Name: 不可逆エレクトロポレーションの効果を研究する同系膵癌マウス モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: 学ぶ不可逆エレクトロポレーション（IRE）による膵癌治療の効果を、免疫機能を持つC57BL/6マウス同系腫瘍モデルで評価する方法。この技術は腫瘍微小環境と免疫応答の研究に有用です。

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RRW はこれが原因 (#PTC2017) サンディエゴ C3 パドレス ペダルによって資金を供給共同トランスレーショナルリサーチ研究助成から作業の支援を受けた。

すべての動物実験は、このプロトコルはそれぞれ機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) によって承認される必要があります、次を実行します。ここで説明したすべての手順は、UCSD IACUC によって承認されています。
1. 調達受信者動物
注: LSL Kras の腫瘍から KPC リュック 4580 セルラインを設立G12D/+;LSL Trp53R172H/+;PDX1Cre/+;LSL ROSA26リュック/+マウス (KPC)、C57BL/6 バック グラウンドで PC の組み換えモデルであります。この細胞ラインの利点は、それは恒常ルシフェラーゼの有効化腫瘍監視直交異方性モデルの表現です。ただし、受信者のマウスの遺伝的背景と互換性がある限り、他の細胞が使用も可能性があります。
<ol><li>実験グループとグループごとのペット数を事前に決定します。</li>
	<li>年齢 (6 - 10 週古いマウスをお勧めします) を選択し、仮説および細胞ラインに従って使用されている動物のセックスを使用します。</li>
</ol>2. 培養細胞
<ol><li>使用ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM): 栄養混合物 F12 (50: 50) メディア 10% 牛胎児血清 (FBS) および 1% ペニシリン-ストレプトマイシン抗生物質 (完全な成長媒体) KPC リュック 4580 セルを育てることを含みます。</li>
	<li>固定されている場合、細胞腫瘍移植前に 4 日間を解凍します。</li>
	<li>無菌条件下で CO2 95% 湿度 5% と 37 ° C で細胞を成長します。</li>
	<li>Trypsinize 0.25% セル トリプシンで 37 ° C に達する前に 5 分間 > 80% の confluency 完全な成長媒体の体積の 2 倍を追加してトリプシンを中和します。 注: これらの細胞は確立しません腫瘍効率的にマウスの 100% の confluency に使用されている場合、または彼らは、以上 12 回の継代します。したがって、最適な confluency 下の以前の通路で細胞を凍結することをお勧めします。</li>
	<li>診断を使用してセルをカウントし、十分な数が存在する場合は腫瘍誘導に進みます (0.5 - 1 x 106セル/マウス)。ない場合は、十分な細胞数が得られるまで、1 つ以上の通路のセルを展開します。</li>
</ol>3. 平方腫瘍の誘導
<ol><li>必要な材料の準備: P1000 は、P100 ピペットとヒント、1 mL シリンジ、25 G 針、基底膜マトリックス (BMM) DMEM 基底メディア、1.5 mL 遠心チューブ。プロシージャが終了するまですべての材料滅菌と冷たい (4 ° C) をしてください。またバリカンを保ち、アルコール綿棒は動物の使用の準備ができています。</li>
	<li>(に従ってステップ 2.4) trypsinize し、セルをカウント 2-4 107セル/mL 冷たい DMEM の倍の濃度でそれらを再懸濁します。</li>
	<li>100% の等量を追加 50% で最終的な細胞の懸濁液に BMM BMM。最終巻は、必要な各マウスの細胞懸濁液を 50 μ l 添加になるべきであります。ピペッティング エラー、シリンジ内のデッド スペースに対応する超過分の 10% を準備します。</li>
	<li>分注 1.5 mL 遠心チューブに 550 μ L のボリュームの懸濁液は氷に置かれます。</li>
	<li>動物 (6 週間の古い男性 c57bl/6 マウス)、落を使用を抑制または手動で。 注: また、マウスでく麻酔と 2.5% イソフルレン精度の気化器を使用して 2 L/分の流量で酸素ガス。</li>
	<li>できれば足の上のわき腹、クリッパーを使用は注射部位を剃る。アルコール綿棒で、2 回の注射部位を拭きます。</li>
	<li>1 mL の冷たい注射器 10 の7セル/mL x 1-2 の最終的な集中に細胞懸濁液を 250 μ l 添加を描画し、ピストンを上下に移動することによって空気の泡を削除します。25 G 針と注射器を付けるし、針内のスペースを入力してください。</li>
	<li>慎重に針の腹腔内や手足の筋肉が貫通していないことを確かめて、側面の近くに本体に 30 ° の角度で皮膚の下に針を挿入します。</li>
	<li>体に平行の針を平らにし、皮膚にしわを平らにします。細胞懸濁液を 50 μ l 添加をゆっくりと注入します。10 の注射部位に針を保持する任意の漏れを防ぐために固めるため BMM を許可する s。</li>
	<li>ゆっくりとそれを任意の横の動きに平行保つ針を撤回します。軽くアルコール綿で注射部位をきれいにしその住宅にマウス ボタンを離します。 注: マウスは、プロシージャの間に麻酔された場合、は、その立ち直り反射が回復まで動物を監視します。</li>
	<li>直径 5 mm に達するまで定期的にノギスを使用して腫瘍の成長を監視します。</li>
</ol>4. 同所性同種腫瘍の誘導
<ol><li>必要な材料を準備します。オートクレーブ手術ツールをはさみ、メス、針ドライバーや指摘など、フラット先端の鉗子。便利な滅菌縫合糸 (6-0 吸収性と非吸収性 4-0)、アルコール綿棒、バリカン、脱毛クリーム、目の潤滑剤、綿ガーゼ、10% ポビドン ヨード溶液による、手術用ドレープ、ウォーマー、ブプレノルフィンと麻酔剤を保ちます。</li>
	<li>(できれば、同じ背景の実験モデルに必要な) ドナー マウスを安楽死させる遅い塗りつぶし CO2チャンバーを用いた SQ KPC 腫瘍を運ぶします。滅菌鉗子と同所性同種移植直前に刀を使用して BSL-2 フードの無菌条件下で慎重に SQ の腫瘍を切除します。腫瘍切除時に腹膜腔を穿刺して滅菌 PBS 2 交換ですぐに腫瘍を洗っていない注意してください。</li>
	<li>生殖不能のメスを使用して、1 mm の3個セットに切除した腫瘍をミンチ、含有冷滅菌 DMEM 基底メディア、シャーレの上に置きます、着床まで氷の上保存します。</li>
	<li>受信者マウス 0.05 - 1 mg/kg ブプレノルフィン鎮痛剤 SQ、手術前に 30 分を管理します。</li>
	<li>酸素 (2 L/分) で 2-3% イソフルラン精度気化器 (または他の麻酔剤) を使用して受信者マウスを麻酔します。プロシージャの全体のためのパッドを加熱、37 ° C のマウスを維持します。乾燥を防ぐために目を潤滑します。反射を最初に、驚くべきの欠如によって麻酔の深さをテストし、穏やかなつま先のピンチにペダルの反射の欠如によって麻酔外科平面を確認します。全体の手術中に麻酔を維持します。</li>
	<li>その裏にマウスを置き、腹部の左側が公開されますので、そっとの右側にそれを回します。脱毛クリームを使用してマウスの腹部の毛を取り除くし、無料髪に腹部ポスト切開が入らないようにガーゼで拭き取ります。左腹部を皮膚を消毒するアルコール綿に続いて 10% ポビドン ヨードの 3 サイクルを使用して手術に備えます。</li>
	<li>脾臓に若干内側皮膚、胸郭の下の正中線の左に 1 cm で 1.5 cm 横や斜切開を作る生殖不能のメスを使用して。穿刺部位の表面的な切開をミラーリング、腹部の筋肉切開を拡張します。</li>
	<li>鉗子の先端フラットを使用して脾臓を探し、優しく腹部キャビティから切り離すこと。滅菌綿棒を使用して脾臓を撤回、脾臓の下に接続されている膵尾部を見つけます。</li>
	<li>フラット先端の鉗子を使用して、横方向に膵臓の尾部を撤回します。</li>
	<li>罰金 (6-0) 滅菌縫合針の先端でドナー マウスから 1 つ細かくみじん切りにした腫瘍部分をピックアップし、滅菌鉗子を使用します。</li>
	<li>そっと横に膵臓の尾/体を取り消し中、に膵尾部腫瘍フラグメントを含む縫合の針を挿入します。膵尾部と接触して腫瘍を保持している組織を通じてゆっくりと縫合糸を渡します。組織に関連してフラグメントの方向に応じて 1 つまたは 2 つの追加縫合を適用します。</li>
	<li>組織から針を完全に削除し、追加の 60 の外部膵臓/脾臓出血やリークの兆候を検査しながら s。その後、彼らを内面化優しく鈍い鉗子を用いた腹腔内に。</li>
	<li>連続または断続ステッチ 6-0 吸収性縫合糸を用いたいずれか腹部の筋肉を閉じ、3 0 6 0 非吸収性縫合を用いた穿刺部位の皮膚を閉じます。この時点で麻酔を中止します。</li>
	<li>食べ物と水への無料アクセスとそのホームのケージで回復するマウスを許可します。回復を容易にするために加熱パッドにケージを配置します。灌流など、回復処理中に、呼吸などのバイタル サインを監視します。</li>
	<li>一度マウスを回復すると通常住宅に戻りケージが立ち直り反射の兆候を確認します。</li>
	<li>ブプレノルフィン 0.05 - 0.1 mg/kg を管理、手術後 8 〜 12 時間と術後の痛みの兆候を必要に応じてすべての 8-12 h。</li>
	<li>イメージング システム体内の発光を用いた腫瘍成長を監視 (材料の表を参照してください)。<ol>
<li>同所性同種移植後 4 日目からイメージングによる腫瘍の成長に従うし、週に 2 回のイメージングを実行します。</li>
		<li>イメージングの日、(腹腔内投与) の管理、麻酔に D-ルシフェリンを 30 mg/kg (酸素 (2 L/分) で 2-3% イソフルラン) 受信者マウス画像の前に 10 分。</li>
		<li>ルシフェラーゼ利用、排出フィルターせず発光設定最低発光イメージャまだマウスの麻酔を維持しながら、自動蛍光無料加熱ステージと 5 s の露出のためのイメージです。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 平方腫瘍の怒り
<ol><li>必要な材料の準備: 正方形波遺伝子導入装置、安全フット スイッチ、電極 (ピンセット描き出す対針アレイ) とアダプター。滅菌縫合 (非吸収性 4-0)、アルコール綿棒、バリカン、脱毛クリーム、目の潤滑剤、ガーゼ、ブプレノルフィン、麻酔薬を維持も近くにあります。</li>
	<li>ピンセットを滅菌またはガス滅菌を使用してアレイ電極を針します。オートクレーブに入れることはお勧めしません。動物と電極を滅菌するのにガラス ビーズ滅菌器を使用します。</li>
	<li>ブプレノルフィン 0.05 - 担癌マウス手続きの前に 30 分に 0.1 mg/Kg を管理します。</li>
	<li>手順 4.4 4.5 平方腫瘍インプラント直径 5 mm に達すると正常にマウスの麻酔を誘導します。</li>
	<li>その側の側面に平方腫瘍にアクセスする麻酔下のマウスを置きます。バリカンとアルコール綿棒を使用してきれいな肌を使用して髪を削除します。</li>
	<li>平方腫瘍 2 針アレイ電極を使用します。鉗子を用いた腫瘍部位の直下の皮膚を昇格し、腹腔内を浸透しないように体に平行の皮膚を通して電極を挿入します。一度、皮膚を通して彼らが腫瘍をブラケットように電極を配置します。</li>
	<li>150 パルスの合計 1,500 V/cm で 1 Hz の周波数で 100 μ s のパルスを提供する遺伝子導入装置をプログラムします。足のペダルを使用してパルスを提供します。10 パルスの各セットを区切って 10 s、放熱を可能にして電極の正しい位置を確認するために。 注: 麻痺剤を使わず、マウスは、手動でセキュリティで保護しない限り、電極の変位を引き起こすことができます怒りと筋収縮を経験するでしょう。</li>
	<li>本体に表示される実際の電圧が配信されると、200 s. レコードを超えないようにする必要があります完全な投与後電極を削除します。4.14 4.16 の手順ごとに怒り、次を回復するマウスを許可します。</li>
</ol>6. 同所性同種腫瘍の怒り
注: 同所性同種腫瘍の怒りには、開始する前にローカル IACUC から特別な承認を必要とする従って同じマウスの生存術が含まれます。
<ol><li>必要な材料の準備: オートクレーブはさみ、メス、針ドライバーなど手術器具、鉗子を指摘し、フラット鉗子の先端します。近くにしてください: 滅菌縫合 (6-0 吸収性と非吸収性 4-0)、アルコール綿棒、バリカン、脱毛クリーム、目の潤滑剤、綿ガーゼ、10% ポビドン ヨード溶液、手術用ドレープ、ウォーマー、方形波遺伝子導入装置安全フット スイッチ、電極と彼らのアダプター、ブプレノルフィン、および麻酔薬。</li>
	<li>生体内イメージングを用いた同所性同種腫瘍成長のためマウスを評価 (手順 4.17 参照) D-ルシフェリンの 30 mg/kg を腹腔内注射することによって。 注: 直交異方性腫瘍は、腫瘍がはっきりと見え、まだ限られた膵臓 (代表結果参照) ルシフェラーゼ発光画像を見ることができるとき怒り治療 8 〜 10 日のポスト注入に最適です。</li>
	<li>手順 4.4 から 4.9 癌移植腫瘍を検索します。場合は腫瘍が胃と脾臓腫瘍を識別するために軽く移動する鈍い鼻鉗子を使用して、検索する容易ではないです。</li>
	<li>鈍い鼻鉗子で腫瘍を外部化し、ピンセット描き出すの白金電極をしっかりと腫瘍をキャプチャします。手順 5.7 フット スイッチによって制御される 10 パルスのセットで方形波本体の使用によるプログラムは、エレクトロポレーション パルスを提供します。</li>
	<li>腫瘍の少なくとも 60 の記事は出血の兆候を監視する怒りの外部化をしてください。腫瘍を腹腔内に挿入し説明されている (手順 4.13 4.16) 以前として切開を閉じるし、それが回復するまでマウスを監視します。</li>
	<li>怒りの 4.17 のステップに従って体内ルシフェラーゼ イメージングによる腫瘍の成長に及ぼす影響を監視します。</li>
</ol>

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</ol>

著者関連の財務情報開示があります。

本研究で我々 は、IRE の腫瘍増殖に及ぼす影響を研究するために使用できる PC 用免疫マウスモデルを実証しました。現在、怒りは高い選択ローカル高度な PC の患者に術前療法のヶ月後遠い病気の進行していない非熱的アブレーション技術として使用されています。ローカル高度な PC のほとんどの患者は遠隔転移疾患20成長するのでその使用したがって制限されています。このモデルは、さまざまな治療を拡張パラメーターとの組み合わせを使用して PC 上の怒りの効果を評価する研究のための基礎として機能します。
プロトコルの中に考慮すべき最も重要なことは、怒りを実行する腫瘍のサイズです。マウス モデルの市販のプローブは、電極間隔 (5-10 mm) によって制限されます。したがって、電極の距離よりも大幅に大きい腫瘍、不完全なアブレーションは起こる。平方腫瘍ピンセット trodes 上 2 針アレイ電極の使用ピンセット trodes の電流の流れに抵抗が増加、腫瘍の周囲の皮膚にお勧め。同じ腫瘍で様々 な深さや角度で怒りを実行して 2 針アレイ電極のサイズの制...

膵管腺癌 (PC) は 2020年1のまわりの米国のがんによる死亡の 2 番目の主要な原因になると予想されます。遠隔転移疾患2から PC と診断された患者の大半は死んでしまいます。PC 環境は悪名高い免疫抑制・化学療法耐性。その線維形成性間質 (抗腫瘍) エフェクター T 細胞の希少性と腫瘍関連マクロファージ (Tam) を含む免疫抑制の白血球の卓越性、骨髄性の派生サプレッサー細胞 (MDSCs) を含み、レギュラトリー T 細胞 (Treg)3.これらの根底にある、微小環境のこれらの効果を打ち消すマルチ モーダルの戦略を開発する必要があります。
怒りが腫瘍の非熱的手法として開発されました。熱アブレーションとは異なり怒りは急速凝固壊死は発生しませんが、代わりに段階的なアポトーシス細胞死4の結果します。膵臓の腫瘍の重要な怒りが脆弱になり「ヒートシンク」効果と血管5のすぐ隣に実行することができます。この技術6 FDA から 510 (k) のクリアランスがあり選択したローカル高度なまたは境界性膵癌症例に対する臨床的に使用されている現在。公開シリーズ最多の怒りの PC7怒りを受ける患者の生存期間中央値約切除8,9なしで単独で近代的な化学療法で治療された患者の生存ダブルだった。
その熱凝固 (チューらの見直しその他の腫瘍型全身性免疫反応を誘導するいくつかの研究が示しています。10). ラジオ波焼灼術 (RFA) 動物腫瘍モデルつながる T 細胞の浸潤11,12、肝細胞がん患者13、アクティブ化されたナチュラル キラー (NK) 細胞の増加を含む 14、および肺がん患者15免疫自己寛容の減少。研究の少数は、免疫、アイソレータケージと怒り16傷害応答を検討しています。怒りは、セカンダリ (反対側) の腎移植の成長が減少または 2 週間原発の怒りによって防ぐ免疫マウスモデルの全身性免疫反応を刺激するために示されている以前17。また免疫マウスに免疫不全マウスがより完全な回帰のため以下の電圧が必要なことがわかりました。熱焼灼凝固壊死と比較して改善された抗原提示に怒りがありますが、この具体的には検討されていないえられています。
男性の LSL Kra で開発した腫瘍から派生した KPC リュック 4580 のセル行 (j. j. 葉はノースカロライナ大学からの贈り物) から PC の同系マウス モデルを開発しているG12D/+;LSL Trp53R172H/+;PDX1Cre/+;LSL ROSA26リュック/+マウス、怒り18,19の局所的・全身的効果を研究します。このルシフェラーゼ発現細胞株を免疫原性あり、SQ やがんを注入し、確実に脾臓に注入する肝転移を生成したとき免疫 c57bl/6 マウスにも発癌性。2 針アレイ プローブ (5 mm で区切られた) または SQ または同所性同種腫瘍にプラチナ ピンセット trodes を使用した 1,500 V/cm の電圧/距離比で電気の 100 μ s のパルスを提供するプログラミング可能な方形波のパルス発生器を利用してそれぞれの小動物における怒りの効果をモデル化するマウス。

<table><tbody><tr><td>ECM 830 矩形波エレクトロポレーター</td><td>ハーバード装置</td><td>BTX # 45-0002 ( 58018-004 )</td><td></td></tr><tr><td>2 ニードルアレイ電極</td><td>ハーバード装置</td><td>45-0167</td><td></td></tr><tr><td>安全フットスイッチ</td><td>ハーバード装置</td><td>45-0211</td><td></td></tr><tr><td>プラチナピンセット</td><td>ハーバード装置</td> <td>&nbsp;45-0486</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 培地</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning&nbsp;</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td></td><td></td>792632</tr><tr><td>Lacrilube</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>19090646</tr><tr><td>ブプレノルフィン</td><td>・フィッシャー・サイエンティフィック&nbsp;</td><td></td><td></td>NC1292810</tr><tr><td>D-ルシフェリン</td><td>パーキン エルマー</td><td>122799</td><td></td></tr><tr><td>IVIS&nbsp;Spectrum In Vivoイメージングシステム</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>Mouse strain C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory&nbsp;</td><td>000664/Black 6</td><td></td></tr><tr><td>細胞株 (KPC-Luc 4580)</td><td>J.J. Yeh Lab at University of North Carolina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Precisionglide syringe needles</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td></td><td></td>Z192406</tr><tr><td>アルコールスワブ(70%イソプロピルアルコール)</td><td>BD</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>デジタルノギス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-648-17</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てメス、滅菌</td><td>VWR</td><td>21909</td><td></td></tr><tr><td>綿先端アプリケーター</td><td>VWR</td><td>89198</td><td></td></tr><tr><td>縫合針、45 cm、サイズ 6-0</td><td>ハーバード装置</td><td>72-3308</td><td></td></tr><tr><td>縫合針、45 cm、サイズ4-0</td>ハーバー<td>ド装置</td><td>72-3314</td><td></td></tr><tr><td>ポビドンヨード10%</td><td>BD</td><td>29900-404</td><td></td></tr><tr><td>使い捨て保温パッド&nbsp;</td><td>ケントサイエンティフィックコーポレーション</td><td>TP-3E</td><td></td></tr><tr><td>マウスバリカン</td><td>ケント・サイエンティフィック社</td><td>CL8787</td><td></td></tr><tr><td>外科用ドレープ</td><td>ハーバード装置</td><td>59-7421</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10010023</td><td></td></tr></tbody></table>

不可逆エレクトロポレーションの効果を研究する同系膵癌マウス モデル

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

膵臓癌 (PC)、米国では、約 40,000 の患者は毎年を殺す病気正常に有望な免疫療法戦略を含むいくつかの治療的アプローチを拒み。不可逆エレクトロポレーション (IRE) は、腫瘍血管の近くで実行されるプロシージャを可能に隣接の膠原線維構造物の破壊を伴わない腫瘍細胞死を誘導する非熱的アブレーション手法です。熱アブレーションとは異なり IRE を誘発即時アブレーション壊死とともに、段階的なアポトーシス細胞死における結果、ローカル高度な PC と選択した患者の臨床使用されています。切除非ターゲットの怒りのような特定のプロシージャは無数の腫瘍微小環境における応答を引き起こすことができます。いくつかの研究は、他の種類の腫瘍における腫瘍増殖に及ぼす怒りを対処しているが、どれも PC に焦点を当てています。様々 な縦断研究 post プロシージャを促進する、高度に制御設定で怒りの皮下 (SQ) と同所性同種腫瘍を正常に扱うことができる PC の同系マウス モデルを開発しました。この動物モデルは、怒りと怒りの臨床効果を改善する方法の効果を研究する堅牢なシステムとして提供しています。

我々 は、手順を実行上記の説明し、5-6 週古い野生型 c57bl/6 マウス接種 50 %1 x 10 の6セル平方腫瘍を生成 BMM。腫瘍の大きさが直径 5-6 mm に達したら、マウスのいくつかを安楽死させ、彼らの腫瘍摘出、し受信者 c57bl/6 マウスにがんを移植します。タイムライン図1 に示すように、怒りだったイオン注入後の行われた 10 日間です。怒りは、平方腫瘍を有する残りのマウスで行われました。
SQ の腫瘍、怒りの電圧とパルス持続時間保たれた 1,500 V/cm、100 μ s で一定、それぞれがパルスの数を変化させます。図 2は、150 パルス 75 パルスだけでなくが怒りの後、いくつかのマウスの平方の腫瘍が完全に後退したを示します。合計では、4 のうち 9 マウスは怒りの 150 パルス...

不可逆エレクトロポレーション (IRE) は、局所進行膵癌の治療に使用される非熱的アブレーション技術です。比較的新しい技術であること、怒りの腫瘍増殖に及ぼす影響はよくわかっていません。膵臓癌に怒りの効果の研究を容易にする同系マウス モデルを開発しました。

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

このモデルの全体的な目標は、免疫担当マウスの膵臓がんに対する不可逆的なエレクトロポレーションまたは IRE の影響を研究することです。このモデルは、膵臓がんにおけるIREの役割に関する多くの重要な質問に答えるのに役立ちます。たとえば、IREは局所腫瘍微小環境にどのように影響しますか?このモデルの主な利点は、ノックアウトマウスモデルや変異マウスモデルを必要とせずに、免疫適格系での正確な腫瘍増殖評価を容易にすることです。この方法は、膵臓がんの免疫担当マウスモデルにおいて、IREが免疫系に及ぼす影響についての洞察を提供することができます。皮下腫瘍導入術では、まず、麻酔をかけた6週齢の雄C57ブラックシックスマウスで注射部位を剃り、アルコール綿棒を使用して部位を2回洗浄します。次に、冷たい1ミリリットルの注射器に、1ミリリットルあたり7個の細胞と250マイクロリットルの基底膜マトリックスに1〜2倍の10をロードします。25ゲージの針をシリンジに取り付け、腫瘍細胞懸濁液を針にロードします。プランジャーを数回押して引っ込め、気泡を取り除きます。注射部位の皮膚の下に針を30度の角度で慎重に挿入します。針を体と平行にして、腫瘍細胞の50マイクロリットルをゆっくりと注入します。10秒後、針を横に動かさずに平行に保ちながらゆっくりと引き抜き、アルコール綿棒で注射部位を優しく洗浄してから、マウスをケージに戻します。腫瘍が5〜7ミリメートルに達したら、バイオセーフティレベル2のフードで無菌条件下で、腹腔に穴を開けないように注意しながら、滅菌鉗子とマイクロハサミを使用して皮下腫瘍を切除します。切除した腫瘍を直ちに滅菌PBSで2回洗浄します。そして、滅菌メスを使用して、腫瘍を1〜2個の立方体ミリメートルの断片に細かく刻みます。次に、腫瘍片をペトリ皿に移し、氷上に冷たく滅菌したDMEM基礎培地を入れます。腫瘍片を移植するには、つま先のつま先つまみに対する反応がないことを確認した後、麻酔を受けたレシピエント動物の目に軟膏を塗布し、マウスをその右側に置き、腹部の左側が露出するようにします。脱毛クリームで腹部の毛を取り除き、ガーゼでクリームを取り除きます。露出した皮膚を3つの連続した10%ポビドンとヨウ素およびアルコールワイプで消毒した後、滅菌メスを使用して、皮膚に1.5センチメートルの切開を行い、正中線の左側に1センチメートル、胸郭の下、脾臓のわずかに内側に切り込みを入れます。先端が平らな鉗子と滅菌綿のアプリケーターで脾臓を穏やかに外部化し、鉗子を使用して脾臓の底にある膵臓の尾を横方向に引っ込めます。滅菌鉗子を使用して、細かく刻まれた腫瘍片を1つつかみ、細い6-O滅菌縫合針をピースに通します。腫瘍片を含む針を膵臓の尾部に挿入し、縫合糸をゆっくりと組織に通します。腫瘍の播種を防ぐために、腫瘍と腹壁の筋肉組織および腹膜との接触を避けるように注意してください。腫瘍の断片が固定されたら、組織から針を完全に取り外し、出血の兆候がないか検査しながら、臓器をさらに60秒間完全に外部化したままにします。出血が認められない場合は、鈍い鉗子または綿の先端アプリケーターを使用して、脾臓、膵臓、腫瘍を腹腔内にやさしく戻します。腫瘍が直径6ミリメートルに達する前に、麻酔をかけた動物を右側に置いて腫瘍にアクセスできるようにし、バリカンとアルコール綿棒を使用して腫瘍部位を清掃します。鉗子を使用して、腫瘍の真下の皮膚を持ち上げ、電極が腹腔を貫通しないように注意しながら、体と平行に皮膚を通して2つのニードルアレイ電極を挿入して腫瘍を囲みます。エレクトロポレーターを1ヘルツの周波数で1500ボルト/センチメートルで合計150パルスのパルスを送達するように設定し、フットペダルを使用してパルスを送達し、10パルスの各セットを10秒ずつ離してパルスを送達し、各パルスセット間の熱放散を可能にします。筋肉のけいれんはIRE送達中に発生し、最初のパルスセット中により顕著になるため、電極がまだ目的の場所にあること、および各パルスセットの後に動物がまだ鎮静されていることを確認してください。投与後200秒以内に電極を取り外し、エレクトロポレーターに表示されているように、実際に供給された電圧を記録します。次に、マウスをケージに戻します。同所性腫瘍のIREの場合、腫瘍移植後8〜10日で、鈍い鼻の鉗子を使用して腫瘍を鉗子で外部化し、ピンセットのプラチナ電極で腫瘍をしっかりと捕捉し、今示したようにエレクトロポレーションパルスを送達し、腫瘍を最後のパルスセットのために外部化し続けます、少なくとも60秒間、 出血の兆候がないか監視します。次に、腫瘍を腹腔に戻し、示されているように切開部を閉じ、動物が完全に回復するまで動物を監視します。この代表的な実験では、マウスの約50%の皮下腫瘍が、150回のIREパルス後に完全に退縮し、75パルス後にはわずかな退縮しか見られませんでした。IREの1週間後の腫瘍組織の組織学的解析により、中央の腫瘍壊死の大きな領域が明らかになり、これらはコントロールでは観察されなかった未治療の腫瘍であり、不完全な腫瘍退縮の場合には生きた腫瘍組織に隣接していた。移植された同所性腫瘍の増殖速度をモニタリングすると、レシピエント動物では時間の経過とともに一貫した腫瘍増殖が明らかになりましたが、これはIREによっても破壊される可能性があり、免疫適格マウスモデルでIREの影響をシミュレートするこのモデルの能力を実証しています。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば、マウス1個あたり15分で完了できます。この手順を試みるときは、腫瘍が大きいほどアブレーションが不完全であるために一貫性のない反応を引き起こすため、腫瘍のサイズを利用可能なIRE電極の作動距離内に保つことを覚えておくことが重要です。放射線療法や化学療法などの他の治療アプローチも、治療を組み合わせることによりIREに対する腫瘍反応を改善できるかどうかについての追加の疑問に答えるためにも使用できます。このビデオを見た後、マウスで皮下および同所性の膵臓がんを確立する方法と、これらの腫瘍でIREを実行する方法についてよく理解しているはずです。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

このビデオでは、膵臓がんの発症のために、がん性ドナーから非がん性レシピエントマウスの膵臓に腫瘍断片を同所性に移植するための段階的な外科的方法を説明しています。同所性に移植されたPDACは、従来の皮下(SC)モデルよりも正確にヒトの膵臓がんの組織微小環境を再捕捉できます。...

同所性ホモグラフト腫瘍移植:膵臓腫瘍マウスモデル作製技術

このビデオでは、マウスの膵臓腫瘍の非熱アブレーションに対して不可逆的なエレクトロポレーション(IRE)を行う手順について説明しています。皮下腫瘍(SQ)腫瘍と同所性腫瘍はどちらも、高度に制御された環境でIREによる治療に成功し、処置後のさまざまな研究を容易にします。...

不可逆エレクトロポレーション:マウスの膵臓腫瘍を切除するための技術

このビデオは、緑色蛍光タンパク質発現膵臓癌細胞をマウスの膵臓に同所的に移植するためのプロトコルを示しています。同所性マウスモデルは、原発性および転移性腫瘍に対する新規治療薬の有効性を調査するのに役立ちます。...

蛍光同所性マウスモデル:がん細胞を発現するGFPをマウスに移植し、腫瘍の進行をin vivoで評価する

このビデオは、局所的な細胞送達のためのマトリゲルと腫瘍進行の非侵襲的モニタリングのためのin...

生物発光性同所性膵臓癌モデルマウス:マウスの癌進行をモニターするための非侵襲的技術

肝転移の前臨床マウスモデルは、半脾臓注入技術を介して行う。...

肝転移の前臨床マウスモデル

このプロトコルの目標は、マウスの同所性膵臓腫瘍異種移植片に対して動的コントラスト増強磁気共鳴画像法(DCE-MRI)を適用することです。DCE-MRIは、標的組織の微小血管系を非侵襲的に解析する方法であり、新規治療後の腫瘍の血管反応を評価するのに役立ちます。...

同所膵臓癌マウスモデルのダイナミックコントラスト強化磁気共鳴画像

ここでは、緑色蛍光タンパク質発現膵臓がん細胞（PANC-1 GFP)をBalb-c Ola Hsd-Fox1nuマウスの膵臓に同所的に移植し、腫瘍の進行と転移を評価する手順を紹介します。...

膵臓がんの蛍光同所性マウスモデル

マウス由来膵管腺癌細胞株の超音波誘導移植のためのプロトコルを原在腫瘍部位に直接記載する。このアプローチは、注射の2〜4週間以内に超音波スキャンによって検出可能な膵臓腫瘍をもたらし、外科的整形トピック移植と比較して腹壁の腫瘍細胞播種の割合を有意に減少させた。...

マウス膵管腺癌の超音波誘導矯正着移植

臨床文脈では、局所性膵臓癌の患者は汎膵切除術を受け、続いてアジュバント治療を受ける。ここで報告されるこのプロトコルは、膵臓癌の正体性移植を経て、遠位汎化切欠切術および脾臓摘出術を通じて、ヌードマウスでこの臨床シナリオをモデル化する安全で効果的な方法を確立することを目的としている。...

膵臓癌の正交性切除マウスモデル

膵管腺癌(PDAC)の同系マウス同所性同種移植片は、疾患サブタイプの生物学、表現型、および治療反応を再現します。迅速で再現性のある腫瘍進行により、前臨床試験で広く使用されています。ここでは、これらのモデルを生成するための一般的な方法を示し、同系マウスPDAC培養物を膵臓に注入します。...

膵臓癌モデルへの同系マウス同所性同種移植片

本プロトコルは、膵管の視覚化と膵管の電気凝固による膵管閉塞を引き起こす慢性閉塞性膵炎をモデル化するための新しいアプローチを説明しています。...

電気凝固によって確立された閉塞性慢性膵炎モデル

学ぶ不可逆エレクトロポレーション（IRE）による膵癌治療の効果を、免疫機能を持つC57BL/6マウス同系腫瘍モデルで評価する方法。この技術は腫瘍微小環境と免疫応答の研究に有用です。

不可逆エレクトロポレーションの効果を研究する同系膵癌マウスモデル

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