Name: マウス小腸管免疫系からリンパ球を分離すること (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: 学ぶマウス小腸からPeyer's patches、腸間膜リンパ節、固有層、上皮などの誘導部位と効果部位からリンパ球を分離する方法。高純度で生存率の高い細胞を得て、消化管感染症や炎症性疾患の免疫応答研究に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

B.S.S. をサポートするには、NIH グラント (R01 AI076457) とストーニブ ルック大学によって提供される資金。Z.q 値は NIH 支え (K12 GM102778) を付与します。

すべての動物実験は、国立衛生研究所のガイドラインに従って実施され、石の小川の大学機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
メモ: は、手順を実行する前にすべての承認が与えられていることを確認します。
1. ソリューションの準備
<ol><li>
HGPG (HEPES、L-グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、ゲンタマイシン)、100 ×
	<ol>
<li>ミックス 59.6 g HEPES (最終的な 500 mM)、14.6 g L-グルタミン (最終的な 200 mM)、1 × 106 U (2,000 U/mL 最終) ペニシリン、ストレプトマイシン 1 g (2 mg/mL 最終) と 2.5 mg ゲンタマイシン (5 μ g/mL 最終)。追加 RPMI 1640 ~ 500 mL。NaOH を使用して 7.5 pH 調整 (調整する前にバッファーが ph 値約 6.0 の黄色/オレンジ色)。フィルターは、0.45 μ m のフィルターを使用して滅菌します。因数とストア 4 ° C、1 ヶ月、最長 1 年間、-20 ° C で。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
HEPES 炭酸バッファーは、10 x
	<ol>
<li>
23.8 g HEPES (最終的な 100 mM)、21 g NaHCO3 (最終的な 250 mM) を混合し、1,000 mL に水を追加します。塩酸フィルターで 7.2 pH を調整する 0.45 μ m のフィルターを使用して殺菌します。常温で保存します。PH は、時間の経過と共に変更します。再定期的に pH を調整します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
メディアを収穫 (〜 1 ボトル/2 マウス)
	<ol>
<li>500 mL RPMI 1640、25 mL の熱不活化ウシ胎児血清 (5% 最終)、および 5 mL 100 × HGPG を追加します。4 ° C で最大 6 ヶ月の保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ジチオエリトリトール (DTE) ソリューション (40 mL/小腸)
	<ol>
<li>ミックス 50 mL 10 × ハンクス平衡塩溶液、Ca2+- および Mg2+-無料、50 mL 10 × HEPES 炭酸バッファー、および 50 mL の熱不活化ウシ胎児血清 (10%)。350 mL H2O および 15.4 mg ジチオエリトリトール/100 mL (最終的な 1 mM) を追加します。使用する前に新しいこれを準備します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
エチレンジアミン edta 溶液 (50 mL/小腸)
	<ol>
<li>ミックス 50 mL 10 × ハンクス平衡塩溶液、Ca2+- および Mg2+-5 mL 100 × HGPG で無料。445 mL H2O を追加 260 μ L 0.5 M の EDTA を追加/100 mL (最終的な 1.3 mM)。使用する前に新しいこれを準備します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
コラゲナーゼの解決 (30 mL/LP)
	<ol>
<li>500 mL RPMI 追加 50 mL FBS (10 %fbs ファイナル) 5 mL 100 × HPGP、1 mL 0.5 M MgCl2 (最終 1 mM)、および 1 mL 0.5 M CaCl2 (最終 1 mM)。タイプ I (100 U/mL ファイナル)、コラゲナーゼを追加します。使用する前に新しいこれを準備します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
密度勾配 (DG) ソリューション
	<ol>
<li>90 mL DG 原液を混合することによって 1 × DG 原液を準備 (材料の表を参照) を 10 mL 10 × PBS の。4 ° C で滅菌を維持します。</li>
		<li>1 × DG 原液、56 mL RPMI 1640 44 mL を混ぜて 44 %dg ソリューション (8 mL/発想 8 mL/LP) を準備します。使用する前に新しいこれを準備します。</li>
		<li>1 × DG 原液、33 mL RPMI 1640 67 mL を混ぜて 67 %dg 溶液 (5 mL/発想 5 mL/LP) を準備します。使用する前に新しいこれを準備します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 腸間膜リンパ節、腸、の分離およびパイエル パッチ
<ol><li>炭酸ガス麻酔とセカンダリの頚部転位を使用してマウスを安楽死させます。その裏にマウスを置き、70% エタノールをスプレーします。はさみを使用して正中切開し、皮膚と腹壁腹腔内を公開するを開きます。</li>
	<li>盲腸を検索し、鉗子を使用して盲腸をそっと引き下げます。鉗子を使用して、慎重にチェーンは、コロンが提携した全体の MLN の公開、右に小腸に移動します。 注: 腸のチェーンやリンパ排水であった腸間膜リンパ節の地図には、13が描かれています。</li>
	<li>盲腸に近い、チェーンの下のノードを識別します。その周りに腸間膜/脂肪をつかんで鉗子の別のセットを持つリンパ節の周りから脂肪を tweezing によっては下部から上部の MLN チェーンを削除優しくする鉗子のセットを使用します。</li>
	<li>MLN チェーンを収穫メディアで湿らせたペーパー タオルに置きます。ペーパー タワーのチェーンをローリングと鉗子の 2 つセットで脂肪を引っ張って腸間膜/脂肪を削除します。冷たい収穫後の分離手順でメディアの MLN の場所。 注: ノードの (i) 直接操作は推奨されません。代わりに、それらの周りの腸間膜/脂肪を把握します。(ii) 細胞生存率を改善するために可能な限り多くの腸間膜/脂肪を削除するが重要です。</li>
	<li>幽門括約筋の下とはさみを使って盲腸上小腸をカットします。腸を引き出しますゆっくり回腸から十二指腸鉗子の別のセットを使用して接続されている腸間膜/脂肪を除去しながら 1 組の鉗子を使用します。</li>
	<li>収穫メディアで湿らせたペーパー タオルに腸を置き、鉗子の 2 つのセットをオフ任意の残りの腸間膜/脂肪をいじめます。 注: (i) は最適な細胞収量および実行可能性のために、できるだけ多くの腸間膜/脂肪を除去することを確認します。(ii) 収穫メディアを定期的に適用することによってこの手順と次の手順で湿らせた腸を維持します。</li>
	<li>曲線はさみで腸からそれらを削除することによって、パイエル板を収集します。解離性のスコープまたは虫眼鏡 (初心者) を必要な場合使用します。パイエル板のほとんどは訓練された目に見えるはずです。小腸から 5 11 (典型的な) パイエルを収集します。冷たい収穫後の分離手順でメディアの場所 Peyer のパッチ。 注: Peyer のパッチが小さく、主に丸腸間膜付着線向かい外側腸壁の膨らみ。</li>
	<li>糞便のコンテンツ、粘液を追放するのに回腸に向けて十二指腸から鉗子と優しくスライドの平らな側面を使用します。一度粘液の大部分を削除する手順を繰り返します。 注: 粘液の削除が不完全する細胞生存率が低下し、降伏。それにもかかわらず、必ず腸絨毛をストリッピングや基底膜の損傷を避けるためにゆっくりスライドしてください。</li>
	<li>高級はさみを使用し一点に鈍い端腸に鈍い端を挿入し、腸を縦十二指腸から回腸までオープン カットします。横方向に ~ 2 cm 開いた腸を切る。25 mL 冷たい収穫メディア分離手順については後で 50 mL の円錐管で腸の作品を配置します。 注: メディアで湿らせたはさみを維持に役立ちます腸で楽々 スライドします。</li>
</ol>3. 誘導サイトからリンパ球の分離
<ol><li>3 mL シリンジのプランジャーを使用して 70 μ m セル ストレーナーにどう優しく MLN リンパ球を分離します。5 ml の冷たい収穫メディアのセル ストレーナーを洗浄します。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 400 × g で遠心分離によるペレット MLN 細胞1 mL 冷たい収穫メディアで細胞ペレットを再懸濁します。トリパン ブルー色素排除を使用して実行可能なセルを数える。 注: 赤い血セル換散バッファーは削除中に出血した場合、赤色の血液細胞を削除する使用できます。</li>
	<li>37 ° C で 30 分間 220 rpm prewarmed 5 mL コラゲナーゼ溶液 15 mL の円錐管にパイエル板の孵化によって、パイエル板のリンパ球を分離します。</li>
	<li>15 の渦最大設定でフィルター s 消化組織及び上澄み 50 mL の円錐管に 70 μ m セル ストレーナー。優しく 3 mL シリンジのプランジャーを使用して残りの組織部分を切り離して、冷たい収穫メディアの 5 mL のセル ストレーナーを洗浄します。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 400 × g で遠心分離によってパイエル パッチ細胞をペレットし、1 mL 冷たい収穫メディアで細胞ペレットを再懸濁します。トリパン ブルー色素排除を使用して実行可能なセルを数える。 注: Peyer のパッチ分離いくつかの汚染の粘膜固有層リンパ球および上皮間リンパ球があります。</li>
</ol>4. 小腸上皮間リンパ球の分離
<ol><li>10 回チューブを反転し、解決、腸の部分をさせる、上澄みを離れて注ぐ冷たい収穫メディア 25 mL で 3 回小腸の部分を洗います。 注: 組織の部分はチューブの底に容易に解決すべき。そうでない場合あまりにも多くの腸間膜/脂肪が添付されているか、空気の泡を関連付けられている指標です。</li>
	<li>腸を含んでいる 50 mL の円錐管に prewarmed DTE 溶液 20 mL を追加し、攪拌棒を含む 50 mL のシリル エルレンマイヤー フラスコに転送します。37 ° C で攪拌し、220 rpm 20 分マグネチックスターラーで攪拌棒を保持し、組織とソリューションを 50 mL の円錐管に転送するフラスコの外に大きな磁石を使用します。</li>
	<li>渦で最大に設定 10 s. 転送清新しい 50 mL の円錐管に元管内組織部分を保つように注意しながら 70 μ m セル ストレーナー管。の上清を廃棄しないでください上清には、上皮間リンパ球が含まれています。4 ° C で 5 分間 400 × g で遠心分離によるペレット細胞10 mL の冷たい収穫メディアで細胞ペレットを再懸濁します、氷保存できます。</li>
	<li>腸を含んでいる 50 mL の円錐管に prewarmed DTE 溶液 20 mL を追加し、攪拌棒を含む 50 mL シリコーン エルレンマイヤー フラスコに戻って転送します。37 ° C で攪拌し、220 rpm 20 分マグネチックスターラーで攪拌棒を保持し、組織とソリューションを 50 mL の円錐管に転送するフラスコの外に大きな磁石を使用します。 注: DTE は上皮間リンパ球を豊かにする還元剤です。</li>
	<li>渦で最大に設定 10 s. 転送清 70 μ m セル ストレーナー (ステップ 4.3) から最初の DTE 治療上清から細胞を含む前のチューブにチューブ。 注: 残りの腸管部分、粘膜からリンパ球を分離する使用されます。品質管理: 組織の部分ことができます削除、組織学的に上皮細胞が存在し、基底膜が損なわれていないことを確認するチェックします。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 400 × g で上清を遠心分離によって細胞をペレット室温 (RT) で 44 %dg 溶液 8 mL の細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>転送 8 mL 44 %dg ソリューション/細胞懸濁液に 17 mm ø x 100 mm 14 mL ポリプロピレン製丸底チューブをスタイルします。RT 67 %dg 溶液 5 mL にアンダーレイします。ブレーキを使用せず室温で 20 分間 1600 × g で遠心分離機します。 注: チューブは細胞が管壁に付着するを防ぐためにウシ血清前処理した可能性があります。</li>
	<li>生菌が 44% から 67% 界面バンド (バフィー コート) を結成、死んだ細胞といくつかの上皮細胞は、グラデーションの上部に粘液状のフィルムと赤の血液細胞は、ペレットに注意してください。真空吸引によりインターフェイスの ~ 2 cm 以内へのグラデーションの最上位のレイヤーを削除します。パスツール ピペットを使用して、インターフェイスでバフィー コートを収穫し、40 mL 冷たい収穫メディアを含む 50 mL の円錐管にそれらを転送します。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 400 × g で遠心分離によるペレット細胞1 mL 冷たい収穫メディアで細胞ペレットを再懸濁します。トリパン ブルー色素排除を使用して実行可能なセルを数える。</li>
</ol>5. 小腸粘膜固有層リンパ球の分離
<ol><li>残りの腸の部分を含むフラスコに prewarmed EDTA 溶液の 25 mL を追加することによって腸の組織片から上皮細胞を削除します。37 ° C で 30 分のマグネチックスターラー 220 速回転撹拌フラスコは、攪拌棒を保持し、フラスコ内の腸の部分を維持しながら上澄みを慎重に廃棄フラスコの外に大きな磁石を使用します。 注: (i) EDTA はカルシウム依存性接合をターゲット、腸管上皮細胞の剥離を促進するカルシウムのキレート剤です。(ii)、上清は曇りであるべきし、自分のコレクションが必要な場合は、IEC を分離するために使用可能性があります。</li>
	<li>5.1 のステップを繰り返します。 注: 上清は少ない曇りこの培養に続くはずです。品質管理: 組織の部分ことができます削除、組織学的に腸上皮細胞を削除されている基底膜が損なわれていないことを確認するチェックします。上清からのサンプルも確認するフローサイトメトリーによって評価されるその白血球 (CD45+細胞) が存在しません。</li>
	<li>RT 収穫メディアの 50 mL をフラスコに追加します。磁石で簡単にかき混ぜます。腸管部分を解決し、慎重に上澄みを廃棄しなさい 注: この手順により、コラゲナーゼの消化力の前に EDTA の除去、EDTA は、コラゲナーゼの機能にとって重要なカルシウムをキレートでコラゲナーゼを不活性化します。</li>
	<li>フラスコに prewarmed コラゲナーゼ溶液 30 mL を加え、マグネチックスターラー 45 分に 37 ° C および 220 rpm で腸の部分をかき混ぜます。</li>
	<li>転送は、70 μ m セル ストレーナー フィルタ リングによって組織し、50 mL コニカル チューブに上清を消化しました。軽くフィルターをマッシュ アップする 3 mL シリンジのプランジャーを使用して残りの組織部分を切り離して考えます。10 ml の冷たい収穫メディアのフィルターを洗います。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 400 × g で遠心分離によるペレット細胞周囲温度 44 %dg 溶液 8 mL の細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>転送 8 mL 44 %dg ソリューション/細胞懸濁液に 17 mm ø x 100 mm 14 mL ポリプロピレン製丸底チューブをスタイルします。周囲温度 67 %dg 溶液 5 mL にアンダーレイします。常温、1600 × g 20 分でないブレーキとグラデーションを遠心します。</li>
	<li>真空吸引により上に脂肪の層を削除します。パスツール ピペットを使用して、インタ フェースと 40 mL 冷たい収穫メディアを含む 50 mL の円錐管に転送でバフィー コートを収穫します。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 400 × g で遠心分離によるペレット細胞1 mL 冷たい収穫メディアで細胞ペレットを再懸濁します。トリパン ブルー色素排除を使用して実行可能なセルを数える。</li>
</ol>

<ol><li>Hooper, L. V., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+adaptations+that+maintain+homeostasis+with+the+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota.</a> Nat Rev Immunol. 10 (3), 159-169 (2010).</li>
<li>Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminology%3A+nomenclature+of+mucosa-associated+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Terminology: nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue.</a> Mucosal Immunol. 1 (1), 31-37 (2008).</li>
<li>Lefrancois, L., Lycke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+small+intestinal+intraepithelial+lymphocytes%2C+Peyer%27s+patch%2C+and+lamina+propria+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse small intestinal intraepithelial lymphocytes, Peyer's patch, and lamina propria cells.</a> Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 19(2001).</li>
<li>Sheridan, B. S., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+lymphocytes+from+small+intestine+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse lymphocytes from small intestine tissues.</a> Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 19(2012).</li>
<li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+murine+small+intestine+leukocyte+isolation+for+global+immune+phenotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis.</a> J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).</li>
<li>Couter, C. J., Surana, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Flow+Cytometric+Characterization+of+Murine+Small+Intestinal+Lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes.</a> J Vis Exp. (111), (2016).</li>
<li>Koscso, B., Bogunovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+Purification+of+Mouse+Intestinal+Dendritic+Cell+and+Macrophage+Subsets+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis and Purification of Mouse Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets by Flow Cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. 114, 11-14 (2016).</li>
<li>Goodman, T., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+gamma-delta+T-cell+receptor+on+intestinal+CD8%2B+intraepithelial+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Expression of the gamma-delta T-cell receptor on intestinal CD8+ intraepithelial lymphocytes.</a> Nature. 333 (6176), 855-858 (1988).</li>
<li>Huleatt, J. W., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta2+integrins+and+ICAM-1+are+involved+in+establishment+of+the+intestinal+mucosal+T+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Beta2 integrins and ICAM-1 are involved in establishment of the intestinal mucosal T cell compartment.</a> Immunity. 5 (3), 263-273 (1996).</li>
<li>Sheridan, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gammadelta+T+cells+exhibit+multifunctional+and+protective+memory+in+intestinal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">gammadelta T cells exhibit multifunctional and protective memory in intestinal tissues.</a> Immunity. 39 (1), 184-195 (2013).</li>
<li>Sheridan, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+infection+drives+a+distinct+population+of+intestinal+resident+memory+CD8%28%2B%29+T+cells+with+enhanced+protective+function%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Oral infection drives a distinct population of intestinal resident memory CD8(+) T cells with enhanced protective function.</a> Immunity. 40 (5), 747-757 (2014).</li>
<li>Romagnoli, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+distinct+long-lived+memory+CD4+T+cells+in+intestinal+tissues+after+oral+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of distinct long-lived memory CD4 T cells in intestinal tissues after oral Listeria monocytogenes infection.</a> Mucosal Immunol. 10 (2), 520-530 (2017).</li>
<li>Houston, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lymph+nodes+draining+the+small+intestine+and+colon+are+anatomically+separate+and+immunologically+distinct%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct.</a> Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).</li>
<li>Lorenz, R. G., Newberry, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+lymphoid+follicles+can+function+as+sites+for+induction+of+mucosal+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Isolated lymphoid follicles can function as sites for induction of mucosal immune responses.</a> Ann N Y Acad Sci. 1029, 44-57 (2004).</li>
<li>Kim, S. K., Reed, D. S., Heath, W. R., Carbone, F., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+and+migration+of+CD8+T+cells+in+the+intestinal+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activation and migration of CD8 T cells in the intestinal mucosa.</a> J Immunol. 159 (9), 4295-4306 (1997).</li>
<li>Huleatt, J. W., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-driven+induction+of+CD11c+on+intestinal+intraepithelial+lymphocytes+and+CD8%2B+T+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen-driven induction of CD11c on intestinal intraepithelial lymphocytes and CD8+ T cells in vivo.</a> J Immunol. 154 (11), 5684-5693 (1995).</li>
<li>Van Damme, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+agents+and+enzymes+used+for+the+extraction+of+gut+lymphocytes+influence+flow+cytometric+detection+of+T+cell+surface+markers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers.</a> J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

誘導 (MLN と PP)、腸内から粘膜のリンパ球の隔離のため詳細なプロトコルを提示とエフェクター (LP、IEL コンパートメント) サイト。プロトコルが (時間) の入力と出力 (生存率と収量) の生産性と成果を最大化するバランスを開発しました。プロトコルはまた LP と IEL のコンパートメント間の最小限のコンパートメント クロスコンタミネーションを保証します。
マウス小腸から免疫細胞を分離するためのいくつかのプロトコルが公開された3,をされている4,5,6,7。これらのプロトコルのほとんどは LP から免疫細胞を分離することに焦点を当てます。腸上皮は、直接外部環境にさらされるが、リンパ球のユニークな組成で構成されています LP から明確なコンパートメ...

胃腸 (GI) 地域には多くのひだや突起内部の体と外部環境を分離する最大のインターフェイスを表す。腸管の免疫系は、消化管のバリア機能を維持する上で重要な役割を果たしています。それは常に食物抗原、共生細菌と病原微生物にさらされます。そのため、それは急速に急性胃腸炎起因微生物1効果的な免疫応答を生成する能力を維持しながらの食物抗原と共生細菌への耐性に残らなければなりません。腸管免疫系誘導サイト、ナイーブ リンパ球は抗原提示細胞が腸の粘膜から抗原を運ぶがアクティブ化されている、およびエフェクター サイト、活性化リンパ球出す特定に解剖学的分類できます。エフェクター機能2。誘導サイトは、調査専門の M 細胞と地域の排水腸間膜リンパ節 (MLN) の作用により直接腸管パイエル板 (PP) のリンパ組織構造を構成します。エフェクター サイトは基底膜と小腸上皮、上皮間リンパ球 (IEL) を含む基底膜上にある単一の細胞層の下の結合組織である粘膜 (LP) から成っています。リンパ球が、感染症や癌に対する保護を仲介し、炎症性疾患の免疫病理学にまた貢献するかもしれない適応免疫の主要なプレーヤーです。それは重要でありこれらの明瞭なリンパ球の研究に関連性の高いより良い粘膜局所理解の誘導とエフェクター機能。
腸内免疫事象を探る捜査官の数を加速するいると、これらのコンパートメントからのリンパ球の隔離のための比較的シンプルで統一されたプロトコルが必要です。いくつかの研究グループがマウス小さい腸内コンパートメント3,4,5,6,7 から免疫細胞を分離することにいくつかの類似のプロセスを共有プロトコルを公開しています。.ただし、個々 のプロトコルの焦点に応じてそれらの間でいくつかの技術的な違いがあります。たとえば、LP から免疫細胞を孤立させることにフォーカスを 1 つのプロトコルは細胞生存率、細胞表面マーカーの発現と分離免疫細胞5の構成に関するさまざまな酵素の消化力の影響を調べます。他のプロトコルは、密度遠心分離6なくリンパ球の隔離のための迅速かつ再現性のある方法を強調表示します。最後に、特定のプロトコルは、小腸7の異なったティッシュ層から単核食細胞を分離する目的も存在します。ここでは、小腸の MLN PP LP、IEL のコンパートメントからリンパ球集団の連続分離ができる再現性の高いプロトコルが表示されます。
我々 は主無料その他の腸の仕切りからの汚染物質の LP と IEL のコンパートメントから高純度の人口を隔離するのに焦点を当てます。これは広くプロトコル生成に許容可能な時間の制約4,8,9,10、11,12内で最大限に純粋な実行可能なリンパ球の高収率を使用しました。このプロトコルはまたこれらの異なるコンパートメントにリンパ球を勉強する善意の機会をできるように最小限の交差コンパートメント汚染と LP と IEL コンパートメントからのリンパ球の分離を保証します。分離されたリンパ球は、フローサイトメトリーによる解析や機能解析のようなそれ以上の操作を受けることができます。このプロトコルが正常にリンパ球の分離にマウス小腸と大腸から中に適用されたリステリア菌、サルモネラ、エルシニア ペスチスなど細菌感染症感染症や化学物質、病原体誘発大腸炎などの炎症性条件。このプロトコルは、樹状細胞、マクロファージ、好中球と単球マウス小腸結腸からなどの自然免疫系細胞を分離するも使用できます。

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン&nbsp;</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G3126-100G</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Life Technologies</td><td>15710-072</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>21870-076</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Life Technologies</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>10x ハンクス平衡塩溶液</td><td>Sigma-aldrich</td><td>H4641-500ML</td><td></td></tr><tr><td>1,4-ジチオエリスリトール</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D9680-5G</td><td></td></tr><tr><td>0.5M EDTA, pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム六水和物</td><td>Sigma-aldrich</td><td>21108-500G</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M2670-100G</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ I 型</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>17100-017</td><td></td></tr><tr><td>DG グラジエントストック溶液 (Percoll)&nbsp;</td><td>GEヘルスケア</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>赤血球溶解バッファー</td><td>バイオレジェンド</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>70-&micro;mセルストレーナー&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>14mLポリプロピレン丸底チューブ</td>コー<td>ニング</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>三角フラスコ&nbsp;</td><td>Kimble</td><td>26500R-50mL</td><td></td></tr><tr><td>マグネチックスターラー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>50094596</td><td></td></tr><tr><td>スターバー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-512-148</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス小腸管免疫系からリンパ球を分離すること

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

腸管の免疫系は、急性胃腸炎起因する効果的な免疫応答をマウントしながらレスポンス食物抗原と共生細菌の耐性を生成することによって、腸管のバリア機能を維持する上で重要な役割を果たしています。微生物。さらに、ローカルの腸管免疫では、遠いと全身の免疫力の深遠な影響が明らかになった。そのため、腸内の免疫応答を誘導する方法と、免疫応答の結果を研究することが重要です。腸管関連リンパ組織パイエルとドレインの腸間膜リンパ節のような小腸誘導サイトと粘膜のようなエフェクター サイトからのリンパ球の隔離のための詳しいプロトコルの説明ここと腸上皮。この手法は、最適な純度と生存率と許容可能な時間制約の中での最低限のコンパートメント クロスコンタミネーション多数小さい腸組織からのリンパ球の分離を保証します。リンパ球および小腸組織から他の免疫細胞を分離する技術力により、消化器感染症、癌、炎症性疾患に対する免疫応答の理解。

プロトコルの概略図が描かれている (図 1)。腸粘膜誘導とエフェクターのサイト内にあるリンパ球がはっきりと整理されています。Peyer のパッチ (PP) および腸間膜リンパ節 (MLN) を含むよく組織化された T 細胞領域と B 細胞濾胞リンパ腸上皮に分布よりびまん性リンパ球が含まれています。粘膜 (LP) には、分散びまん性リンパ球とリンパ球分離リンパ濾胞 (ILF) と cryptopatches のようなリンパ組織内の両方が含まれています。各腸内免疫のコンパートメントはまたリンパ球サブセット (図 2) のユニークな組成に代表されます。MLN は主に PP リンパ球が B 細胞 (約 80%) 主 αβ T 細胞 (約 70%) から成る。LP リンパ球構成は主ひずみ依存 αβ T 細胞と B 細胞の主成分です。その他の腸の仕切りとは異なる、上皮に存在するリンパ球は、主に γδ T 細胞 (~ 60%) と αβ T 細胞 B セルは基本的にい...

腸管関連リンパ組織パイエル排水腸間膜リンパ節など誘導サイトと粘膜を含むエフェクター サイトからのリンパ球の隔離のための詳しいプロトコルについて述べると、小さな腸管免疫系の腸上皮は。

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

このプロトコルの全体的な目標は、パイエル板や腸間膜リンパ節などの腸内誘導部位からリンパ球を分離し、固有層や上皮などのエフェクター部位を分離することです。この方法は、胃腸感染症、がん、炎症性疾患に対する免疫応答の理解など、粘膜免疫学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、小腸の異なるコンパートメントから高度に精製された生存可能なリンパ球を、最小限のクロスコンパートメント汚染で単離できることです。一般に、この方法に不慣れな個人は、腸間膜リンパ節とパイエル板を特定して分離し、速度と精度のバランスを取り、最適な収量を得るのが難しいため、苦労するでしょう。プロトコールを開始するには、以前に麻酔をかけたマウスを背中に置き、70%エタノールをスプレーします。ハサミを使用して正中線を切開し、皮膚と腹壁を開いて腹腔を露出させます。次に、盲腸の位置を特定し、鉗子を使用して盲腸をそっと引き下げます。鉗子を使用して小腸を慎重に右に動かし、結腸と整列している腸間膜リンパ節またはMLN鎖全体を露出させます。盲腸に最も近い位置にあるチェーンの一番下のノードを特定します。1セットの鉗子を使用して周囲の腸間膜脂肪をつかみ、別の鉗子セットでリンパ節の周りの脂肪をピンセットでつまむことにより、MLNチェーンを下から上にゆっくりと動かします。次に、収穫培地でタオルを湿らせ、MLNチェーンをペーパータオルの上に置きます。ペーパータオルの上でチェーンを転がし、2セットの鉗子で脂肪を引き抜いて腸間膜脂肪を取り除きます。MLN をコールドハーベスト培地に入れて、後の分離手順に使用します。はさみで、幽門括約筋の下と盲腸の上の小腸を切ります。1セットの鉗子を使用して腸を回腸から十二指腸までゆっくりと引き出し、別のセットの鉗子を使用して付着した腸間膜脂肪を取り除きます。収穫培地で湿らせたペーパータオルの上に腸を置き、2セットの鉗子で残っている腸間膜脂肪をからかいます。これらのステップ全体を通して腸を湿らせておくには、定期的に収穫培地を塗布します。パイエルのパッチを湾曲したハサミで腸から取り除いて収集します。小腸から5-11個のパイエルパッチを収集します。パイエルパッチをコールドハーベスト培地に入れて、後の単離ステップに使用します。鉗子の平らな面を使用し、十二指腸から回腸に向かってゆっくりとスライドさせて、糞便内容物と粘液を排出します。この手順を1回繰り返して、ほとんどの粘液を取り除きます。一点に鈍い端がある細いハサミを使用し、鈍い端を腸に挿入し、十二指腸から回腸まで縦方向に開いた腸を切り開きます。開いた腸を横方向に2センチメートルに切ります。腸片を50ミリリットルの円錐管に入れ、25ミリリットルのコールドハーベスト培地を入れて、後の分離ステップに備えます。MLNからリンパ球を分離し、3ミリリットルのシリンジのプランジャーを使用して70マイクロメートルのセルストレーナーでリンパ球を穏やかに解離します。セルストレーナーを5ミリリットルのコールドハーベスト培地で洗浄します。MLN細胞を4°Cで5分間、重力400倍で遠心分離することにより、MLN細胞をペレット化します。次に、細胞ペレットを1ミリリットルのコールドハーベスト培地に再懸濁します。チューブを10回反転させることにより、25ミリリットルのコールドハーベスト培地で小腸片を3回洗浄します。腸の部分が落ち着くのを待って、上清を注ぎます。次に、腸片を含む50ミリリットルの円錐管に20ミリリットルの予熱したジチオエリスリトールまたはDTE溶液を加え、内容物を攪拌棒付きの50ミリリットルのシリコン処理三角フラスコに移します。フラスコの外側にある大きな磁石を使用して攪拌子を保持し、組織と溶液を50ミリリットルの円錐管に戻します。次に、チューブを最大設定で10秒間ボルテックスします。上清を70マイクロメートルのセルストレーナーを介して新しい50ミリリットルの円錐管に移し、組織片を元のチューブに保持するように注意します。細胞をペレット化します。細胞ペレットを10ミリリットルのコールドハーベスト培地に再懸濁し、氷上に保存します。腸片が入った50ミリリットルの円錐管に20ミリリットルの予熱したDTE溶液を加え、攪拌棒が入った50ミリリットルのシリコン処理三角フラスコに戻します。フラスコの外側にある大きな磁石を使用して攪拌子を保持し、組織と溶液を50ミリリットルの円錐管に戻します。チューブを最大設定で10秒間ボルテックスします。上清を70μmのセルストレーナーを介して、最初のDTE処理の上清からの細胞を含むチューブに移し、細胞を遠心分離します。細胞ペレットを8ミリリットルの44%密度グラジエント溶液またはDG溶液に室温で再懸濁します。8ミリリットルの44%DG溶液と細胞懸濁液を17ミリメートル×100ミリメートルの14ミリリットルポリプロピレン丸底チューブに移します。セルを5ミリリットルのRT 67%DG溶液で下敷きます。ブレーキを使用せずに、RTで1、600倍の重力で25分間遠心分離します。生細胞は、44%および67%の界面でバフィーコートを形成します。真空吸引により上部の脂肪層を取り除きます。パスツールピペットを使用して、界面でバフィーコートを収穫し、40ミリリットルのコールドハーベスト培地を含む50ミリリットルの円錐管に移します。4°Cで5分間、重力400倍で遠心分離して細胞をペレット化し、細胞ペレットを1ミリリットルのコールドハーベスト培地に再懸濁します。残りの腸片に25ミリリットルの予熱EDTA溶液を加えて腸組織片から上皮細胞を取り出し、内容物を50ミリリットルのシリコン化三角フラスコに移し、攪拌棒で攪拌します。攪拌棒を持ち、腸の部分をフラスコに入れたまま、上清を慎重に捨てます。上皮細胞の除去ステップをもう一度繰り返します。次に、50ミリリットルの室温の収穫培地を加え、中身を磁石で短時間攪拌します。次に、腸の破片が落ち着くのを待って、上清を慎重に捨てます。30ミリリットルの予熱したコラゲナーゼ溶液を加え、腸片を攪拌します。撹拌後、消化された組織と上清を70μmのセルストレーナーを介して50ミリリットルの円錐管に移します。3ミリリットルのシリンジのプランジャーを使用してフィルターをマッシュスルーすることにより、残りの組織片を穏やかに解離します。フィルターを10ミリリットルのコールドハーベスト培地で洗浄し、細胞をペレット化します。紡糸後、セルペレットを8ミリリットルの周囲温度44%DG溶液に再懸濁します。8ミリリットルの44%DG溶液セル懸濁液を、70ミリメートル×100ミリメートルのポリプロピレン丸底チューブに移します。周囲温度67%DG溶液の5ミリリットルで下敷きし、次に勾配を遠心分離します。真空吸引により上部の脂肪層を取り除きます。パスツールピペットを使用して、界面でバフィーコートを収穫し、40ミリリットルのコールドハーベスト培地を含む50ミリリットルの円錐管に移します。最後に、細胞ペレットを1ミリリットルのコールドハーベスト培地に再懸濁します。各腸の免疫コンパートメントは、リンパ球サブセットのユニークな組成によって代表されます。MLNは主にアルファベータT細胞で構成されていますが、PPリンパ球は主にB細胞です。LPリンパ球の組成物は、主にアルファベータT細胞とB細胞で構成されています。IELは主にガンマデルタT細胞とアルファベータT細胞であり、基本的にB細胞はありません。LPおよびIELコンパートメント内のCD8α陽性αβT細胞は、CD8αホモ二量体またはCD8αβヘテロ二量体を発現したが、誘導部位CD8α陽性αββT細胞は、主にCD8αβヘテロ二量体を発現した。IELコンパートメントのガンマデルタT細胞の大部分はCD8アルファを発現していましたが、MLNで見つかったガンマデルタT細胞はCD8アルファを欠いています。この手順を試みる際には、組織分離ステップ中に十分な時間と注意を払って、腸コンパートメント間の汚染を制限することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、単離されたリンパ球をex vivo刺激、フローサイトメトリー、およびその他の手法にさらして、さらなる表現型および機能解析を行うことができます。

isolating-lymphocytes-from-the-mouse-small-intestinal-immune-system

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ミルテニーMACのキットを用いてリンパ球の分離は、全体のリンパ組織のホモジネートから細胞を浄化するために信頼性の高い方法です。国内でのみ有効のシステムを使用して精製した細胞は通常、≥96パーセント純粋です。ここで、我々は、CD4 +...

CD4 +ミルテニーMACS精製を使用してマウスのリンパ節からT細胞の分離

本稿では、マウス腸管樹状細胞（DCs）およびマクロファージを迅速に単離するための手法を詳細に説明します。腸管DCsおよびマクロファージの表現型解析には多色フローサイトメトリー分析を用い、機能研究のための高純度な細胞集団を得るには、磁気ビーズによる濃縮後、セルソート（細胞分取）を行います。...

マウスの腸からの樹状細胞およびマクロファージの単離とキャラクタリゼーション

マウス生殖管からリンパ球を分離するための効率的な方法が記載されている。この方法では、効率的な分離を可能にするために酵素消化し、パーコール勾配分離を利用しています。この手法は、他の種で使用するためにもに適応可能である...

マウス生殖管粘膜からのリンパ球の単離

このビデオでは、採取したマウスのパイエルパッチからリンパ球が分離される様子を実演します。単離されたリンパ球は、さらなる分析に使用できます。...

マウスパイエルパッチからのリンパ球の単離

パイエル板の細胞の特定の亜集団（PPS）、腸管関連リンパ組織の主要な誘導部位の免疫学的機能を理解する上で関心が高まっている。ここでは、フローサイトメトリー解析と免疫染色のためのPPの凍結切片のための単一細胞調製物を調製するためのPPのパラレルプロトコルの概要を説明します。...

マウスのパイエル板のリンパ球や樹状細胞を単離し、免疫染色

他のT細胞サブセットとは異なるエフェクター機能を持つ、Th17細胞は、中央炎症性自己免疫に関与している。このインビトロのTh17分化プロトコルは、ナイーブCD4 + Tリンパ球は、Th17細胞に分化することができ、さらに自己免疫および宿主応答におけるそれらの役割を検討するかどうかを決定するための手段を提供する。...

離とナイーブCD4 Tリンパ球のTh17分化

これらの細胞がさまざまな腸および全身の疾患において重要な役割を果たすという認識が高まっているため、腸リンパ球の定量的特性評価への関心が高まっています。このプロトコルでは、その後のフローサイトメトリー特性評価のために、異なる小腸コンパートメントから単一細胞集団を分離する方法について説明します。...

マウスの小腸リンパ球の単離およびフローサイトメトリーキャラクタリゼーション

リンパ球は、適応免疫応答の主要なプレーヤーです。ここでは、in vitroおよびin...

単離とマウスリンパ球の活性化

本研究で提案する小説とリンパ球の隔離のための効果的なプロトコル卵胞 T の流れフローサイトメトリーによる調査と同様に、体内と体外の機能アッセイにその後使用できますパイエル パッチ (PPs) からヘルパーおよび胚中心 B...

体液性免疫のキープレーヤーの解明: 高度なマウス Peyer のパッチからのリンパ球の隔離のプロトコルを最適化

このプロトコルは、マウス小腸オルガノイドの樹立、マウス小腸固有層からの1型先天性リンパ系細胞の単離、および腸上皮細胞と1型先天性リンパ系細胞との間の双方向相互作用を研究するための両方の細胞型間の3次元(3D)共培養を確立するための詳細な指示を提供する。...

マウス小腸上皮オルガノイドと先天性リンパ球細胞との共培養

IL-9発現TおよびILC2細胞は、 N. brasiliensis 感染中に誘導されますが、その特性評価は、その低頻度および異なる動態のために、感染した腸ではほとんど見過ごされてきました。このプロトコルは、異なる標的臓器からのこれらの細胞の単離と、異なる感染段階でのフローサイトメトリー による...

ニッポストロンギルス・ブラジリエンシス感染モデルにおけるIL-9産生リンパ系細胞研究戦略

学ぶマウス小腸からPeyer's patches、腸間膜リンパ節、固有層、上皮などの誘導部位と効果部位からリンパ球を分離する方法。高純度で生存率の高い細胞を得て、消化管感染症や炎症性疾患の免疫応答研究に貢献します。

マウス小腸管免疫系からリンパ球を分離すること

さらに動画を探す