Name: 催不整脈性心筋症患者の心内膜心筋生検サンプルから心臓の間葉系間質細胞の分離と性状 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学ぶ心内膜心筋生検から心臓間葉系間質細胞を分離する方法。催不整脈性心筋症患者の細胞を用いて脂肪分化能と表面マーカー性状を評価し、疾患メカニズム解明に貢献します。

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この作品は、イタリアの Ricerca グラーヴェ セントロ Cardiologico Monzino IRCCS に保健省によって賄われていた。

このアプローチは、ヘルシンキ宣言に準拠しているし、右室サンプルのコレクションだった「セントロ Cardiologico Monzino IRCCS」倫理委員会承認 (2012/07/06).
1. ソリューション
<ol><li>C MSC 文化の媒体と Iscove の変更ダルベッコ媒体 (IMDM)、20% を添加した胎仔ウシ血清 (FBS)、10 ng/mL 塩基性繊維芽細胞成長因子、10,000 U/mL ペニシリン、10,000 μ g/mL ストレプトマイシン、0.02 M L-グルタミン。0.22 μ m の滅菌フィルター ユニットを使用してこのメディアをフィルター処理し、4 ° C で保存</li>
	<li>コラゲナーゼの解決を準備するには、3 mg/mL の濃度で最終的な解を得るための IMDM 媒質中のコラゲナーゼ NB4 ミックスを再懸濁します。優しく、粉溶解して 0.2 μ m のシリンジ フィルターを用いたコラゲナーゼの解決をフィルターする渦。分注 1 mL 量 2 mL 滅菌チューブに-20 ° c まで使用するために必要なストア。</li>
	<li>10 %fbs、0.5 mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン (事前 0.5 M の濃度でジメチルスルホキシド (DMSO) で希釈し、使用するまで-20 ° C で保管)、1 μ M ヒドロコルチゾン (前希釈で補われる t. 裏打ちメディアの準備、IMDM 中脂肪分化培地を作る100 mM とさらに 10 mm の滅菌希釈で DMSO で蒸留水し、使用するまで-20 ° C で保管) と 0.1 mM インドメタシン (済み DMSO 0.5 M の濃度で希釈品し、使用するまで-20 ° C で保存)。0.22 μ m の滅菌フィルター ユニットを使用して t. 裏打ち媒体をフィルター処理し、4 ° C で保存</li>
	<li>リン酸緩衝生理食塩水 0.0067 M PO4 (PBS)、エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) から成る洗浄バッファーを準備 5 mM と 5% ウシ血清アルブミンおよび 4 ° C でのストア</li>
	<li>60% イソプロパノールで 1% のオロの粉末を溶解、2 h の混合、0.22 μ m のフィルター ユニットを使用して沈殿物を削除するフィルタ リング オイル赤い O (オロ) 実用的なソリューションを準備します。保管常温 (RT) 作業ソリューションです。</li>
</ol>2. 間葉系間質細胞の分離
<ol><li>
心筋生検の収集と処理 注:前に、コラゲナーゼの解決と準備ができてこの媒体を持っているを確認します。<ol>
<li>ACM 心内膜心筋生検を置く (通常約 5 mg の組織) 生殖不能の管に手ごろでいっぱいし、研究室にそれを輸送。 注:ACM の生検は、以前のレポート10によると電気生理学手術室で収集されます。簡単に言えば、電気解剖学的マッピングと右心室の心腔内エコーの統合を使用して心内膜心筋生検 (ビデオ 1参照) (ビデオ 2、参照透視) の国境地帯への対応で、病的心筋。健康な制御 (HC) サンプルは、死体ドナー死亡 (事故死、健常者) の 24 時間以内の右室自由壁から得られる組織バイオ-銀行、によって提供されます。輸送中および郭清の前に、4 ° C で手ごろで生検を格納します。生検コレクションとティッシュの処理 (最大 24 時間) の間の時間を制限します。</li>
		<li>酵素消化までの手順を実行する必要なソリューションとキャビネット生物学的安全性を設定します。</li>
		<li>フードの下で殺菌剤を入れて、楽器使用前に 15 分に回して温度上昇 200-250 ° c.</li>
		<li>消毒はさみとピンセット 10 s. 作る確か滅菌器具は使用前に冷たい。使い捨て滅菌メスを準備します。</li>
		<li>無菌フードに生検でチューブを配置します。管を開き、滅菌プレートに生検を転送します。</li>
		<li>3 mL の滅菌 PBS で 2 回右心室生検を洗います。顕微鏡で生検の写真を撮る場合。</li>
		<li>生検の結果, 右心室のコラゲナーゼ溶液 1 mL を含む滅菌 2 mL チューブに滅菌ピンセットを使用して転送します。</li>
		<li>滅菌ハサミで 0.5 - 1 mm の3個セットにサンプルをカットします。</li>
		<li>連続回転攪拌下の 37 ° C で 1.5 時間孵化させなさい。</li>
		<li>消化液室温 10 分 400 × g で遠心分離します。</li>
		<li>上澄みを除去し、ペレットを洗浄する滅菌 PBS の 1 mL を追加します。</li>
		<li>室温 10 分 400 × g で遠心します。</li>
		<li>上澄みを除去し、この中の 1 mL にペレットを再懸濁します。</li>
		<li>処理滅菌 60 mm 組織培養プレート上に得られた懸濁液をプレート、この媒体を 3 mL の最終的なボリュームに追加します。プレート 5% CO2と 37 ° C で細胞文化のインキュベーターで孵化させなさい。 注:媒体の高いボリュームは、生検消化断片の正しい接着を防ぐことができます。</li>
		<li>24 h 後非付着性のセルおよび残骸を削除する媒体を破棄します。 注:単一の解離の間葉系細胞ことができるプラスチック面にアタッチしてクローン; を生じまた、未消化の小さな生検フラグメントは、プラスチックの皿にアタッチし、セル萌芽を許可できます。</li>
		<li>滅菌 PBS の 5 mL で 2 回洗浄して新鮮なこの媒体の 3 mL を加えます。</li>
		<li>セルが 80% 合流まで週に何回この中 3 つを交換してください。 注:接続されているセルの数は品質、組織の量と消化の効率に依存します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 細胞伸長
注:開始する前に、この媒体の準備を持っていることを確認します。
<ol><li>セルが 80% 合流、転送新しい滅菌 60 mm 組織培養に消化された小さな生検サンプル プレートを扱われ、新鮮なこの媒体の 3 mL を加えます。 注:生検サンプルはさらに C MSC 分離再利用することができます。単離細胞のかなりの数になるまでこの手順を繰り返すことが可能です。</li>
	<li>3 mL の滅菌 PBS で 2 回添付セルを洗浄してください。トリプシン EDTA 溶液 (60 mm ディッシュ用 0.5 mL) を加え、細胞の剥離を許可する 3-5 分の 37 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>プレートの表面から細胞を取り外したら、トリプシンを不活化し、新しい 50 mL 滅菌チューブに細胞を収集する滅菌 FBS の 0.5 mL を追加します。</li>
	<li>同じチューブに残りのセルを追加する滅菌 PBS の 5 mL で 2 回洗浄します。</li>
	<li>室温 10 分 400 x g で細胞を遠心分離します。</li>
	<li>上澄みを除去し、この中の 1 mL にペレットを再懸濁します。</li>
	<li>商工会議所を数えるセルの細胞懸濁液の 10 μ L をロードします。 注:セルは、あまりにも集中している場合、初期懸濁液 1:10 PBS で希釈し、カウント部屋のセルに希薄化後の細胞の 10 μ L を読み込みます。</li>
	<li>顕微鏡で 3 大きな正方形とその両側の 2 つの行のセルをカウントし、平均細胞数を計算します。 注:セル/mL の数を得るためには、カウントが設定されたセルの平均値に 10 を掛ける4、カウント部屋セルの希釈係数。セルがさらに希釈されている場合は、希釈倍率の乗算します。シードする細胞数と細胞濃度 (セル/mL の数) 間の比率は、次のステップ (3.9 ポイント) にメッキする初期懸濁液量 (mL) でに対応します。</li>
	<li>5,000-10,000 のセル/cm2の最終的な集中で扱われる滅菌 100 mm 組織培養プレートに巻き上がりをプレート、この媒体を 8 mL の最終巻に追加します。細胞文化のインキュベーターでプレートを孵化させなさい。 注:セルが 70-80% の合流は、セル拡張手順を繰り返します。すべての通路 (P) では、セルとプレート残りの金額の一部を凍結保存することをお勧めします。P3 や P4 までセルを展開し、蛍光活性化細胞選別機 (FACS) 解析 (セクション 4)、脂肪細胞分化 (セクション 5) を使用します。</li>
	<li>剥離後凍結、室温 10 分 400 x g で細胞を遠心分離します。</li>
	<li>としてセルを数える (ステップ 3.7 3.8) と 900 μ L 滅菌 FBS の 1 x 106細胞を再懸濁します。無菌低温バイアルに転送し、100 μ L の滅菌の DMSO とミックスを追加します。</li>
	<li>すぐに、少なくとも 2 日間-80 ° c の凍結容器にクライオ バイアルを格納し、液体窒素にバイアルを転送します。</li>
</ol>4. フローサイトメトリーを用いた間葉系間質細胞のキャラクタリゼーション
注:始める前に、細胞解離試薬、洗浄バッファー、および準備特定の抗体を持っていることを確認します。
<ol><li>細胞の数に達すると、少なくとも 3 x 106 (3.7 3.8 で説明したセルとしてカウント) は 10 mL の滅菌 PBS で 2 回 100 mm プレートを洗います。</li>
	<li>細胞解離試薬の 5 mL を追加し、細胞の剥離を許可する RT で 7 ~ 10 分を待ちます。</li>
	<li>プレートの表面から細胞を取り外したら、15 mL の滅菌洗浄バッファーを追加し、新しい 50 mL 滅菌チューブに懸濁液を収集します。</li>
	<li>洗浄液 10 mL で 2 回洗浄し、残りのセルを同じ管に追加します。</li>
	<li>RT で 10 分の 400 x g で細胞を遠心し、洗浄液の 1 mL にペレットを再懸濁します。</li>
	<li>説明されている (手順 3.7 3.8)、としてセルをカウントし、新しい生殖不能の管に 3 x 10 の6セルを転送 1.5 mL の最終巻に洗浄バッファーを追加します。 注:総細胞数と洗浄バッファーの容量解析 (3 x 105セル各 FACS ポリスチレン管用 100 μ L) に使用される選択したマーカーの数に依存します。</li>
	<li>配布 12 異なる FACS ポリスチレン管、細胞懸濁液を 100 μ l 添加し製品データシートに示された濃度で特定の抗体を追加します。 注:C MSC 特性評価用抗体、CD34、CD105、CD45、(cd29)、CD90、CD44、CD31、CD14、および HLA-DR (表 1)。再懸濁細胞シグナルの特異性をチェックするアイソタイプ コントロールで染色の 100 μ L から成るコントロールのサンプルを準備することが重要です。</li>
	<li>暗闇の中で 15 分間サンプルをインキュベートします。</li>
	<li>反応を停止する各管に 1 mL の滅菌洗浄バッファーを追加します。</li>
	<li>室温 10 分 400 x g で細胞を遠心分離します。</li>
	<li>上澄みを除去し、洗浄バッファーの 250 μ L でペレットを再懸濁します。</li>
	<li>フローサイトメトリーによる C MSC 特性に進みます。</li>
</ol>5. 心臓間葉系間質細胞が分化
注:始める前に、t. 裏打ち媒体とオロ実用的なソリューションを用意してください。
<ol><li>
T. 同定培地で培養
	<ol>
<li>デタッチし、セクション 3 で説明したセルをカウントします。</li>
		<li>プレート 3 × 105セル 6 ウェル組織培養の各ウェルには、T. 裏打ち培地 2 mL にプレートを扱われます。</li>
		<li>C MSC t. 裏打ち中 72 時間または 1 週間変更中 2 〜 3 日ごとに区別ができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
オイル赤 O 染色 注:使用オイル赤い O (オロ) C MSC の脂質蓄積をテストする染色します。<ol>
<li>6 ウェル培養 plateunder ヒューム フードを配置します。</li>
		<li>脂肪細胞の培地を取り除き、2 mL の PBS で 2 回細胞を洗浄します。</li>
		<li>4% のパラホルムアルデヒド (PFA) それぞれをカバーするための十分なボリュームを追加も。室温 5 分のセルを修復します。</li>
		<li>PFA を破棄し、2 mL の PBS で 2 回細胞を洗浄します。</li>
		<li>RT、それぞれをカバーする十分なボリュームを使用して、1 時間オロ実用的なソリューションと固定セルを孵化も。 注:オロ オロ作業溶液の蒸発を避けるために潜伏中にヒューム フードの下で 6 も組織培養プレートを保持しません。</li>
		<li>すべてオロ実用的なソリューションを取除き、洗浄 2 ml の PBS 3 - 5 回までプレートが完全にクリーンアップ。洗浄を破棄します。使用される PBS が明らかなときと非特異的細胞から染色顕微鏡の下で、表示されない場合は、洗浄を停止します。</li>
		<li>培養倒立位相差顕微鏡を使用して各ウェルの 20 倍の倍率で 20 枚の画像をキャプチャします。</li>
		<li>セル オロ蓄積を定量化するための画像処理プログラムで写真を開きます。</li>
		<li>255 赤チャネルの輝度のみを定量化するために「チャンネルを分割」機能で別の色チャンネルを分離します。</li>
		<li>核を数えることによって各画像のセルの数をカウントします。セル数にオロ信号強度を標準化します。</li>
		<li>同じサンプルの各画像の結果の平均を計算します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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MSC と C MSC:MSC は、多能性細胞骨髄、脂肪、軟骨、脳、皮膚、胎児附属心12など、さまざまなアダルト組織の間質の一部に居住。分離し、基礎やトランスレーショナル研究12,13の潜在的なアプリケーションのためにそれらを特徴付けるさまざまな研究を行った。
MSC は健康な状態に静止、低金利14自己更新。以来、彼らは環境の病理学的変化にさらされている、彼らは育成組織は、直接分化転換、マトリックス析出パラクライン効果14のいずれかを介しての改造反応します。
心臓 MSC (C MSC) は、大規模な非心筋細胞集団の心4を表します。心外膜から発信し、上皮間葉移行15のプロセスを受けている心筋に移行します。彼らは、心臓の構造、生理学的と病理学的状態は、心筋細胞と細胞外マトリックスの恒常性7,16との相互作用での機械的および電気的整合性に貢献します。ただし、C-MSC の広い範囲機能はまだ完全には分かっていません。生理学的および病理学的条件の両方が生体外での研究によって促進することの役割のより深い知識は、彼らの分離の後実行されます。
C MSC は心耳2,17右心室18など、人間の心の別の地区から得られています。
最近では、C-MSC 人間右室心内膜心筋生検標本から得られている8、ソース組織 3-5 mg として、小さなことを示します。
可能なアプリケーション:本稿で説明する方法は、非常に小さなハートの標本から消化とプラスチックの遵守のための選択など、いくつかの簡単な文章とセルを取得ことができます。
増幅し、生体外で、メンテナンスが容易、間葉系の系統 (血管内皮細胞、骨細胞、脂肪細胞) の細胞に分化することができるので、C MSC 細胞モデルを検討できます。また、患者から直接細胞を得る可能性はパーソナライズ/精密医学のコンテキストで解明のための偉大な体外ツールを構成します。確かに、これらの細胞は遺伝的背景と、ドナーの最終的に特定の突然変異を運ぶし、臨床症状、年齢、性別、ライフ スタイル、薬などの特定の患者の特性によって影響を受けます。また、別のマーカーにそれらを並べ替えの可能性特定 C MSC サブセット19の研究ができます。
C MSC がほとんど心の不利な改造によって特徴付けられる別の心血管疾患で現役選手として知られています。したがって、心疾患8,20に対抗する新しい治療戦略のための候補者目標を表すものです。
C MSC 幹のような性質と重要な免疫原性の欠如は、心臓再生医療の細胞療法の潜在的な応用を示唆しています。確かに、MSC 骨髄や他の情報源のような C-MSC される可能性があります潜在的自己とドナーと受信者21とのマッチングを必要とせず、同種の設定で。
また、C-MSC、直接心臓組織から分離されている心臓微小環境とエピジェネティックなプロファイルで前処理されているという利点があります。心臓再生医療の中では、これは特に成功した結果を取得することが重要かもしれない。
日には、再生医療の臨床研究は、C MSC とその傍分泌活動18,22,23で有用な治療の可能性を識別されます。重要なは、セルのソースで心の臨床試験が進行中 cardiosfere 由来細胞もしくは C MSC13,24,25の集団。しかし、骨骨髄由来 MSC はさまざまなプロトコルは、臨床グレード C MSC26を取得する必要あります。
ACM で C MSC:提案するプロトコルは、心内膜生検は示されている病態の研究に適しています主です。ACM の患者は診断目的27生検手術します。その心筋は、徐々 に脂肪細胞と線維化から成る電気的不活性組織瘢痕組織に置き換えられます。診断の収量が最大、瘢痕領域に生検のサンプリングを導くために心筋マッピングは使用10,28,29です。このプロトコルで使用されるサンプルは、病的心筋の国境地帯で撮影されます。
ソンマリーヴァら最近 ACM8、それら心の脂肪前駆細胞は間葉系由来の C MSC が ACM 心臓脂肪細胞形成の現役選手である証明の病因に C MSC の極めて重要な役割を定義しました。また、C MSC は、コントロールよりも脂質蓄積と脂肪細胞形成により傾向を認め, ACM 患者の生検から議定書で分離されました。このため、これらの細胞が分子機構解明9細胞モデルの適合性を証明する、ACM のいくつかを確認するためにされる可能性があります。
制限と重要なステップ:(「用途」段落を参照) の患者から直接 C MSC を得る利点にもかかわらずこのプロトコルは、別制限を受けます。
まず、心筋生検の手順は侵襲的なしばしば厳密に必要ではない場合は回避します。確かに、心臓組織をサンプリング、倫理的、技術的に問題があります。心筋生検を行う理由鑑別診断、心臓移植の状態の監視や心臓腫瘍30の存在を確かめるに心筋症の確定診断の実績があります。したがって、C MSC 研究心内膜心筋生検がコンセンサス ステートメント31で示されます患者のみを登録できます。さらに、心筋生検の手順は心筋症心の中で上記のすべての合併症を持つことができます。したがって、electrophysiologist のサンプリングは常に慎重、生検サンプルは非常に小さく、細胞の分離を損なう可能性があります。今後の実験計画は、コラゲナーゼの濃度を調整する消化のタイミングによってこの問題を克服できます。
C-MSC、すべてひと初代細胞として、すべての表現型で異なる科目間で高い可変性を示します。確かに、別の科目からの細胞は、遺伝的に異なるのみならず、また受ける変数環境をご利用いただけます。具体的には、この実験では、内細胞の分離、成長、および脂肪細胞の分化の高い可変性が観察されます。
この議定書の重要なステップは了承する必要があります。生検標本には、毛細血管が含まれている場合、は、血管内皮細胞、C MSC 文化を汚染する可能性があります、FACS 解析 (CD31 陽性) によって証明することができますの並列の分離を避けるために削除する必要があります。効率的な分化を得るためには、細胞は活発な成長期である必要があります。合流の度も脂質蓄積に影響を与える可能性があります。
法の意義:間葉系間質細胞の分離の前の方法に関して、これは初めてひと心室の生検試料から直接 C MSC 取得の説明の詳細提案です。ACM 患者サンプルの処理にこのメソッドお勧め、心筋生検が示されているすべての患者に適用できる可能性です。
このプロトコルは、収集することは困難が多い大きな心臓サンプル32に必要な細胞の入手する以前の方法の有用な実装を表します。
また、サンプル ソースは、興味深い技術革新を構成します。生検を心室中隔33行われます、このプロトコル右室自由壁からアカウント試料にかかります。病気にかかった右心室地区から派生したセルより右心室を含む疾患の病理学的状態の代表があります。
さらに、議定書で使用される試薬のいくつかが他 C MSC 分離と分化の方法32に関して異なります。たとえば、本稿で提案するコラゲナーゼの種類のミックス クラス I およびクラス II コラーゲン蛋白分解活性のバランスのとれた比率を持つ。また、消化ソリューションは、将来の成長条件に適応する分離 C MSC をできるように C MSC 培地の調製に使用同じ基本培地 (IMDM) に溶解したコラゲナーゼ ミックスで構成されます。
さらに、C MSC 母集団全体を使用して細胞のバッチを標準化できるプロシージャを並べ替え、これらの細胞のプラスチック付着プロパティを介してのみ分離、肺浸潤を変更することがなく簡素化を構成します。C MSC の特性。本稿で提案する t. 裏打ちの組成は、脂肪細胞分化、インスリンなど他のコンポーネントによる代謝不全の回避につながることです。
また、割合のみに基づく方法と比較するとオロ比色強度の評価に基づく脂質蓄積定量化の手法は蓄積された脂質の量の詳細についてを提供しますオロの汚損に肯定的な細胞。ORO を抽出することにより多くの場合脂質蓄積を定量化によりイソプロパノールとその吸光度を測定します。ただし、このメソッドは、複数の通路が必要です、イソプロパノール蒸発による変動を受けます。

間葉系間質細胞 (MSC) は、多くの組織1で重要な支援機能を持つ大人のセルです。骨髄は、MSC の歴史的源を表しますが、彼らは胎盤、脂肪組織、臍帯血、肝臓、心臓1,2などさまざまな組織から分離することができます。
2006 年に国際学会細胞療法 (ISCT) の指定、初めて、人間 MSC3を定義する最低限の条件。特に、MSC プラスチックに付着する能力が必要です。彼らは特定の表面抗原を表現: 陽性 CD14、CD45、CD34 陰性 CD44、CD105、CD90 (cd29)、間葉系のマーカーは、CD31 造血と内皮マーカーが MSC を特徴付けます。HLA-DR の欠如表現、ためは、MSC が alloreactivity をトリガーすることができます。脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞の血統1,3の方向へ分化する可能性を持つ多能性細胞である。
心臓の細胞の構成に焦点を当て、心臓間葉系間質細胞 (C MSC) が正常な大人の心4,5で豊富です。彼らは正常な心臓機能と病態の両方重要な役割を果たします。しばらくの間、生理学的、C MSC は心筋の構造と機能の整合性をサポートする微小環境を提供、心疾患における心損傷創傷治癒と線維化改造6 に参加するのに応答をアクティブにします。 ,7。
最近、催不整脈性心筋症 (ACM) 脂肪置換の C MSC の関与は、示された8をされています。特に、ACM は主に右心室9を中心に、心筋の線維脂肪置換につながるデスモソーム遺伝子の突然変異によって引き起こされる遺伝的疾患です。この置換は、心外膜から心内膜に及ぶは、進行性の心不全を誘発し、重度の場合、突然の死につながることができる、心室性不整脈を悪化させる非導べ電性基板を作成します。ソンマリーヴァら前脂肪細胞の間葉系の起源を示す ACM 患者 explanted 中心セクションに存在します。また、C MSC ACM 心エクスプレス デスモソーム遺伝子の心内膜心筋生検から分離した、したがって彼らの突然変異によって影響を受けることができます。特に、脂肪分化条件下で ACM C MSC は制御心からのそれらよりより多くの脂質を蓄積します。この証拠は、病気の発症の積極的な役割があるし、ACM を研究に有効な細胞モデルを表すの両方、C MSC の結論に します。
このコンテキストまたは心筋生検は示されているその他の心疾患の研究を進めるため、詳細なプロトコルを心筋組織の拡大、その免疫-表現型の小さな断片から C MSC の分離の提示します。特性、および脂肪細胞分化。

<table><tbody><tr><td></td><td>IMDM Gibco by Life Technologies&nbsp;</td><td></td><td></td>12440053</tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン</td><td>Life Technologies Italia</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ NB4</td><td>Serva</td><td>17454.02</td><td></td></tr><tr><td>基本的な線維芽細胞成長因子</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Tryple select 1X (cell dissociation reagent)</td><td>Gibco</td><td>12563029</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6689</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>3-イソブチル-1-メチルキサンチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>インドメタシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>オイルレッド O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (PFA) 溶液 4% 含有 PBS</td><td>D.b.a. Italia S.r.l.</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>抗体 CD14-FITC (M&phi;P9)</td><td>Becton Dickinson</td><td>345784</td><td></td></tr><tr><td>抗体インテグリン&β;1 (CD29)-PE (クローン MAR4)</td><td>Becton Dickinson 561795</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗体 PECAM-1 (CD31)- APC&nbsp;(クローン9G11)</td><td>R&Dシステム</td>ズ<td>FAB3567A</td><td></td></tr><tr><td>抗体 造血前駆細胞抗原 (CD34)-APC (clone 581)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>CD34-581-05</td><td></td></tr><tr><td>H-CAM 抗体 (CD44)-PE&nbsp;(クローンG44-26)</td><td>ベクトン ディッキンソン</td><td>561858</td><td></td></tr><tr><td>抗体 L-CA (CD45)-APC (clone HI30)</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>MHCD4505-4</td><td></td></tr><tr><td>抗体 THY1 (CD90)-FITC (clone 5E10)ベ</td><td>クトン ディッキンソン</td><td>561969</td><td></td></tr><tr><td>抗体 エンドグリン (CD105)-APC (クローン 266)</td><td>ベクトン ディッキンソン</td><td>562408</td><td></td></tr><tr><td>抗体 HLA-DR-FITC (クローン L243)</td><td>ベクトン ディッキンソン</td><td> 347400</td><td></td></tr><tr><td>ギマ クイック プラス滅菌器</td><td>Gima&nbsp;</td><td>35642</td><td></td></tr><tr><td>ベンチ遠心分離機 Sigma 3-16K</td><td>Sigma 遠心分離機</td><td>10330</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty 冷凍コンテナ</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>AxioVert 200M顕微鏡&nbsp;</td><td>ツァイス</td><td>B 40-080 e 03/01</td><td></td></tr><tr><td>FACS Gallios Beckman</td><td>Coulter&nbsp;</td><td>773231AF</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ (画像処理プログラム)</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stericup フィルターユニット</td><td>Merck S.P.A.&nbsp;</td><td></td><td></td>SCGPU05RE</tr><tr><td>コニカルチューブ、50 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30122178</td><td></td></tr><tr><td>コニカルチューブ、15 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30122151</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock チューブ、2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC処理細胞培養ディッシュ</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>60 mm TC処理細胞培養ディッシュ</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルTC処理マルチウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>ポリスチレン丸底チューブ、5 mL</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>BRAND&nbsp;カウンティングチャンバー BLAUBRAND B&uuml;rker-T&uuml;rk</td>シ<td>グマ-アルドリッチ</td><td>BR719520</td><td></td></tr></tbody></table>

催不整脈性心筋症患者の心内膜心筋生検サンプルから心臓の間葉系間質細胞の分離と性状

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

正常な成人の心臓は、その中で心臓間葉系間質細胞は豊富な人口を表すいくつかの異なったセルタイプで構成されます。これらの細胞の分離勉強心疾患における関与の可能性を提供し、加えて、生物学的メカニズムを調査するための有用な一次電池モデルを提供します。
ここでは、C MSC の催不整脈性心筋症患者の生検試料からの分離の手法を説明しています。心内膜心筋生検、電気解剖学的マッピングで可視化した跡に隣接する右室エリアに導かれます。コラゲナーゼと C MSC 成長できるように培地のプラスチックの皿上のめっきで生検の消化が説明されています。隔離されたセルは、いくつかの通路の文化で拡張できます。その間葉系の表現型を確認、免疫表現型特性の説明が提供されます。C MSC は骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞のようないくつかの種類の細胞に分化することができる: ACM のコンテキスト、患者の心の中で脂肪の預金、C MSC の脂肪細胞分化のためのプロトコルによって特徴付けられると脂質液滴集積の特性を説明します。

心筋間質細胞の分離:心内膜心筋生検の手順から C MSC 分離は、図 1のとおりです。
心筋間質細胞間葉系評価:細胞療法 (ISCT) の国際協会によって設立され、その免疫表現型特性3間葉系間質細胞の多能性を定義するための最低限の条件が含まれます。特に、間葉系血統を確認するセルに適切な FITC/PE/APC 結合抗体培養し、フローサイトメトリーで分析しました。C MSC 特性評価に使用される抗体のすべては材料表に表示されます。
図 2に示すように、生検から得られた C MSC は CD105、CD44、(cd29) 特定間葉系表面抗原に陽性。CD90 陽性細胞の割合は、11を既に報告されている変数です。内皮細胞 (CD31、CD34)、単球/マクロファージ (CD14)、造血 (CD45) マーカーと主要組織適合複合体 (HLA) はありません (図 2) を表明しました。
心間葉系間質細胞が分化:T. 同定培地で培養すること持っている ACM と HC によって被害を受けた患者から得られた C MSC の脂肪細胞の分化を確認する (ソリューションのセクションを参照)。セルは交換媒体週 2 回 72 時間または 1 週間の文化で維持されます。
細胞内の脂肪滴の蓄積はオロ (図 3) を染色によって立証されます。ACM と HC から得られる細胞の分化の程度だけでなく、能力の違いが観察できます。代表的なイメージのように、ACM C MSC は脂肪分化培地 (図 3) で文化の 72 時間後より脂質小滴よりも HC C-MSC を蓄積します。これらの違いは、細胞は、長期間 (1 週間) (図 3) 脂肪細胞分化の条件にさらされているときも維持されます。
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/57263/57263video1.jpg"> ビデオ 1:Electroanatomical 地図と心腔内エコーの統合。心内膜心筋生検 (下のパネル) を受ける患者に右心室 (左前方斜めと右前方斜めのビュー) のマップは心内膜のユニポーラ electroanatomical。低電圧 (赤/緑) の一部エリアが頂点で表示されます。心内膜心筋生検サンプル (サークルとしてタグ付き) は、病的心筋および心室中隔に対応で収集されます。リアルタイムの心腔内エコーは、対象地域 (上部パネル) で bioptome の正しい位置を確認できます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57263/Video_1.avi" target="_blank">してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)</a>
<img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/57263/57263video2.jpg"> ビデオ 2: 右前斜位像で透視動画。Bioptome は長い偏向シースから挿入し、心室に進出。心筋と bioptome の接触の注意チェック後顎が開かれ、サンプルを収集するためにしっかりと閉じます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57263/Video_2.avi" target="_blank">してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57263/57263fig1.jpg"> 図 1:手順ドラフトします。心内膜心筋生検標本は bioptome カテーテル、小さなピンセット形切断器を使用して収集されます。得られた生検の重量は、約 5 mg (A) です。心内膜心筋生検標本は滅菌ハサミ (B)、0.5 - 1 mm3断片にみじん切り、コラゲナーゼの解決が追加されます。サンプルは 1.5 時間消化 (C) の回転プラットフォーム ミキサーの 37 ° C の定温器に配置されます。消化ソリューションは遠心分離し、プラスチックの皿 (D) で手ごろにメッキします。C MSC は単一細胞やクローン、または小さな未消化生検断片 (E) から発芽のプラスチック付着特性のおかげで得られます。C MSC は、フローサイトメトリー (F) によって特徴付けられます。C MSC の脂肪分化培地でメッキパーツ、脂質液滴集積がオイル赤 O 染色 (G) によるテストです。スケール バーを示す 50 μ m<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57263/57263fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57263/57263fig2.jpg"> 図 2: C MSC の代表的な細胞蛍光プロファイル。各ヒストグラム示されたチャネルでの蛍光強度と細胞数を示しています (PE: フィコエ リスリン;APC: アロフィコシアニン;FITC: フルオレセイン-isothyocyanate)。特定のセルと共役アイソタイプ コントロール (白) とサンプル各グラフの表面マーカー抗体 (赤) が表示されます。CD31、CD34、CD14、CD45、HLA 博士表現しないに対し、C MSC は、間葉系細胞表面抗原 (cd29)、CD44、CD105 と、部分的に、CD90、肯定的な<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57263/57263fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57263/57263fig3.jpg"> 図 3: C MSC の脂肪細胞分化。ACM と HC C-MSC 72 時間、1 週間の脂肪分化培地中で培養の代表的なイメージに染まったオロ (左画像; n = 3)。右グラフで染色 255 赤チャネルの輝度の定量化は報告する: 強度、任意の単位 (A.U.) で表されます。ACM C MSC は、コントロールよりも多くの脂肪滴を蓄積されます。スチューデントの T 検定を用いて、*: p &lt; 0.05。スケール バーを示す 50 μ m<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57263/57263fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

この記事では、催不整脈性心筋症患者の心内膜心筋生検サンプルから心臓の間葉系間質細胞を分離するメソッドが提供されます。その特性とその脂肪細胞分化を促進するためのプロトコルを説明します。

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

このプロトコルの全体的な目標は、不整脈原性心筋症患者から心臓間葉系間質細胞を分離し、脂肪原性分化適性をテストし、表面マーカーを表現型化することです。この方法は、アディポ置換における心間質細胞の関与や分子メカニズムの強調など、不整脈原性心筋症領域における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ストーマ細胞の単離を、非常に小さな心臓標本からいくつかの簡単な継代で実施できることです。この方法は、不整脈原性心筋症の研究に洞察を提供することができます。また、心内膜心筋生検が適応となる心血管疾患の研究など、他のシステムにも適用できます。私たちがこの方法のアイデアを最初に研究したのは、ストーマ細胞の単離の手順を縮小して、心臓生検とそれが提供できる電気生理学に適用できることを理解したときでした。このプロトコルでは、統合された電気解剖学的マッピングと心臓透視法を使用して、ACM 患者の右心室から心内膜心筋生検を収集します。約5グラムの組織を採取し、TMES培地でラボに発送します。ラボでは、必要に応じて生物学的安全キャビネットを設置し、エンソマティック消化までの手順を実行します。次に、生検をプレートに移し、PBSで2回洗浄します。この時点で、生検は顕微鏡下で写真に記録される場合があります。次に、生検を1ミリリットルのコラゲナーゼ溶液を含む2ミリリットルのチューブに移します。そこで、サンプルを幅0.5〜1ミリメートルの小さな断片にカットします。次に、組織を摂氏37度で90分間インキュベートし、連続的に回転させながら攪拌します。次に、消化した溶液を遠心分離し、上清を取り除き、ペレットを1ミリリットルのPBSに再懸濁します。次に、チューブを再度遠心分離し、上清を取り除き、ペレットを1ミリリットルのTMESに再懸濁します。次に、サスペンションを60ミリメートルプレートにプレートし、TMESを使用してプレートを最大3ミリリットルまで充填しますが、それ以上は充填しません。次に、テキストプロトコルに従って細胞を培養および増殖します。開始する前に、細胞解離試薬、洗浄バッファー、および必要な抗体を使用できるように準備します。培養物の推定細胞数が300万に達したら、100ミリメートルプレートを10ミリリットルの滅菌PBSで2回洗浄します。次に、細胞解離試薬5ミリリットルを細胞に加え、プレートを室温で7〜10分間インキュベートして細胞を剥離します。細胞が剥離したら、15ミリリットルのPBSを細胞に加え、懸濁液を50ミリリットルのチューブに移します。次に、細胞を遠心分離し、ペレットを1ミリリットルの洗浄バッファーに再懸濁します。次に、細胞を数え、300万個を新しいチューブに移し、最終容量1.5ミリリットルの洗浄バッファーに入れます。次に、サスペンションを12本のファックスチューブに分割します。各チューブに、推奨濃度でCMSCの特性評価に使用する抗体を加えます。アイソタイプコントロールを必ず含めてください。調製したら、チューブを室温で15分間インキュベートし、光から遮蔽します。その後、各チューブに1ミリリットルの洗浄バッファーを追加して、反応を停止します。次に、細胞を遠心分離し、上清を取り除き、ペレットを250マイクロリットルの洗浄バッファーに再懸濁します。次に、フローサイトメトリーを使用して細胞の特性評価に進みます。細胞の脂肪分化後、ORO染色を使用して脂質蓄積をテストします。開始する前に、OROが機能するソリューションがあることを確認してください。細胞を染色する前に、培地を取り出し、2ミリリットルのPBSで細胞を2回洗浄します。次に、細胞を4%パラホルムアルデヒドで覆い、室温で5分間固定します。次に、パラホルムアルデヒドを廃棄し、細胞を2ミリリットルのPBSで2回洗浄します。2回目の洗浄後、細胞を覆うのに十分なORO作業溶液を追加します。次に、プレートを室温で1時間インキュベートします。このインキュベーションは、自動解が作動しない環境で実施する必要があるため、部屋がいっぱいになることはお勧めしません。インキュベーション後、ORO溶液を吸引し、PBS洗浄液で染色物が見えなくなり、顕微鏡で観察したときに非特異的な染色が検出されなくなるまで、細胞を2ミリリットルのPBSで数回洗浄します。次に、倒立組織培養位相差顕微鏡を使用して、各ウェルの画像を20倍に拡大して20枚の画像をキャプチャします。詳細はテキストプロトコルで提供されます。CMSCは、記載されているように心内膜心筋生検から単離されました。それらの間葉系譜を確認するために、細胞を適切なフローロファー標識抗体とインキュベートし、フローサイトメトリーで分析しました。CMSCは、特異的間葉系表面抗原CD29、CD44、およびCD105に対して陽性でした。CD90陽性細胞の割合は変動することが知られています。内皮遺産、単球またはマクロファージ遺産、オノマトペ遺産、および主要な組織適合性複合体のマーカーは発現しませんでした。次に、CMSCをT.ADIPO培地で培養して脂肪分化し、OROで染色して細胞内脂肪滴を探しました。不整脈原性心筋症患者のCMSCは、健康な対照群の細胞よりも多くの脂肪滴を蓄積しました。これらの差は、72時間後と7日後の分化条件下で測定されました。習得すれば、細胞の分解能は3時間、染色は2時間、ファックス分析は3時間で完了します。この手順に続いて、薬物検査などの他の方法を実行して、同じ患者のストーマ細胞をさまざまな刺激に反応させることができるかなどの追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、不整脈原性心筋症の分野の研究者が、疾患の病因におけるヒト心間質細胞の関与を探求する道を開きました。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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分離と性質、大人マウス心臓から心臓の幹細胞の分化

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成人心臓線維芽細胞と筋線維芽細胞の分離と特徴付け

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単成マウス心臓の心房と心室の両方から筋細胞と非筋細胞を同時に分離する方法について説明する。このプロトコルは、高生存性心筋細胞および非筋細胞の一貫した収量をもたらし、フェノタイピングおよびインビトロ分析のための最適な細胞特異的培養条件を詳述する。...

心房筋細胞、心室筋細胞、および非筋細胞の同時分離と培養

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マウスからの心筋細胞分離のための前向きの灌流法

学ぶ心内膜心筋生検から心臓間葉系間質細胞を分離する方法。催不整脈性心筋症患者の細胞を用いて脂肪分化能と表面マーカー性状を評価し、疾患メカニズム解明に貢献します。

催不整脈性心筋症患者の心内膜心筋生検サンプルから心臓の間葉系間質細胞の分離と性状

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