マウス小腸管免疫系からリンパ球を分離すること

このプロトコルの全体的な目標は、パイエル板や腸間膜リンパ節などの腸内誘導部位からリンパ球を分離し、固有層や上皮などのエフェクター部位を分離することです。この方法は、胃腸感染症、がん、炎症性疾患に対する免疫応答の理解など、粘膜免疫学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、小腸の異なるコンパートメントから高度に精製された生存可能なリンパ球を、最小限のクロスコンパートメント汚染で単離できることです。

一般に、この方法に不慣れな個人は、腸間膜リンパ節とパイエル板を特定して分離し、速度と精度のバランスを取り、最適な収量を得るのが難しいため、苦労するでしょう。プロトコールを開始するには、以前に麻酔をかけたマウスを背中に置き、70%エタノールをスプレーします。ハサミを使用して正中線を切開し、皮膚と腹壁を開いて腹腔を露出させます。

次に、盲腸の位置を特定し、鉗子を使用して盲腸をそっと引き下げます。鉗子を使用して小腸を慎重に右に動かし、結腸と整列している腸間膜リンパ節またはMLN鎖全体を露出させます。盲腸に最も近い位置にあるチェーンの一番下のノードを特定します。

1セットの鉗子を使用して周囲の腸間膜脂肪をつかみ、別の鉗子セットでリンパ節の周りの脂肪をピンセットでつまむことにより、MLNチェーンを下から上にゆっくりと動かします。次に、収穫培地でタオルを湿らせ、MLNチェーンをペーパータオルの上に置きます。ペーパータオルの上でチェーンを転がし、2セットの鉗子で脂肪を引き抜いて腸間膜脂肪を取り除きます。

MLN をコールドハーベスト培地に入れて、後の分離手順に使用します。はさみで、幽門括約筋の下と盲腸の上の小腸を切ります。1セットの鉗子を使用して腸を回腸から十二指腸までゆっくりと引き出し、別のセットの鉗子を使用して付着した腸間膜脂肪を取り除きます。

収穫培地で湿らせたペーパータオルの上に腸を置き、2セットの鉗子で残っている腸間膜脂肪をからかいます。これらのステップ全体を通して腸を湿らせておくには、定期的に収穫培地を塗布します。パイエルのパッチを湾曲したハサミで腸から取り除いて収集します。

小腸から5-11個のパイエルパッチを収集します。パイエルパッチをコールドハーベスト培地に入れて、後の単離ステップに使用します。鉗子の平らな面を使用し、十二指腸から回腸に向かってゆっくりとスライドさせて、糞便内容物と粘液を排出します。

この手順を1回繰り返して、ほとんどの粘液を取り除きます。一点に鈍い端がある細いハサミを使用し、鈍い端を腸に挿入し、十二指腸から回腸まで縦方向に開いた腸を切り開きます。開いた腸を横方向に2センチメートルに切ります。

腸片を50ミリリットルの円錐管に入れ、25ミリリットルのコールドハーベスト培地を入れて、後の分離ステップに備えます。MLNからリンパ球を分離し、3ミリリットルのシリンジのプランジャーを使用して70マイクロメートルのセルストレーナーでリンパ球を穏やかに解離します。セルストレーナーを5ミリリットルのコールドハーベスト培地で洗浄します。

MLN細胞を4°Cで5分間、重力400倍で遠心分離することにより、MLN細胞をペレット化します。次に、細胞ペレットを1ミリリットルのコールドハーベスト培地に再懸濁します。チューブを10回反転させることにより、25ミリリットルのコールドハーベスト培地で小腸片を3回洗浄します。

腸の部分が落ち着くのを待って、上清を注ぎます。次に、腸片を含む50ミリリットルの円錐管に20ミリリットルの予熱したジチオエリスリトールまたはDTE溶液を加え、内容物を攪拌棒付きの50ミリリットルのシリコン処理三角フラスコに移します。フラスコの外側にある大きな磁石を使用して攪拌子を保持し、組織と溶液を50ミリリットルの円錐管に戻します。

次に、チューブを最大設定で10秒間ボルテックスします。上清を70マイクロメートルのセルストレーナーを介して新しい50ミリリットルの円錐管に移し、組織片を元のチューブに保持するように注意します。細胞をペレット化します。

細胞ペレットを10ミリリットルのコールドハーベスト培地に再懸濁し、氷上に保存します。腸片が入った50ミリリットルの円錐管に20ミリリットルの予熱したDTE溶液を加え、攪拌棒が入った50ミリリットルのシリコン処理三角フラスコに戻します。フラスコの外側にある大きな磁石を使用して攪拌子を保持し、組織と溶液を50ミリリットルの円錐管に戻します。

チューブを最大設定で10秒間ボルテックスします。上清を70μmのセルストレーナーを介して、最初のDTE処理の上清からの細胞を含むチューブに移し、細胞を遠心分離します。細胞ペレットを8ミリリットルの44%密度グラジエント溶液またはDG溶液に室温で再懸濁します。

8ミリリットルの44%DG溶液と細胞懸濁液を17ミリメートル×100ミリメートルの14ミリリットルポリプロピレン丸底チューブに移します。セルを5ミリリットルのRT 67%DG溶液で下敷きます。ブレーキを使用せずに、RTで1、600倍の重力で25分間遠心分離します。

生細胞は、44%および67%の界面でバフィーコートを形成します。真空吸引により上部の脂肪層を取り除きます。パスツールピペットを使用して、界面でバフィーコートを収穫し、40ミリリットルのコールドハーベスト培地を含む50ミリリットルの円錐管に移します。

4°Cで5分間、重力400倍で遠心分離して細胞をペレット化し、細胞ペレットを1ミリリットルのコールドハーベスト培地に再懸濁します。残りの腸片に25ミリリットルの予熱EDTA溶液を加えて腸組織片から上皮細胞を取り出し、内容物を50ミリリットルのシリコン化三角フラスコに移し、攪拌棒で攪拌します。攪拌棒を持ち、腸の部分をフラスコに入れたまま、上清を慎重に捨てます。

上皮細胞の除去ステップをもう一度繰り返します。次に、50ミリリットルの室温の収穫培地を加え、中身を磁石で短時間攪拌します。次に、腸の破片が落ち着くのを待って、上清を慎重に捨てます。

30ミリリットルの予熱したコラゲナーゼ溶液を加え、腸片を攪拌します。撹拌後、消化された組織と上清を70μmのセルストレーナーを介して50ミリリットルの円錐管に移します。3ミリリットルのシリンジのプランジャーを使用してフィルターをマッシュスルーすることにより、残りの組織片を穏やかに解離します。

フィルターを10ミリリットルのコールドハーベスト培地で洗浄し、細胞をペレット化します。紡糸後、セルペレットを8ミリリットルの周囲温度44%DG溶液に再懸濁します。8ミリリットルの44%DG溶液セル懸濁液を、70ミリメートル×100ミリメートルのポリプロピレン丸底チューブに移します。

周囲温度67%DG溶液の5ミリリットルで下敷きし、次に勾配を遠心分離します。真空吸引により上部の脂肪層を取り除きます。パスツールピペットを使用して、界面でバフィーコートを収穫し、40ミリリットルのコールドハーベスト培地を含む50ミリリットルの円錐管に移します。

最後に、細胞ペレットを1ミリリットルのコールドハーベスト培地に再懸濁します。各腸の免疫コンパートメントは、リンパ球サブセットのユニークな組成によって代表されます。MLNは主にアルファベータT細胞で構成されていますが、PPリンパ球は主にB細胞です。

LPリンパ球の組成物は、主にアルファベータT細胞とB細胞で構成されています。IELは主にガンマデルタT細胞とアルファベータT細胞であり、基本的にB細胞はありません。LPおよびIELコンパートメント内のCD8α陽性αβT細胞は、CD8αホモ二量体またはCD8αβヘテロ二量体を発現したが、誘導部位CD8α陽性αββT細胞は、主にCD8αβヘテロ二量体を発現した。

IELコンパートメントのガンマデルタT細胞の大部分はCD8アルファを発現していましたが、MLNで見つかったガンマデルタT細胞はCD8アルファを欠いています。この手順を試みる際には、組織分離ステップ中に十分な時間と注意を払って、腸コンパートメント間の汚染を制限することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、単離されたリンパ球をex vivo刺激、フローサイトメトリー、およびその他の手法にさらして、さらなる表現型および機能解析を行うことができます。