Name: 虚血性脳卒中のマウス モデルで 11C DPA-713 Neuroinflammation のイメージングをペットします。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: 学ぶ虚血性脳卒中マウスモデルでの神経炎症のPETイメージング手法。TSPO標的ラジオトレーサーDPA-713を用いて、複数マウスの同時動的撮影と生体内定量化を実現する詳細プロトコルです。

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著者は、Buckwalter ラボ (特に博士トッド ・ ピーターソン) マウス モデルを提供する dMCAO と偽の手術を実行するために感謝したいと思います。さらに、我々 は VivoQuant 画像解析ソフトウェア、博士ティム ・ ドイル、博士ローラ ピザーニ、スタンフォード大学で彼らのアドバイスのための施設を画像 SCi3 小動物から博士 Frezghi Habte と彼のテクニカル サポートに Invicro からトーマス · リグオーリを感謝申し上げますとこのイメージングのプロトコルや [11C] の合成に彼らの助けのための放射化学設備 (特に博士 6 月公園) の開発に援助 DPA 713。

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著者は利益相反行為を宣言しません。

提示プロトコル [11C] を使用して dMCAO と偽のマウス neuroinflammation 定量化の方法を記述する DPA-713-ペットボトルTSPO ペットは可視化・測定 neuroinflammation体内まで最も広く調査のイメージング バイオ マーカーです。TSPO 式は炎症の非侵襲的検出および定量化 neuroinflammation を許可中に脳のグリア細胞の誘導です。また、臨床および前臨床研究で貴重なツールとなって、高い翻訳技術です。このプロトコルと代表的な結果を強調 [11C] を使用しての適性 DPA 713 ペット検出およびアミロイド ストロークと他の神経疾患で体内の変化を監視します。
本研究では dMCAO の手術を行った 3 ヶ C57BL/6 雌マウスを使用しています。このモデルは、体性感覚皮質、ストローク (例えば、中大脳動脈の他のモデルと比較して変動の少ないを恒久的な虚血モデルを提供することに制限された再現性の高い梗塞を生じさせるそれとして選ばれました。咬合 (MCAO) フィラメント法)14。脳卒中モデルの PET イメージングには、対側の半球内・ ロワを使用してそれぞれの動物の脳の内部の参照領域を含むという利点があります。以来、単独での手術の結果、開頭術というの研究デザインでは、偽手術を受けたマウスを含めることが重要だし、髄膜動脈閉塞症なしの操作が行われたいくつかの炎症があります。開頭手術だけでは根本的な神経組織やストローク20の独立した免疫応答につながる病原体の導入の混乱につながります。偽手術後いくつかの炎症が期待され、手術単独による信号の可能性を除外する dMCAO を並列で評価する必要があります。DMCAO コホート分析でストロークせず手術に起因する炎症を含むように MRI 確認成功した脳卒中手術と梗塞開発実施しなければなりません。MRI は、梗塞と対側の Roi を正確に描画に必要不可欠な構造参照フレームを提供します。また、正確な画像処理画像の登録と投資収益率の定義を含む、信頼性の高い数量を確保する必要。
C-11 ペットおよびオートラジオグラフィーによる研究ラジオト レーサーをラベルを操作するとき、追加の制限事項を念頭に保たれなければなりません。研究所敷地内のサイクロトロン アクセスに一般に制限され、使用に、C-11 の半減期が短い (20.33 分) を考慮することが不可欠です。適切な放射能輸送ルート、線量管理、および買収時点必要があります事前に決定実験のワークフローの事前準備の詳細な計画でチームが迅速かつ効率的に作業することができますので。C-11 トレーサーを使用する際に得られるデータの出力を高める同時に 4 匹のイメージングに対応するデザインと本研究のセットアップに概説されています。可能であれば、cannulated すべてのマウスを持っていることをお勧めだし、時間によって、CT スキャンの途中で C-11 トレーサー注入前に最小限ルコース崩壊ようにイメージング施設に到着します。このステップ バイ ステップのプロトコルも最高を可能にするクイック カニュレーション、線量測定、トレーサー注入法、ペット スキャンおよび脳断面重要な放射性崩壊前に少なくとも 3 研究者を含むチームによって実行されます。二人ペット スキャンの開始とすべての 4 匹の注入を同時に行うことが必要です。注入直前にペット獲得を開始するため確実に体内動態と血液中のトレーサー分布のダイナミクスと関心領域が正確かつ完全にキャプチャです。多くの手順は、積極的な訓練と実践、実験の円滑な運営を確保するために必要があります。特に、このプロトコルは c57bl/6 マウスを黒髪のツインテールに存在のために困難にすることができますし、ストロークが発生した後、または複数の時点で同じマウスを画像により挑戦的になることがありますの成功の尾静脈穿刺に依存.
Pet の別の考察には、ルコース線量および残留活性の測定、測定の正確な時刻を含む慎重な記録が含まれています。これはスキャンの時に注入された線量の正確な減衰補正に欠かせない、各 ROI のトレーサーの取り込み (すなわち、 %id/g) の正確な測定を取得するために使用します。正確な分析を確保するためにスキャンの時に各マウスに存在していた放射能の正確な量を知ることが不可欠です。したがって、スキャナー コンピューター キュリーメータ C-11 など短命の同位体を使用する場合、エラーを避けるために、時計を同期することをお勧めします。
ペット画像定量の正確さは、スキャナーとセットアップの精度によって制限できます。したがってペット/CT 画像の定量の正確さを確保するため、スキャナーの ct 像と PET の両方のコンポーネントの品質管理チェックを行う重要です。CT 品質管理チェックには、x 線ソース、エアコン、光と闇、オフ設定のキャリブレーション センターが含まれて。これらの校正は、測定し、取得する前に実行するシステムの異音のする必要があります正しいスキャナー製造元の推奨どおり。校正は、PET 装置に対しても実行する必要があります。これは通常知られている放射能濃度を含む「標準/ペット ファントム」スキャンのスキャンを含みます。標準を準備しているとき、それに匹敵する線量の投与がマウスと同じ獲得の本体に似たボリュームに単一のマウスにパラメーター動物イメージングとして、研究で使用される同じ放射性同位元素を使用することをお勧めします。水で希釈したルコースでいっぱい 20 mL シリンジはこのプロトコルの標準校正検出器によって測定される実際の線量に基づいて補正係数を計算するために使用その後ペット イメージング結果で使用されます。補正率は、PET 画像における領域におけるトレーサー吸収量の定量の正確さを確保するための実験で取得した画像データに適用できます。これは、スキャンの日に現在の任意のバック グラウンド アクティビティを考慮に加えて核種陽電子範囲を占めています。線量校正器は、この補正係数の世代の不可欠な部分は、この機器は製造元のガイドラインに従って定期的に校正してもことが不可欠です。
前のヴィヴォオートラジオグラフィーを行う際、関心の領域での高い信号背景を確保するため、注射後の安楽死のための最適な時点を選択する重要です。投与 30 分後生体内で[11C] DPA 713 放射線写真法動的 pet -すなわち、中に取得したデータを使用しての選ばれた C-11 と時間の短い半減期も考慮しながら、ガイドとして動的 TACsセクションし、抽出後に脳組織を公開します。これを考慮し、[11C] DPA 713 服用と 30 分の注入を可能にするをマウスの別コホートに [11C] DPA 713 放射線写真法を行う必要があります血流と麻酔下で安楽死の時点。体内の小さな実行前のヴィヴォオートラジオグラフィーを行う前に 3-4 マウスのペット パイロット研究は、放射線写真法の最適な時点を決定するため参考になります。前のヴィヴォ放射線写真法のための追加の考慮事項は、注射後マウスを回復したり、安楽死まで麻酔に保管するかどうかです。維持麻酔しスキャンの条件を模倣、ルコース分布または排泄動態の回復により改変されないように。さらに、これは回復、その後誘導を回避することによってマウスの付加的な圧力を防ぎます。最後に前のヴィヴォのプロトコルに有用な付加は梗塞場所の高解像度画像を生成する (放射性崩壊) 染色免疫を介してオートラジオグラフィー用脳スライスにおける地域の損傷を評価するだろうとボリューム。
基づく C-11 トレーサーの使用制限があります、このプロトコルは、F-18 (109.77 分の半減期) と活用いただけたトレーサーより敷地内のサイクロトロンのない場所に適用される簡単に変更できます。さらに、このプロトコルは 4 マウス イメージング セットアップの使用について説明します。この高スループット方法は、C-11 トレーサーを使用する場合に最適ですが、このプロトコルは、これらのマウスのシングル ベッドをイメージングを使用しても修正されるかもしれません。慎重な計画とこのプロトコルで説明されている技術の一貫性のあるトレーニング [11C] を使用してデータの富の世代につながる DPA-713、病気症状 neuroinflammation の役割を調査する簡単に適用することができ、神経疾患の他の齧歯動物モデルで進行。さらに、この手法は免疫調節療法ミクログリア/マクロファージの機能を対象とする生体の応答を評価するために使用できます。

ストロークは、5 番目の主要な死因と1アメリカ合衆国における障害の主要な原因です。虚血性脳卒中は、(例えば血栓や脂肪沈着物によって) 脳への血流のローカライズされた中断がある場合に発生するような場合 (~ 87%) の圧倒的多数を表します。被災地へ酸素と栄養の供給がその後減少し、周辺地域だけでなくストローク コア (梗塞) 内で神経細胞死で、その結果複雑な病理学的カスケードが開始されます。この被害、両方の居住者脳免疫細胞 (ミクログリア) に至る経路で重要なコンポーネントであり、末梢の免疫細胞 (好中球、T 細胞、B 細胞、単球/マクロファージ) を浸透させるこれに貢献すると考え Neuroinflammation破壊的なカスケード2,3。活性化ミクログリアと大食細胞が虚血性脳卒中2劇物で有益な効果のレポートでこのアミロイド応答の中心。したがって、これらのセルは、次のストロークの生体内での貢献を評価することが不可欠です。
ペットは生体内で陽電子 (β +) 11C、 13N、などの放射性核種が付いた特定の分子を使用してプロセスは強力な 3 次元分子イメージング手法を生物学の可視化15O と18f.この非侵襲的な方法は、それはそのまま被験者の生活でリアルタイムに分子情報の取得を許可し、縦断的調査を可能にex vivo法 (免疫組織化学など) に比べて多くの利点。いただけた、活性化ミクログリアと周辺の骨髄系細胞のマーカーの PET イメージング定量化し、本体内で、生得の免疫細胞の応答を追跡する手段を提供、脳卒中に対する治療後の炎症を評価するために利用することができます。介入。末梢型ベンゾジアゼピン受容体として以前知られている TSPO ニューロステロイド4の合成とコレステロールの輸送の役割を担うと考えられている 18 kDa 蛋白質であります。また、証拠は、TSPO neuroinflammation とニューロン生存5,6ストローク7を含む炎症を含む多くの神経疾患の発現の増加の報告と関与していることを示唆しています。認知症8、9パーキンソン病、多発性硬化症10。TSPO ミトコンドリア膜の外側にある、周囲、特にステロイド関連組織 (例えば腺) と心臓、腎臓、肺および10で見られる中間のレベルで高度に発現します。しかし健康な脳 TSPO レベルが低いとグリア6,11に主に制限されてです。ストロークで観察するなどの神経細胞傷害時に中枢神経系 (CNS) における TSPO レベルが大幅に増加します。この観測のアップレギュレーションいただけたは、炎症の重症度の正確な指標を提供する式レベルでイメージ neuroinflammation体内に悪用できます。それ故、このメソッドの目的は正確に neuroinflammation TSPO PET を用いた虚血性脳卒中のマウスモデルでの生体内での貢献を定量化するには
複数いただけたトレーサーを開発されている neuroinflammation のペット用。TSPO pet は [11C] DPA 71312を使用して記載されてここでは、有望な第二世代より歴史的に使われる [11C] よりも非特異的結合を上下ノイズ信号を示している TSPO トレーサー PK11195 13.たとえば、ストロークの dMCAO マウス モデルはこの方法14に選ばれました。このモデルには、側頭開頭と体性感覚皮質の局所虚血の結果、遠位の中大脳動脈の永久的な結紮が含まれます。これは、虚血性損傷とこのモデルに関連付けられている低死亡率の高い再現性によりストローク前臨床研究に有益です。これまでいただけた PET イメージング研究を dMCAO 齧歯動物モデルで報告されるようにあります。ただし、以前ペット イメージング中大脳動脈閉塞 (MCAO) モデルを使用して、マウスとラットの両方より厳しいと可変ストローク モデルが報告されて 3 日目から約 7 日後のストローク15、ピークから増加する TSPO 式 16,17,18。したがって、TSPO 発現に合わせてペット 6 日ポスト dMCAO をイメージングを行った。[11C]脳内 DPA 713 吸収 (梗塞) 同側で評価されたと対側半球。TSPO ペットは、梗塞の正確な描写と関心 (ROIs) の反対側の領域を可能にする構造の MRI と結合されました。ここでアトラス ベースと [11C] DPA 713 摂取量を計算する MRI 駆動 ROI アプローチについて述べる。脾臓のラジオト レーサー吸収もグループ間の炎症の末梢レベルを調査して検討した.このメソッドには、時空間ダイナミクスと脳卒中と他の神経疾患における特定の neuroimmune 相互作用の役割に重要な洞察を提供する可能性があります。

<table><tbody><tr><td>Inveon PET/CTスキャナー</td><td>シーメンス</td><td>バージョン4.2</td><td></td></tr><tr><td>MRIスキャナー</td><td>Varian</td><td></td><td>7 Telsa</td></tr><tr><td>ParaVisionソフトウェア</td><td>Bruker</td><td>バージョン6.0.1</td><td>MRIオペレーティングソフトウェア</td></tr><tr><td>VivoQuantソフトウェア</td><td>InVicro</td><td>バージョン2.5</td><td>画像解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>Inveon Research Workspaceソフトウェア</td><td>シーメン</td><td>スバージョン4.2</td><td>スキャナー操作ソフトウェア。microQView、後処理管理ソフトウェア</td></tr><tr><td>が含まれています 用量キャリブレータ</td><td>Capintech</td><td></td><td>CRC-15 PET</td></tr><tr><td>Typhoon 蛍光体イメージャー 9410</td><td>GE Healthcare</td><td>8149-30-9410</td><td></td></tr><tr><td>バタフライカテーテル</td><td>SAI Infusion Technologies</td><td>BFL-24</td><td>27.5 G 針</td></tr><tr><td>1 mL シリンジ</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>インスリンシリンジ</td><td>BD</td><td>329461</td><td>0.5 mLインスリン注射器と針</td></tr>付き<tr><td>20 mL注射器&nbsp;</td><td>VWR</td><td>BD302831</td><td>BD シリンジ スリップ チップ 目盛り付き</td></tr><tr><td>組織接着剤</td><td>サンタクルーズ アニマルヘルス</td><td>sc-361931</td><td>3 mL</td></tr><tr><td>ヒートランプ</td><td>Fluker</td><td>27002</td><td>5.5 インチ 爬虫類ヒートランプ クランプとスイッチ付き</td></tr><tr><td>0.9% 滅菌生理食塩水</td><td>ファイザー</td><td>00409-4888-10</td><td>注射用 0.9% 塩化ナトリウム、10 mL</td></tr><tr><td>アイ潤滑剤</td><td>ワトソン ラグビー</td><td>PV926977</td><td>人工涙液潤滑剤眼軟膏、1/8オン</td></tr><tr><td>スChux吸収剤シート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>1420662</td><td>使い捨て吸収剤パッド</td></tr><tr><td>アイリスはさみ</td><td>ワールド精密機器</td><td>503708-12</td><td>11.5 cm、ストレート、12パック</td></tr><tr><td>サージカルテープ</td><td>3Mデュラポア</td><td>1538-0</td><td>1/2 "x 10ヤードロール、シルク、低アレルギー性</td></tr><tr><td>マウスPETベッド</td><td>家で</td><td></td><td>4マウスPETベッド</td></tr><tr><td>ライター</td><td>ビック</td><td>UDP2WMDC</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>ヘンリーシャイン</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td>アイソセシア、吸入麻酔薬、250mL</td></tr><tr><td>酸素</td><td>Praxiar</td><td>UN1072</td><td>圧縮ガス</td></tr><tr><td>オートラジオグラフィーカセット</td><td>コールパーマー</td><td>EW-21700-34</td><td>アルミニウム、8インチ x 10インチ</td></tr> <tr><td>オートラジオグラフィーフィルム</td><td>GEライフサイエンス</td><td>28-9564-78</td><td>ストレージ 蛍光体スクリーン BAS-IP SR 2025 E 超解像、20 &times; 25 cm、スクリーンのみ</td></tr><tr><td>ミクロトームブレード</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>30-508-35</td><td>MB35 Premier Disposable、34&deg; 切断角度</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Microm</td><td></td><td>HM 550</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Superfrost&trade;プラス顕微鏡スライド</td></tr><tr><td>OCT液体</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>-10°Cの温度でのクライオスタット切片化のための水溶性グリコールおよび樹脂の製剤化;C(14度;F)以下</td></tr><tr><td>凍結金型</td><td>Poly sciences</td><td>18646A-1</td><td>使い捨てパラフィン金型</td></tr><tr><td>サランラップ</td><td>サラン</td><td>25700001300</td><td></td></tr><tr><td>消毒剤</td><td>Virkon S</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

虚血性脳卒中のマウス モデルで [11c] dpa-713 neuroinflammation のイメージングをペットします。

PET Imaging of Neuroinflammation Using [11C]DPA-713 in a Mouse Model of Ischemic Stroke

Neuroinflammation は虚血性脳卒中病態カスケードの中心です。非侵襲的分子イメージング法には、ダイナミクスとストロークで特定の neuroimmune の相互作用の役割に重要な洞察を提供する可能性があります。具体的には、形質タンパク質 18 kDa (TSPO) 活性化ミクログリアと周辺の骨髄系細胞のマーカーの陽電子放射断層撮影 (PET) 画像処理は、検出および neuroinflammation in vivoを追跡する手段を提供します。ここ、neuroinflammation を使用して正確に定量化する方法を提案する [11C]N,N-Diethyl-2-[2-(4-methoxyphenyl)-5,7-dimethylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]acetamide ([11C] DPA 713)、有望な第二世代 TSPO ペットルコース、sham 群と比較して遠位の中大脳動脈閉塞 (dMCAO)。MRI は、ストロークを確認し、梗塞場所と容量を定義する実行 2 日ポスト dMCAO 手術でした。ペット/計算断層レントゲン写真撮影 (ct) は、脳卒中 TSPO レベルのピークの増加をキャプチャする 6 日間のポスト dMCAO を行った。PET 画像の定量は、[11C] の摂取量を評価するために実施した脳と炎症の中央および周辺のレベルを評価するために dMCAO と偽のマウス脾臓の DPA 713。生体内で[11C]前のヴィヴォオートラジオグラフィーを使用して DPA 713 脳の吸収が確認されました。

マウスは成功したストロークと [11C] を確認する MRI を施行した DPA 713 ペット 4 匹を同時にスキャンすることによって実施されました。PET、CT および MR 画像から手動で脳・ ロワを描画し、同側および対側の地域 (図 2) でトレーサーの通風管を調査するため、半自動分割脳アトラス解析を実行する前に共同登録されました。
ペット/CT 画像と時間活動曲線 (時間の関数として TACs ラジオト レーサー活動) は、同側と対側半球 (図 3A) で増加 [11C] DPA 713 吸収を表示します。50-60 分の合計を使用して、動的の PET 脳画像の定量化データ明らかにトレーサーの摂取量 (%id/g) 同 (梗塞) 対側半球 dMCAO ではなく、手動で描画を使用して偽のマウスと比較して大幅に増加投資収益率のアプローチ (図 3B)。DMCAO と偽のマウスと同側の半球の増加の取り込みが認められました。アトラス ・ ロワ (通常は体性感覚野に限定) 梗塞のサイズよりも大きいため希釈の可能性が高いため、アトラスのアプローチを使用して同側および対側の半球間に有意差は認められなかった、信号。しかし、シャムと比較して dMCAO の全体的な増加の取り込みは梗塞19以外の地域でいただけた発現の増加を示す MCAO モデルマウスを使用して前のレポートは位置合わせすべて・ ロワの観察されました。両方のアプローチを使用して偽マウス対 dMCAO で同側・対側比が増加しました。しかし、この違いは、ROI アプローチにおける変動の大きいため脳アトラス アプローチを用いた皮質で重要なものだった。これは各グループのマウスの数を増やすことによって克服することがあります。脾臓の [11C] DPA 713 摂取量の定量化 (図 4) のグループ間に有意差を認めなかった.
脳 dMCAO マウス ペット画像処理の結果は、前のヴィヴォ高解像度デジタル オートラジオグラフィー (図 5) によって確認されました。増加 [11C] DPA 713 取り込みは、周囲の正常な脳組織にごくわずかな信号梗塞組織で観察されました。これらの画像の定量は同側対側比 1.4 から 2.09 dMCAO マウスに至るまで明らかにしました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57243/57243fig1.jpg"> 図 1:Pet とワークスペースのセットアップ。すべてのワークスペースは、無菌環境を作成する保護吸収パッドで覆われていた。(A)校正後 4 匹を同時にイメージングのための装備、3 D プリントされたマウス ベッドはスキャナーと麻酔に接続されているすべての 4 匹のノーズコーンが確保されました。(B) PET 画像診断に必要な機器は事前に生理食塩水で満たされた 27.5 G カテーテル、目潤滑油、エタノール綿棒、熱ランプ、サージカル テープ、組織接着剤、0.5 mL 用量注射器、ハサミ、ライターを含む準備されました。(C)ラジオト レーサー インジェクション生理食塩水フラッシュ注射器やスキャナーの背面にあるはさみを配置します。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57243/57243fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57243/57243fig2.jpg"> 図 2:同側・対側の投資収益率と右/左-分割半球脳アトラス PET 画像解析プロセス。画像解析ソフトウェアは、手動でを使用して興味 (ROIs) の同側および対側の地域におけるトレーサー吸収を決定に使用された描画・ ロワと半自動 3 D ブレイン アトラス アプローチ。自動 3 D ペット/CT の登録は、CT 画像で定義されている対応するマウス頭蓋骨内の脳 mri 像の手動登録に続いて実施されました。3 D の ROI ツールを使用して手動で同側 (赤) を描画と対側 (緑) ・ ロワの MRI では梗塞を参照として使用します。ブレインのアプローチでは、3 D マウスの左/右-分割脳アトラスがロードされ、CT 画像で定義された頭蓋骨内に装着。この 3 D マウスの脳アトラスの定量化に使用される脳・ ロワは、左皮質 (ダークグレー)、左の海馬 (コーンフラワー ブルー)、左線条体 (ディープ ピンク)、右皮質 (赤いトマト)、右海馬 (緑) と右 Striatium (シアン) に含まれています。[11C] の取り込み各地域の DPA 713 nCi/cc で得られた、その後それぞれのマウスのスキャンの時に減衰補正量を正規化することで %ID/g に変換されました。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57243/57243fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57243/57243fig3.jpg"> 図 3: DMCAO および偽マウスにおける DPA 713 脳吸収量の代表的な生体内で[11C]。(A)ペット/CT 画像と TACs 増加 [11C] DMCAO を受けたマウスの同側の皮質 DPA 713 吸収を示す (n = 3) と偽のわずかな増加 (n = 3) マウスで有意を示す DMCAO マウスを運営注入量を百分率で梗塞と脳 (%ID/g) の側との間のコントラスト。(B)ペットの定量化 (50-60 分の合計) は、同側の投資収益率 ROI のアプローチを使用して、皮質 (Ctx) ブレイン アトラス アプローチを使用して大幅に増加した吸収を明らかにしました。海馬 (HC) や線条体 (Str) の重要な相違点が見つかりませんでした。両方の解析を用いたアプローチしますが、のみ脳アトラスのアプローチを使用して Ctx で統計的に有意な増加対側と同側の比率が見られました。* (p &lt; 0.05)、* * * (p &lt; 0.001)<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57243/57243fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57243/57243fig4v2.jpg"> 図 4:DMCAO における代表的なIn Vivo [11C] DPA 713 脾臓吸収と偽マウス。(A) [11C] DPA 713 動的 PET/CT 画像の dMCAO の脾臓・ ロワを示す (n = 3) と偽 (n = 3) マウス。(B)量的な結果は dMCAO と偽のマウス脾臓吸収で重要な結果を示します。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57243/57243fig4v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57243/57243fig5v2.jpg"> 図 5: 代表オートラジオグラフィーの結果。デジタル放射線画像は、対側半球と比較して増加 [11C] DPA 713 取り込み側を示しています。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57243/57243fig5v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

形質タンパク質 18 kDa (TSPO) の陽電子放射断層撮影 (PET) 画像処理開発 neuroinflammation の動的役割と脳疾患の進行を可視化する非侵襲的な手段を提供します。このプロトコルでは、虚血性脳卒中のマウスモデルで neuroinflammation を検出する TSPO ペットと体外放射線写真法について説明します。

虚血性脳卒中のマウス モデルで [11C] DPA-713 Neuroinflammation のイメージングをペットします。

Neuroinflammation is central to the pathological cascade following ischemic stroke. Non-invasive molecular imaging methods have the potential to provide ...

この実験の全体的な目標は、TSPO-PETおよびMRイメージングを使用して虚血性脳卒中のマウスモデルにおける神経炎症の空間分布と範囲を正確に定量化し、ex vivoオートラジオグラフィーを使用してこれらのin vivo所見を検証することです。PETイメージングを使用して生体内の神経炎症を視覚化する方法について、このステップバイステップガイドをご紹介できることを大変うれしく思います。ここでは、例としてストロークのマウスモデルを使用しています。では、なぜこの手法を使用したいのでしょうか。いくつかの理由があります。1つ目は、神経炎症は、中枢神経系で発生する炎症であり、密接に関連していると考えられており、脳卒中だけでなく、アルツハイマー病、多発性硬化症、パーキンソン病など、多くの脳疾患の根底にあるものと考えられており、リストは続きます。ですから、これらの生物学的現象を本当に研究することを可能にするこれらの技術を持つことは非常に重要です。第二に、PETイメージングには、従来の技術に比べて多くの利点があります。例えば、これらの従来の技術のほとんどは、ヒトとマウスの両方の死後脳組織を使用することに大きく依存しており、多くの重要な洞察をもたらしていますが、これらの技術は本質的に静的であり、実際にはある瞬間に関する情報しか教えてくれません。脳と免疫系の両方が非常に動的であることがわかっているため、これらの分子プロセスを生きた無傷のシステム、つまり本来の環境でリアルタイムに捉えることができる技術が欲しいと考えるのは理にかなっています。ここでは、TSPOまたはトランスロケータータンパク質に結合することが知られている特定のPET放射性トレーサーDPA-713の使用方法を紹介します。具体的には、1匹のマウスだけでなく、4匹のマウスに同時に画像を動的に注入する方法と、それがなぜそれほど重要なのかというと、同じトレーサーのバッチで任意の日にイメージングできるマウスの数を増やすのに本当に役立ち、実験を本当に効率化するからです。これは技術的には難しいことですが、このビデオがあなたの研究室でこれを実行するためのガイドになることを本当に願っています。まず、麻酔をかけたマウスをPET/CTスキャナーベッドにうつ伏せに置き、まっすぐにしてノーズコーンにしっかりと固定します。各マウスの頭と体を柔らかい外科用テープでベッドにテープで固定し、テープの配置によって呼吸が制限されないようにします。動物がベッドに固定され、呼吸が安定したら、レーザー十字線をオンにし、スキャンベッドを動かして、4匹すべてのマウスの脳に合わせます。スキャナーベッドを、マウスの脳が視野の中心にできるだけ近づくように、取得位置に移動します。マウスのスカウトビュー画像を取得してマウスの位置を確認し、必要に応じてインターフェースの視野ボックスをドラッグして位置を調整します。最後に、スキャナーソフトウェアの「ワークフローを開始」をクリックしてCTスキャンを開始し、トレーサー注入の前にPETスキャンを手動で開始できるように、インタラクティブなユーザープロンプトを表示するように選択してください。マウスが自動的にCTからPETに進んだら、スキャナーの背面に放射性トレーサー注射用を設定します。棚に保護用の吸収性パッドを置き、はさみとライターが手元にあることを確認します。密閉されたカテーテルチューブをハサミで切り取ります。カテーテルラインに気泡がないことを確認し、10〜20マイクロリットルの生理食塩水フラッシュを実行してカニューレがまだ静脈内にあることを確認し、次に以前に測定した用量の注射器を4つのカテーテルのそれぞれにロードし、各マウスにどの用量が与えられたかを追跡します。PETスキャンを開始する準備ができたら、[OK]をクリックし、同時に10秒のタイマーを開始します。スキャナーの後ろに2人の研究者を配置し、線量注射器を手にして、タイマーがゼロになったときに4匹のマウスすべてに同時に注射します。各カテーテルを50〜100マイクロリットルの生理食塩水で洗い流し、全量が尾静脈に入ることを確認し、ライターを使用してチューブを再度密封します。次に、線量キャリブレーターを使用して線量シリンジを測定し、残留放射能値を取得します。値と記録された時刻をメモします。スキャンが完了したら、モーションコントロールパネル内の水平ホームボタンを使用して、PETベッドを元の位置に戻します。スキャナーからマウスを取り外し、カテーテルを慎重に取り外します。カニューレ挿入部位に優しく圧力をかけ、過度の出血を防ぎます。次に、用量キャリブレーターを使用してカテーテル内の残留活性を測定します。最後に、後処理管理ソフトウェアを開いてデータを再構築すると、最初のファイルから生成されたヒストグラムデータを使用して各スキャンが自動的に再構築されます。PET解析の場合は、まず画像解析ソフトウェアを開き、[Open Data]アイコンをクリックしてCT画像をロードし、[Append Data]アイコンをクリックしてダイナミックPETをロードします。ドロップダウンメニューの時系列演算子を使用して、データの視覚的な品質管理を実行します。[参照] と [グローバル] を選択し、カラー スケールに適切な最小値と最大値を適用します。動的PETデータをフレームごとに視覚化し、放射能の取り込みを確認し、スキャン内の動きの交絡を確認します。次に、算術関数を使用して平均PET画像を作成します。「average selected」を選択し、「Reference」の選択を解除し、「Input 1」、「Input 2」、および「Input」が選択されていることを確認して、すべての PET フレームの平均を作成します。[Data Manager] タブに移動し、平均画像を [Input 1] の位置までドラッグして、平均 PET 画像を使用して PET 信号を視覚化できるようにします。次に、Min/Maxツールで自動計算をクリックして、カラースケールを再分配します。次に、[Reorientation Registration]ドロップダウンメニューの自動3D機能を使用して、CTを平均的なPETファイルに登録します。Ref と Input 1 を選択し、Rigid、Fast、Input 1 to Ref registration を選択します。3次元すべてのレジストレーションを視覚的に確認し、必要に応じて[手動3D]タブで[移動]および[回転]機能を使用して手動で調整します。登録に問題がなければ、[Input 2] と [Input] を選択し、チェック マークをクリックしてすべての PET フレームに適用します。DMのCTファイルとPETファイルを右クリックし、rawとして保存します。次に、ドロップダウンメニューから[トリミング]を選択し、画像の境界をドラッグして、一度に1つのマウスの頭を脳幹の下にトリミングします。PET画像とCT画像の向きを手動で変更して、頭蓋骨がすべての寸法でまっすぐになるようにします。インターフェイスの左上にある [データの追加] ボタンを使用して、そのマウスの MR 画像を読み込みます。手動の3D方向変更を使用してMRを移動し、CT画像内の頭蓋骨に合わせます。次に、[Visual Controller] タブで PET ビジュアライゼーションの選択を解除してオフにし、MR と CT のみを使用して関心領域または ROI を描画します。3D ROIツールで、「Add ROI」ボタンをクリックして新しいROIを作成し、「Infarct」と名付けます。[スプライン] ツールを選択し、左クリックして ROI 境界を描画し、右クリックして閉じます。その後、新しいROIを作成し、それを対側にラベル付けします。Infarct ROIを右クリックし、[エクスポート]を選択します。次に、ROI を位置 2 の [入力 1] に移動して、新しい ROI の視覚化と手動による方向変更を可能にします。[Input 1] のみを選択した状態で ROI ボックスにチェックを入れ、[View Only] を選択すると、Infarct ROI の向きを変更せずに視覚化できます。Reorientation Registrationメニューで、Operator機能を使用して左右反転を適用し、新しいROIを反対側の同一領域に手動で移動します。次に、算術演算子を選択し、新しい ROI に 2 のスカラー乗算を適用して、ROI の独立した定量化を可能にします。3D ROI ツールに戻ります。「エキスパートおよびエクスペリメンタル」タブに移動し、「ROIのインポート」ボタンをクリックします。ダイアログボックスから入力1を選択して、新しいボリュームを反対側のROIとして読み込みます。最後に、平均的なPET画像を右クリックしてアンロードし、PETを再びオンにします。3D ROIツール内のExport Resultsアイコンを使用して、定量的な取り込み結果を生成します。結果として得られるPET/CT画像と時間活動曲線は、同側半球と対側半球での放射性トレーサーの取り込みの増加を示しています。50分から60分の合計データを使用して動的PET脳画像を定量化すると、dMCAOでは対側半球と比較して同側半球でのトレーサー取り込みが有意に増加したことが明らかになりましたが、手動で描画されたROIアプローチを使用した偽マウスではそうではありませんでした。この手法を見た後、自動および手動の画像解析方法を使用して、TSPO-PETを介して虚血性脳卒中のマウスモデルの神経炎症を正確かつ効率的に定量する方法を十分に理解できるはずです。重要なことは、ex vivoデジタルオートラジオグラフィーを使用して、これらのin vivo所見も確認できるはずだということです。Carbon 11の半減期は非常に短いため、データの量と質を最大化するためには、この手順を試みる前に明確な実験計画とタイムラインを綿密に計画することが重要です。この手順に続いて、免疫組織化学などの他の方法を実行して、グリア活性化とTSPO発現との相関などの追加の質問に答えることができます。放射能の使用は非常に危険であることに注意してください。露出を最小限に抑えるために、この手順を実行するときは、防護服、鉛シールドを使用し、距離を広げてください。

pet-imaging-neuroinflammation-using-11cdpa-713-mouse-model-ischemic

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

出典:Chaney, A. M., et.al.虚血性脳卒中のマウスモデルにおける [11C]DPA-713 を使用した神経炎症のPETイメージング。 J. Vis. Exp. (2018). このビデオは、TSPO特異的放射性トレーサーを使用して、虚血性脳卒中のマウスモデルにおける神経炎症のin...

虚血性脳卒中のマウスモデルにおける梗塞形成を検出するためのTSPO-PET / CTイメージング

出典:Ouyang, Y., et al. マウス脳低酸素虚血中のPET/MRI同時イメージング。J. Vis. Exp.

脳低酸素虚血による脳損傷のマウスモデルにおけるイメージング

&gt;jove_content&lt;脳虚血による脳損傷は、非侵襲的に画像化され、注射可能な放射性プローブである18F-フルオロデオキシグルコースと組み合わせた前臨床陽電子放出断層撮影法を使用してラットで研究することができます。さらに、VOI(Volume of...

と陽電子放射断層撮影法を用いた非侵襲的イメージングとリビングラットにおける脳虚血の分析<sup&gt; 18</sup&gt; F-FDG

ここに提示された方法は、同時陽電子放出断層撮影法および磁気共鳴イメージングを使用します。脳低酸素虚血モデルでは、拡散およびグルコース代謝の動的変化は、負傷中および後に発生します。意味のあるマルチモーダルイメージングデータを取得する場合は、このモデルにおける進化と再生不可能な損傷が同時取得を必要とします。...

マウス脳低酸素性虚血の間に同時PET / MRIイメージング

ここでは、不可逆的な内皮一酸化窒素合成酵素(eNOS)阻害剤(L-Nio)の局所注射によるマウス白質の病巣性脳卒中の生成方法を紹介します。この技術の潜在的な応用を拡大する2つの定位バリエーション、逆行性ニューロントレーシング、および新鮮な組織の標識と解剖が提示されます。...

軸索変性と白質神経生物学の研究のための皮質下白質ストロークの多彩なマウスモデル

私たちは、げっ歯類モデルで[14C]-ヨードアンチピリン(IAP)の取り込みを測定し、中枢性脳卒中後疼痛(CPSP)に関与する神経基質の活性化を評価するためのプロトコルを提示します。...

[オートラジオグラフィー測定<sup&gt; 14</sup&gt; C]中央郵便ストローク痛みに続いてラット脳で-Iodoantipyrine

このプロトコルは、脳の血栓塞栓を可視化するための複合近赤外蛍光（NIRF）イメージングおよびマイクロコンピュータ断層撮影（マイクロCT）の適用を説明します。この技術は、血栓負担と進化の定量化を可能にします。 NIRFイメージング技術は、マイクロCT技術は、金ナノ粒子を用いた動物生体の内部に血栓を視覚化しながら、蛍光、切除した脳内の血栓標識可視化します。...

直接脳血栓塞栓を可視化するための複合近赤外蛍光イメージングおよびマイクロコンピュータ断層撮影

この研究は、虚血性脳卒中の非侵襲的イメージングのためのマルチモーダル超音波ベースのイメージングプラットフォームの使用を示しています。このシステムは、光音響イメージングによる血液酸素化の定量化と、音響血管造影による脳内の灌流障害の定量化を可能にします。...

虚血性脳卒中の非侵襲的全脳イメージングのための統合光音響、超音波、および血管造影断層撮影(PAUSAT)

ここでは、C57BL/6Jマウスの経頭蓋電気凝固術による遠位中大脳動脈閉塞(dMCAO)モデルを確立し、その後の神経学的行動と組織病理学的特徴を評価するためのプロトコルを提示します。...

遠位中動脈閉塞法を用いたマウスにおける急性虚血性脳卒中の誘発

全光学的アプローチを使用して、虚血性脳卒中を誘発すると同時に、覚醒して行動しているマウスの新たな脳卒中コアで蛍光バイオセンサーを使用してニューロンのCa2+...

行動マウスの虚血性脳卒中を誘発および監視するための同時光血栓症とファイバー測光法

学ぶ虚血性脳卒中マウスモデルでの神経炎症のPETイメージング手法。TSPO標的ラジオトレーサーDPA-713を用いて、複数マウスの同時動的撮影と生体内定量化を実現する詳細プロトコルです。

虚血性脳卒中のマウスモデルで [¹¹C] DPA-713 Neuroinflammation のイメージングをペットします。

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