるまで、行Gを混合した後、ウェルから100マイクロリットルを廃棄します。

次に、プレートに2マイクロリットルの培養物を各ウェルに接種します。ウェルあたり1000個の細胞が存在するようなものです。次に、ゼロ時間時点の600ナノメートルでの光学密度の読み取り値を測定します。

読み取り値が記録されたら、プレートを摂氏37度で24時間インキュベートします。次に、24時間時点の600ナノメートルでの光学密度値を測定します。ハイスループットスクリーニングを行うには、相乗的医薬品について、野生型と相乗性予測変異体細胞の両方をM9最小培地で培養します。

次に、ライブラリから培地に薬剤を追加します。次に、ライブラリー医薬品の1つのプレートに野生型を接種し、もう1つのプレートに相乗効果予測変異菌を接種します。このプレートは、相乗的な薬物の組み合わせを調査するために使用されるチェッカーボードアッセイを表しています。

このプレートでは、FICIスコアが最も低いウェルF9が0.07であり、低分子ペアが相乗的であることを示しています。このプレートは、相互作用しない薬物の組み合わせを調査するためのチェッカーボードアッセイを表しています。このプレートでは、FICIスコアが最も低いウェルC3が1.0であり、低分子ペアが互いに相互作用しないことを示しています。

このプレートは、拮抗薬の組み合わせを調査するために使用されるチェッカーボードアッセイを表しています。このプレートでは、FICIスコアが最も低いA1が8.0であり、薬物分子間の相互作用が拮抗していることを示しています。次に、フルコナゾールの低分子医薬品であるベフェルジンAは、CおよびUホルミンの増殖を研究するために使用されます。

プロットは、野生型とシナジー予測変異体の両方の成長がわずかに、そして同じ程度に阻害されることを示しています。これは、ベフェルジンAとフルコナゾールが非相乗的な薬物パートナーであることを示しています。.それどころか、CおよびUホルミンの相乗効果予測変異体の成長は、RefromisynおよびFluconazoleの存在下で有意に阻害されます。

薬剤が相乗的なパートナーであることを示します。興味深いことに、野生型の成長はまったく阻害されません。ここでは、接種後32時間から49時間の間に、最大の成長差が観察されます。

この手法を習得すると、相乗的な薬物相互作用を特定する時間を短縮できます。この手順を実行する際には、チェッカーボードアッセイの最後の行の最後の列で薬物を組み合わせないように注意することが重要です。この手順に続いて、追加の相乗的薬物相互作用を同定するために、共乗的分子同定の他の方法を実施することができる。

このビデオを見た後、O2M方法論を使用して推定シナジーマーカーを特定し、関心のある生物とのシナジーな薬物相互作用を見つける方法を十分に理解しているはずです。一部の小分子を扱う作業は危険である可能性があり、このプロトコルを実行する際にはMSDSの注意事項に従う必要があることを忘れないでください。