マイクロ流体デバイスにおける組織モデルと perfusable の血管ネットワーク

この手順の全体的な目標は、マイクロ流体プラットフォームを使用して、多細胞凝集体またはスフェロイドに灌流可能な血管ネットワークを構築することです。この方法は、血管ネットワークがin vivoおよびin vitro組織モデルでどのように重要であるかなど、再生医療分野の別の形状における重要な問題に対処するのに役立ちます。この手法の主な利点は、薬物およびサプリメントの投与経路を、関心領域をスフェロイドに直接送達することにより、in vitroでシミュレートできることです。

一般に、この方法に不慣れな個人は、マイクロ流体デバイスの標的領域に細胞を導入するのが難しいため、苦労します。PDMSプレポリマーを鋳造した後、真空チャンバー内で材料を2時間脱気し、その後、通気オーブンで摂氏80度で一晩硬化させます。翌朝、シリコンウェーハからPDMSを剥がし、直径2mmの穴あけパンチを使用して、材料に指定された位置に穴を開けます。

直径 1 mm のパンチを使用して回転楕円体ウェルを作成し、粘着テープを使用して PDMS スラブと 24 x 24 mm ガラス カバー スリップをクリーニングします。きれいなスラブをエアプラズマで40秒間処理し、PDMSスラブをカバースリップに接着します。その後、PDMSを摂氏80度で少なくとも12時間硬化させます。

マイクロ流体デバイスを播種する2〜3日前に、5回目の解凍したばかりのhLF、RFP-HUVECs、およびGFP-HUVECsに10回10を3回加え、10mm皿に10mlの新鮮な内皮培地を加えます。hLFおよびRFP-HUVECがサブコンフルエンシーに達したら、内皮培地中のhLFおよびRFP-HUVECを、それぞれ1ミリメートルあたり1.0×10〜5番目、2.5×10〜4番目の細胞で最終濃度まで懸濁します。懸濁培養で2日間過ごした後、バイオセーフティキャビネットで、調製したばかりのマスターミックス溶液の99マイクロリットルの液滴を氷上の35ミリメートルのシャーレの中央に加えます。

マイクロ流体デバイスをロードするには、改造された100マイクロリットルのマイクロピペットチップを使用して、回転楕円体と100マイクロリットルの培地を2番目の室温のシャーレに移します。次に、スフェロイドを最小限の培地で吸引し、ピペットを直立させて、重力によってスフェロイドがピペット先端の底に移動するようにします。ピペットの先端をマスターミックス液滴の半月板に接触させて、ピペットプランジャーを押さずにスフェロイドを溶液に排出します。

次に、調製したばかりのトロンビン1マイクロリットルを液滴にすばやく加え、トロンビンを溶液に穏やかに混合します。ピペットを7マイクロリットルにセットした状態で、スフェロイドをPDMSスラブのスフェロイドウェルにゆっくりと移します。この手順の最も重要なステップは、スフェロイドがデバイスの底部に沈殿するのに十分なゲルをスフェロイドに注入することです。

ロード後、マイクロポスト間の漏れを防ぐために、ピペットチップをそっと取り外します。スフェロイドを摂氏37度で15分間インキュベートします。フィブリンが固まったら、穴1のAと3つのAに20〜30マイクロリットルの内皮培地をゆっくりと注入して、それぞれチャネル1と3に負荷をかけます。

次に、100mm皿のウェットラボワイプに装置を移し、装置を摂氏37度、CO25%で24時間インキュベートして、培地とフィブリンとの間の界面の気泡の除去を促進します。翌日、サブコンフルエントGFP-HUVECsに0.05%トリプシン-EDTAの2ミリリットルを追加し、細胞が完全に分離したときに完全な培地の4ミリリットルでトリプシン反応を停止します。遠心分離により内皮細胞を採取し、ペレットを新鮮な内皮培地に10〜6細胞/ミリリットルの濃度の5倍で再懸濁します。

次に、20マイクロリットルのHUVECを穴1 Bに注入してチャネル1をロードし、デバイスを摂氏37度に30分間置き、90度の角度で傾けて、HUVECがチャネル2のフィブリンに付着するようにします。同様にチャネル3をロードした後、細胞培養インキュベーター内の湿ったラボワイプを入れた新しい100mmディッシュにデバイスを7〜14日間置き、チャネル1と3の培地の半分を毎日交換します。HUVECローディングの0日目に撮影されたこれらの代表的な画像は、フィブリンゲルがチャネル2のみにロードされ、チャネル1または3に漏れることなく、HUVECがフィブリンゲルの側壁に正常に付着していることを示しています。

また、スフェロイドはデバイスの底部に適切に沈殿していることも観察できます。血管新生芽は1日目から観察され、この実験では最も長い芽が3日目にスフェロイドに到達し、血管新生芽のほとんどが7日目までにスフェロイドに到達します。最適には、装置内で4日後、血管の先端の方向と血管根からのスフェロイドの中心として定義された血管角度で、血管内腔を通る流れを観察できます。

血管角は時間依存的に減少し、血管新生芽がスフェロイドに向かって移動することを示しています。RFPおよびGFP-HUVECは、単一の血管内腔を協調的に形成することができ、チャネル1および3から血管新生がスフェロイド内のRFP-HUVECに吻合して連続的な血管網を形成する様子を明確に示しています。また、チャネル1に注入されたFITC-デキストランは、構築された血管網とスフェロイド内部に流れ込み、最終的にチャネル3に到達することから、統合された血管網がスフェロイドに栄養を供給し、スフェロイドから老廃物を除去できることが示唆されます。

開発後、この技術は、有機電界の研究者がin vitro組織モデルで関心のある薬物やサプリメントの有効性を探求する道を開きました。