Name: 離とマウスとヒトの肺胞マクロファージの体外培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 学ぶマウスとヒトの肺胞マクロファージの分離と体外培養法。気管支肺胞洗浄液と肺組織から高純度の細胞を取得し、呼吸器免疫学の研究に応用できます。

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原稿を編集の支援ありがとうクレア プレンダーガスト。DKN はサポートされて研究でフリン財団から (#2095) を付与し、TM は国立衛生研究所 (R01HL056643 と R01HL092514) からの補助金によってサポートされています。DKN 手法を開発、研究をデザイン、そして書いた原稿;動物実験と臨床サンプル調達支援 OMSB 支援フローサイトメトリー解析・細胞のソーティング。TM は研究を監督し、原稿の見直し。

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) セントジョセフ病院と医療センター制度レビュー委員会 (IRB) によって承認されています。
1. マウスの気管支肺胞洗浄 (BAL) 液から AMs の分離
<ol><li>ケタミン (87.5 mg/kg 体重) とキシラジン (12.5 mg/kg 体重) 腹腔内注射を介してカクテル 8 週齢 c57bl/6 マウスを anaesthetize します。マウスに達する反射の損失や筋肉の弛緩で外科麻酔を進みます。</li>
	<li>郭清の面に腹側を上にマウスを配置します。脱水症状を防ぐために、滅菌アルコール準備を 70% イソプロパノール消毒すると飽和するパッドとマウスの腹側表面全体を拭く目に獣医眼科用軟膏を適用します。</li>
	<li>拘束された 4 本の脚を持つマウスをマウントします。</li>
	<li>優しく顕微解剖ツールで腹腔内を開きます。すべての内臓の損傷や張り出した組織を作成しなくてもできるだけ同様に多くの領域を開くには注意が必要があります。</li>
	<li>優しくゆっくりと縦隔から胸郭を切開して胸腔内を開きます。理想的には、肋骨は側に側から摘出することができます。胸腔内を開くときの肺の胸膜を傷つけないように十分な注意が必要があります。</li>
	<li>下大静脈を探し、マウスを出血する切開をおきます。血液を吸収する吸収性綿パッドを使用します。</li>
	<li>循環血液細胞をフラッシュする (25 G 針、10 mL の注射器を使用して) 右心室に 10 mL の冷たいリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を挿入します。吸収性綿パッドとは、血液の流れを吸収します。完全に灌流、肺湯通し表示され、洗浄の準備ができているし。</li>
	<li>優しく皮膚を開いてカットし、気道を公開する首の筋肉します。慎重に気管を損傷することがなく隣接する筋肉、軟骨、脂肪組織を切除します。</li>
	<li>小さな切開 (< 2 mm) 気管喉頭の後方に。この切開は気管、喉頭にまだ接続されている間にカテーテルを挿入するだけで十分なはずです。針なし 1 インチ 22 G カテーテルを肺に向かって気管に挿入します。シルク編み縫合糸でカテーテルを固定 (4-0; 非吸収性) 正方形の結び目を持つ。 注: カテーテルが整う必要がマウスのサイズに基づいて。 ある非常に短期または長期のカテーテルは、リークおよび/または洗浄中に気道を引き裂く傾向があります。カテーテルの長さはこのようなする必要があるときに完全に挿入される先端まま気管内も、主気管支に到達します。</li>
	<li>冷たいバル バッファー (Ca2 +と Mg2 +無料 PBS + 1 mM EDTA エチレンジアミン四酢酸) カテーテルでいっぱい 1 mL 注射器を接続し、ゆっくりと肺の中にバッファーを植え付けます。これは肺を膨らませます。5 秒間、カテーテルに接続されている注射器を維持し、軽くピストンを引いて、洗浄液を吸引します。これは肺に空気を抜きます。氷上に置いた 15 mL の円錐管に流体を収集します。</li>
	<li>さらに 9 回のステップは 1.10 を繰り返し、洗浄液をプールします。肺の容量を超えるし、その破裂につながる可能性がありますので、フラッシュあたり 1 mL のバッファーを超えないようにします。</li>
	<li>IACUC 承認プロトコルによって CO2の過剰摂取とマウスを安楽死させます。</li>
	<li>10 分の 4 ° C で 250 x g で 10 mL BAL 液を遠心分離機します。細胞ペレットには、バルのセルが含まれています。 注意:ペレットは非常に小さく、上清を吸引するときので注意します。</li>
	<li>流れ/並べ替えバッファー (PBS + 2% 不活化熱牛胎児血清 (FBS) + 1 mM EDTA 25 mM N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic 酸 (HEPES)) の 100 μ L の BAL 細胞を再懸濁します。</li>
	<li>マウス Fc ブロックの追加により、Fc 受容体に非特異的な抗体の結合をブロック (2.4G2、10 μ g/mL のクローン) 氷の上 20 分間インキュベートし、。</li>
	<li>抗体と一緒にマイナス 1 (FMO) 蛍光染色を実行し、単一染色コントロール11,25。BAL を評価セル アナライザーによって細胞が適切な分析ソフトウェア単一セル フローサイトメトリー分析による続く (材料の表を参照してください) (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>AMs を分離蛍光活性化セルによる選別機 (材料の表を参照してください) 直接 1 mL マウスに時に培地の培養または生体内でAMs は、携帯転送。また、1 mL の溶解バッファーに並べ替え AMs は 10 μ L/mL β-メルカプトエタノール RNA の抽出で補完 (材料の表を参照してください)。</li>
</ol>2. AMs マウス肺、単一細胞懸濁液からの分離
<ol><li>ケタミン (87.5 mg/kg 体重) とキシラジン (12.5 mg/kg 体重) 腹腔内注射を介してカクテル 8 週齢 c57bl/6 マウスを anaesthetize します。マウスに達する反射の損失や筋肉の弛緩で外科麻酔を進みます。</li>
	<li>郭清の面に腹側を上にマウスを配置します。脱水症状を防ぐために、70% イソプロパノール消毒すると飽和滅菌アルコール パッドとマウスの腹側表面全体を拭く目に獣医眼科用軟膏を適用します。</li>
	<li>拘束された 4 本の脚を持つマウスをマウントします。</li>
	<li>優しく顕微解剖ツールで腹腔内を開きます。すべての内臓の損傷や張り出した組織を作成しなくてもできるだけ同様に多くの領域を開くには注意が必要があります。</li>
	<li>優しくゆっくりと縦隔から胸郭を切開して胸腔内を開きます。理想的には、肋骨は側に側から摘出することができます。胸腔内を開くときの肺の胸膜を傷つけないように十分な注意が必要があります。</li>
	<li>下大静脈を探し、マウスを出血する切開をおきます。血液を吸収する吸収性綿パッドを使用します。</li>
	<li>循環血液細胞をフラッシュする (25 G 針、10 mL の注射器を使用して) 右心室に 10 mL の氷冷 PBS を挿入します。完全に灌流、肺湯通し表示され、収穫の準備ができています。</li>
	<li>風邪の 5 mL と 15 mL の円錐管に気管、血管、靭帯を切断して肺を解剖ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM)。次のステップまで氷の上それを維持します。</li>
	<li>IACUC 承認プロトコルによって CO2の過剰摂取とマウスを安楽死させます。</li>
	<li>3 ml DMEM 無菌、パイロジェン フリーの 60 mm ディッシュに灌流の肺を転送します。鉗子を解剖の助けを借りて、航空および他のハードの非肺組織材料をいじめる存在する場合。肺組織にメスをミンチ < 1 mm サイズ。</li>
	<li>300 μ g/mL Liberase TL と 5 U/mL 追加 DNase I、ピペッティングで混ぜるし、インキュベーターの 37 ° C で 25 分間インキュベートします。軽く 10 分後ピペッティングにより一度混ぜます。</li>
	<li>50 mL コニカル チューブにインストールされている 100 μ m セル ストレーナーを解離肺を通過します。1 mL 注射器からプランジャーの後ろを使用すると、フィルターの細胞塊をマッシュ アップします。20 mL 洗浄バッファーが付いているフィルターを洗う (PBS + 2% 熱不活化の FBS + 2 ミリメートルの EDTA)。</li>
	<li>4 ° C で 500 × g で 5 分間遠心します。上澄みを廃棄し、20 mL 洗浄バッファーで細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>手順 2.12 と二度、2.13 たびにフィルターとチューブを変更するを繰り返します。5 分以上の洗浄バッファーのフィルターを予浸午前収量が増加します。単一細胞懸濁液を準備するには、追加し 100 μ L 細胞ペレットにバッファーの流れ/並べ替え。</li>
	<li>マウス Fc ブロックの追加により、Fc 受容体に非特異的な抗体の結合をブロック (2.4G2、10 μ g/mL のクローン) 氷の上 20 分間インキュベートし、。</li>
	<li>FMO と単一染色コントロール11,25染色抗体を実行します。肺を評価セル アナライザーによる細胞単一セル フローサイトメトリーによる解析ソフトウェア後 (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>セルの並べ替えで並べ替え AMs (材料の表を参照してください) 直接 1 mL マウスに時に培養培地の培養または生体内でAMs は、携帯転送。また、1 mL の 10 μ L/mL β-メルカプトエタノール RNA 抽出のための補足の換散バッファーに AMs を並べ替えます。</li>
</ol>3. 人間の BAL 液から AMs の分離
<ol><li>4 ° C で研究室に診療所から人間の BAL 液の送迎を手配します。</li>
	<li>BAL 液 (10-50 mL) を 4 ° C で 250 x g で 10 分間遠心します。細胞ペレットには、BAL 細胞11が含まれています。</li>
	<li>20 mL 洗浄バッファーの餌を洗浄 (PBS + 2% 熱不活化の FBS + 2 ミリメートルの EDTA)、4 ° C で 250 x g で 10 分間遠心します。</li>
	<li>フロー/並べ替えバッファーの 100 μ L、BAL 細胞を再懸濁します (PBS + 2% 熱不活化 FBS + 1 mM EDTA 25 mM HEPES)。</li>
	<li>人間の Fc ブロック (クローン Fc1.3070、25 μ g/mL) を追加し、氷で 20 分間インキュベート Fc 受容体に非特異的な抗体の結合をブロックします。</li>
	<li>FMO と単一染色コントロール11,24を汚す抗体を実行します。BAL を評価セル アナライザーによる細胞単一セル フローサイトメトリーによる解析ソフトウェア後 (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>セルソーターによる並べ替え AMs (材料の表を参照してください) 直接培地 1 mL 人間午前に 1 mL の溶解バッファーを添加した 10 μ L/mL β-メルカプトエタノール。</li>
</ol>4. 文化体外AMs の
<ol><li>次のセルの並べ替え、4 ° C 10 分で 250 × g で遠心分離によってセルを収穫します。</li>
	<li>1 mL人間午前培[ロズウェル パーク記念研究所中 (RPMI) 10% を添加した 1640 FBS、20 %l-929 文化 (マクロファージコロニー刺激因子 (M-CSF)、100 U/mL 最終濃度ソース) として上清で人間の AMs を再懸濁します1 mM ピルビン酸ナトリウム、N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic 酸 (HEPES) 10 mM、1 x ペニシリン/ストレプトマイシン (省略可能)]。同様に、1 mLマウス午前培[10 %fbs、20 %l-929 培養上清 (100 U/mL 最終濃度 M CSF ソース) として 1 mM ピルビン酸ナトリウム、10 mM HEPES、1 x ペニシリン/ストレプトマイシン (オプションと DMEM で AMs マウスを再懸濁します)].</li>
	<li>細胞カウンターによって生菌トリパン ブルーを除くを列挙し、1 x 106/mL で実行可能な細胞濃度を調整します。 注: 理想的を 5 × 105 AMs から分離でき、8-10 週古い C57BL/6 の雄マウスから収集した BAL 液。マウス肺ダイジェストから午前の収穫は可変してマウス BAL 液のそれよりもやや少ない可能性があります。人間の BAL 液から午前の収穫は、BAL 液、洗浄、および患者の臨床状態で使用されている生理食塩水の総容積の量によって異なります。</li>
	<li>チャンバー スライド、培養皿または培養フラスコ内のセルの種子収量と実験の必要性に基づき。理想的には、T25 培養フラスコに 10 mL の培地で 1 × 105/mL で AMs をシードします。</li>
	<li>セル 5% CO2雰囲気の 37 ° C の加湿インキュベーターで孵化させなさい。 注: AMs 付着性のセルとして成長し、非常にゆっくりと成長 (倍加時間 > 7 日間)。</li>
	<li>播種後 24 時間で AMs すべき付着と培地の穏やかな変化ではデタッチされません。端から端まで吸引してメディアを削除し、37 ° C に加温新鮮な培地で補充します。 注: セルは、午前生理学または刺激の効果を評価するために今すぐ使用できます。AMs チャンバー スライドで成長に適切な抗体便利に汚すことができるし、可視化に最適です。流れフローサイトメトリー評価、AMs はソリューションを解離非酵素的セル孵化によって収穫されています。</li>
	<li>培養液を吸引し、文化面 (T25 フラスコあたり約 2 mL) をカバーし、37 ° C で 5 ~ 10 分間インキュベートする十分な分離液を追加します。削りが不要になると機械的に細胞をこすり取る際に勧めはしませんが。側面を軽く 1-2 mL の流れ/並べ替えバッファーを追加して、優しく上下に付着性のセルの大部分をデタッチするピペットします。</li>
	<li>RNA 研究の換散バッファーを追加して培養皿に直接細胞を溶解します。</li>
</ol>

<ol><li>Westphalen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sessile+alveolar+macrophages+communicate+with+alveolar+epithelium+to+modulate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity.</a> Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).</li>
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<li>Sekine, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+passenger+leukocytes+in+allograft+rejection%3A+effect+of+depletion+of+donor+alveolar+macrophages+on+the+local+production+of+TNF-alpha%2C+T+helper+1%2FT+helper+2+cytokines%2C+IgG+subclasses%2C+and+pathology+in+a+rat+model+of+lung+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of passenger leukocytes in allograft rejection: effect of depletion of donor alveolar macrophages on the local production of TNF-alpha, T helper 1/T helper 2 cytokines, IgG subclasses, and pathology in a rat model of lung transplantation.</a> J Immunol. 159 (8), 4084-4093 (1997).</li>
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著者の利害の衝突を宣言するあります。

AMs は、肺に生じる出生時と26全体の寿命を永続的な作成時間の長いリビング肺居住者マクロファージです。肺生理学7と病理12とその潜在的な肺の免疫24の予測における役割を認識しています。AMs 肺11,27で長期的な存在感があるので、活性化と免疫11,24、その他の慢性的な炎症と線維化肺内に、ロールの進行に関与しているので病気は、評価する必要があります。歴史的に、AMs は混乱のアイデンティティを持っていたし、された誤認しやすい。最近採用された表現型マーカー25,28, 人間を区別し、他の肺の食細胞 ...

肺微小環境は精巧な空気の導管と血管を一意に複雑な生態系です。吸入空気は、血液-空気ガス交換が発生する、肺胞に達する前に気管と気管支、細気管支の多数の枝を通してを移動します。大気と直接相互作用は、呼吸の表面は浮遊粒子状物質や汚染物質の可能性のある有害な効果から保護を必要とします。物理的、化学的、免疫学的障壁の数は、肺を保護します。特に、食細胞呼吸面での展開は、重要な最初の行の防衛システムを提供しています。肺胞マクロファージ (AMs) 肺居住者食細胞の一種であるし、彼らは肺マクロファージ プールの大半を構成します。その名の通り、AMs は主に肺胞腔に局在しているし、常に周囲の雰囲気をサンプルし、歯槽の上皮1通信付着細胞として発生します。肺胞腔内の食細胞の 95% 以上は、定常状態の肺、AMs2、その組成は、炎症、感染症、または汚染物質への慢性露出により変わる可能性があります。
AMs は、全身の重要性のおよび/または肺に対してローカルにすることができる機能の広い範囲に参加します。例えば、AMs は肺の最適な機能と開発に不可欠です。免疫の監視;侵入する病原体と吸入粒子3,4,5,6,7細胞の残骸のクリアランス。AMs の対象の枯渇は、呼吸器系ウイルスや細菌4,8のクリアランスを阻害する知られています。食細胞と肺の恒常性の最初の行の擁護者としての役割のほか AMs 知られている T を引き出すことで抗原提示細胞細胞免疫9、として機能する鼻腔内ワクチン10の効果を増強し、肺移植11,12後肺制限自己免疫に影響を与えます。午前の機能の欠乏は、遺伝子の突然変異、悪性腫瘍や肺界面活性剤13,14のクリアランスを損なう感染から生じる条件 (PAP)、肺胞蛋白症にリンクされています。AMs の移植は今 PAP 15,16の治療のための治療法として検討されています。
AMs は、胚形成の間に由来して循環白血球2,17に置き換えることがなく一生肺に固執するに知られています。午前売り上げ高のさまざまなレベルがインフルエンザ ウイルス4、破壊的照射18、内毒素への暴露によって感染を含む特定の臨床状況で報告されている午前売り上げ高は恒常性の肺に、19、そして高齢者20。AMs は、自己を介して悪性増殖17,21, 更新すると考えられているが、いくつかの最近の研究は、単球が血管肺マクロファージ22,23の下の人口に上昇を与えることができることを主張これらの新たに変えられた肺のマクロファージの機能がの実験条件はまだ肺疾患定義しなければなりません。肺炎症シグナルと免疫制御機械間の平衡を維持しようとすると、潜在的に興味深い地域がさらに午前活性化のコンテキストで刺激の閾値を理解することです。
免疫制御の損失をもたらす生理学的または病理学的変化は、さまざまな臨床設定 (例えば、呼吸器感染症、炎症性肺疾患、肺線維化疾患) の評価に重要です。それにもかかわらず、AMs はますますインジケーターまたは肺健康11,24のも決定要因として認識されます。収穫、特性評価、および人間および前臨床マウスモデルから維持する AMs 統一プロトコルは現在、ありません。午前前駆体と表現型のコンセンサスの欠如と詳細な方法の不在は、肺の健康および病気の午前の解読の役割の主要な障害をされていた。次のプロトコルでは、決定的な識別、分離、および体外で文化大きく午前動作の理解を進めるし、AM 向けの診断および治療の調査を促進する戦略を提供しています。

<table><tbody><tr><td>非酵素細胞解離溶液</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C5789</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet 軟膏</td><td>Dechra</td><td>620300</td><td></td></tr><tr><td>22Gカテーテル&nbsp;</td><td>テルモメディカルプロダクツ</td><td>SR-OX2225CA</td><td></td></tr><tr><td>4-0 非吸収性絹編み縫合糸&nbsp;</td><td>ケント・サイエンティフィック</td><td>SUT-15-2</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>マウスFcブロック&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Lysis buffer (PureLink RNA Kit)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>12183018A</td><td></td></tr><tr><td>b-メルカプトエタノール&nbsp;</td><td>ミリポアシグマ</td><td>M6250&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria II セルソーター&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>ケタミン&nbsp;(ケタテシア)</td><td>ヘンリー・シャイン</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>キシラジン&nbsp;(アナセド)</td><td>Akorn</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>リベラーゼ TL&nbsp;</td><td>ミリポアシグマ</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>ミリポアシグマ</td><td>AMPD1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>100&mu;mセルストレーナー&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>ヒト FC ブロック</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>564220</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>コーニング</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Countess II 自動セルカウンター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td></td><td></td>AMQAX1000</tr><tr><td>トリパンブルーソリューション</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td></td><td></td>15250061</tr><tr><td>HEPES</td><td>コーニング</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>アトランタ バイオロジカルズ</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>L-929 細胞株</td><td>アメリカンタイプカルチャーコレクション</td><td>ATCC,&nbsp;CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>コーニング</td><td>25-000-CIT25</td><td></td></tr><tr><td>組織培養フラスコ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>156367 60mm培養皿&nbsp;</td><td>ミリポアシグマ</td><td>CLS3261</td><td></td></tr><tr><td>15 mLコニカルチューブ&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 mL コニカルチューブ&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa細胞分析装置</td><td>BD Biosciences</td><td>657669</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td>v10.4</td><td>解析ソフト</td></tr><tr><td>Anti-CD45 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>147709</td><td>Clone I3/2.3, FITC conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD11b (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>101228</td><td>Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD11c (Mouse)</td><td>BD Biosciences</td><td>565452</td><td>Clone N418, BV 421 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-I-Ab (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>116420</td><td>Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-Siglec-F (Mouse)</td><td>BD Biosciences</td><td>562757</td><td>Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-Siglec-H (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>129605</td><td>Clone 551, PE conjugated</td></tr><tr><td>Anti-F4/80 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>123118</td><td>Clone BM8, APC/Cy7 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-Ly-6C (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>128035</td><td>Clone HK1.4, BV605 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD64 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>139311</td><td>Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD24 (Mouse)</td><td>BD Biosciences</td><td>563115</td><td>Clone M1/69, BV510 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD103 (Mouse)</td><td>BD Biosciences</td><td>745305</td><td>クローンOX-62、BV650標識</td></tr><tr><td>抗CD317(マウス)</td><td>バイオレジェンド</td><td>127015</td><td>クローン927、APC標識</td></tr><tr><td>抗CXCR1(マウス)</td><td>バイオレジェンド</td><td>149029</td><td>クローンSA011F11、BV785</td></tr>標識<tr><td>抗CD45(ヒト)</td><td>バイオレジェンド</td><td>304017</td><td>クローンHI30、AF488</td></tr>標識<tr><td>抗CD11b(ヒト)</td><td>バイオレジェンド</td><td>101216</td><td>クローンM1/70、PE/Cy7標識</td></tr><tr><td>抗HLA-DR (ヒト)</td><td>Biolegend</td><td>307618</td><td>Clone L243, APC/Cy7 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD169 (Human)</td><td>Biolegend</td><td>346008</td><td>Clone 7-239, APC conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD206 (Human)</td><td>Biolegend</td><td>321106</td><td>Clone 15-2, PE conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD163 (Human)</td><td>Biolegend</td><td>333612</td><td>Clone GHI/61, BV421 conjugated</td></tr></tbody></table>

離とマウスとヒトの肺胞マクロファージの体外培養

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

肺胞マクロファージは、肺居住者、最終分化マクロファージ出生前原産です。肺胞マクロファージは、寿命が長く、肺開発機能とその肺局所応答感染症や炎症に重要な役割でユニークです。日には、識別、分離、および人間およびマウスから肺胞マクロファージの処理の統一的手法は存在しません。このようなメソッドは、さまざまな実験的設定のこれらの重要な自然免疫系の細胞に関する研究に必要です。あらゆる研究室で簡単に採用できる、ここで説明する方法は、気管支肺胞洗浄液や肺組織から肺胞マクロファージを採取し、体外を維持する簡素化されたアプローチです。肺胞マクロファージは、肺胞に付着性のセルとして主に発生する、ためこのメソッドの焦点は収穫と同定する前にそれらを外れです。肺は高度に血管の臓器、骨髄性とリンパ性の起源の様々 な細胞タイプに生息する、対話、および肺微小環境によって影響を受けています。ここで説明されている表面のマーカーのセットを使用して、研究者はことができます簡単かつ明確に他の白血球から肺胞マクロファージを区別し、下位アプリケーションにそれらを浄化します。ここを開発した培養法両方の人間をサポートするマウスの体外発育の肺胞マクロファージと分子・細胞の研究と互換性が。

マウス AMs を識別するためにフローのフローサイトメトリーによるアプローチは、図 1に示すです。これは、表面マーカー他肺居住者又は肺に浸潤食から AMs を区別するに必要な最小セットの分析が含まれています。差分解析は、間質性マクロファージ、樹状細胞、好中球、単球、肺に発生する単球由来の肺マクロファージから AMs を識別するために必要です。表面のマーカーの次のスキームは、 AMsが CD45 互いから容易にこれらの細胞型を区別するために用いることができる+CD11c+、シグ F+、CD64+- A+ bF4/80-、CD11b-;間質性マクロファージCD45+、CD11b+- Ab +、CD64+、CD24...

この通信は、人間から肺胞大食細胞の分離と培養の方法論や実験用マウスのモデルについて説明します。

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

この手順の全体的な目標は、肺および気管支肺胞洗浄液からヒトおよびマウスの肺胞マクロファージを分離し、それらのinvitro培養法を開発することです。この方法は、呼吸器感染症、炎症、自己免疫における肺胞マクロファージの役割など、肺胞免疫学の分野におけるいくつかの重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、肺胞マクロファージを他の肺白血球と区別し、実験目的で高度に精製された肺胞マクロファージの集団を取得できることです。麻酔をかけたマウスを腹側を上にして解剖面に置きます。脱水症状を防ぐために、眼科用獣医軟膏を目に塗ります。マウスの腹面全体を、70%イソプロパノールで飽和させた滅菌アルコール調製パッドで拭いて消毒します。マウスは、4本の脚をすべて保持した状態で取り付けます。マイクロ解剖ツールで腹腔を静かに開きます。内臓を傷つけたり、張り出した組織を作ったりすることなく、できるだけ多くの領域を開くように注意する必要があります。縦隔を通して胸郭をゆっくりと切開することにより、胸腔を静かに開きます。理想的には、胸郭を左右に切除することができます。胸腔を開いている間、肺の胸膜を傷つけないように細心の注意を払う必要があります。下大静脈を特定し、マウスを出血させるために切開を行います。吸収性のコットンパッドを使用して血液を吸収します。10ミリリットルの氷冷リン酸緩衝生理食塩水を右心室に注入して、循環血液細胞を洗い流します。吸収性のあるコットンパッドで血液の流れを吸収します。完全に灌流されると、肺は湯通ししたように見え、その後洗浄の準備が整います。首の皮膚と筋肉をそっと切り開き、気道を露出させます。気管を傷つけずに、隣接する筋肉、軟骨、脂肪組織を慎重に切除します。次に、喉頭の後方の気管に小さな切開を行います。この切開は、気管がまだ喉頭に付着している間にカテーテルを挿入するのに十分なはずです。BAL液を採取する上で最も重要なステップは、カテーテルを気管にしっかりと取り付けて、洗浄中の漏れを最小限に抑えることです。針のない1インチの22ゲージカテーテルを肺に向かって気管に挿入します。絹の編み込み縫合糸と四角い結び目でカテーテルを固定します。頑丈な手を持ち、このステップを踏むために、ゆっくりと優しく気管と肺の破裂を防ぎます。氷冷BALバッファーで満たされた1ミリリットルのシリンジをカテーテルに取り付け、バッファーをゆっくりと肺に注入します。これにより、肺が膨らみます。シリンジをカテーテルに5秒間取り付けたままにしてから、ピストンをそっと引いて洗浄液を吸引します。.これにより、肺が収縮します。氷の上に置いた15ミリリットルの円錐形チューブに液体を集めます。膨張と収縮をさらに9回繰り返し、洗面液を溜めます。フラッシュごとに1ミリリットルのバッファーを超えないようにしてください。肺活量を超え、破裂につながる可能性があるためです。.10ミリリットルのBAL液体を250倍g、摂氏4度で10分間遠心分離します。細胞ペレットにはBAL細胞が含まれています。BAL細胞を100マイクロリットルのフローソーティングバッファーに再懸濁します。テキストプロトコルで説明されているように、細胞の染色とソートに進みます。解剖のために麻酔をかけたマウスを準備し、切開を行い、以前と同様にマウスを出血させます。10ミリリットルの氷冷PBSを右心室に注入して、循環血液細胞を洗い流します。完全に灌流されると、肺は湯通しして見え、収穫の準備が整います。気管、血管、靭帯を切断して15ミリリットルの円錐管に切断し、5ミリリットルの冷たDMEMを使用して肺を解剖します。次のステップまで氷の上に置いておきます。灌流した肺を、3ミリリットルのDMEMを含む無菌でパイロジェンフリーの60ミリメートル培養皿に移します。鉗子を解剖して、気道やその他の硬い非肺組織物質が存在する場合は、それを引き出します。メスで肺組織を1ミリメートル未満にミンチします。リベラーゼTLのミリリットルあたり300マイクログラム、およびDNAseの1ミリリットルあたり5単位を追加します。ピペッティングで混合し、インキュベーター内で摂氏37度で25分間インキュベートします。10分後、ピペッティングで一度穏やかに混合します。解離した肺を、50ミリリットルの円錐管に取り付けられた100ミクロンのセルストレーナーに通します。1ミリリットルのシリンジからプランジャーの背面を使用して、フィルター上の細胞の塊をマッシュアップします。フィルターを20ミリリットルの洗浄バッファーで洗浄します。500 g、摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を捨て、細胞ペレットを20ミリリットルの洗浄緩衝液に再懸濁します。ひずみと遠心分離のステップを2回繰り返し、そのたびにフィルターとチューブを交換します。最後に、100マイクロリットルのフローソーティングバッファーをセルペレットに添加して、シングルセル懸濁液を調製します。抗体の染色および細胞ソーティングを、テキストプロトコールに記載されているとおりに実施します。細胞選別後、gの250倍、摂氏4度で10分間遠心分離して細胞を回収します。マウスAMを1ミリリットルのマウスAM培養液に再懸濁します。収量と実験の必要性に基づいて、チャンバースライド、培養皿、または培養フラスコに細胞を播種します。理想的には、T 25組織培養フラスコに10ミリリットルの培地で1ミリリットルあたり100, 000でAMを播種します。5%二酸化炭素雰囲気の摂氏37度の加湿インキュベーターで細胞をインキュベートします。播種後24時間で、AMは付着している必要があり、培地の穏やかな交換によって剥離することはありません。片方の端から吸引して培地を取り除き、摂氏37度に予め温めた新鮮な培地を補充します。最後に、倒立顕微鏡でフラスコを観察します。マウス気管支肺胞洗浄液中の肺胞マクロファージのフローサイトメトリー評価が示されています。肺胞マクロファージは、CD45陽性、CD11c陽性、およびSiglec-F陽性の細胞であることが陽性であると同定されています。ここに示されているのは、マウス肺胞マクロファージをin vitroで24時間培養した代表的な結果です。細胞は接着性になり、培地を穏やかに交換しても細胞は剥離しません。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば、約2時間で完了します。このビデオを見れば、マウスやヒトの肺胞マクロファージを他の肺細胞と区別する方法をよく理解できるはずです。また、下流の実験のために肺胞マクロファージの美しい集団を得るための手順として。この手順を試みる際には、すべての肺常在マクロファージまたは食細胞が肺胞マクロファージであるとは限らないことを覚えておくことが重要です。肺胞マクロファージは、出生時から肺に存在する特殊な細胞の一種です。肺胞マクロファージの単離では、肺胞微小環境からの実行可能な抽出方法に焦点を当てる必要があります。ここで開発されたin vitro培養法は、分子および細胞アッセイに利用できる実験室条件での肺胞マクロファージの増殖をサポートします。この手順に続いて、養子細胞移植、抗原提示、炎症刺激に対する応答の評価などの他の方法を実行して、肺胞マクロファージの生物学に関する追加の質問に答えることができます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ここで、我々は、肺に先天性免疫細胞を常駐し、無水物ナノ粒子との共培養に応答して活性化を検討しているマウスの肺胞マクロファージを採取するためのプロトコルについて説明します。...

マウス肺胞マクロファージを採取し、無水物ナノ粒子により誘導される細胞活性化を評価する

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ダブル勾配遠心、テフロンコーティングされた細胞培養バッグ中のマクロファージへの分化によるヒト単球の単離

共焦点顕微鏡によって貪食されたアスペルギルス胞子の成長を制御するために単離したマウス肺胞マクロファージの能力を評価する方法。...

共焦点顕微鏡による絶縁型肺胞マクロファージの抗真菌活性を評価する

ここでは、マウスの腹膜マクロファージを単離するための簡単なプロトコルについて説明します。この手順に続いてRNAを抽出し、Toll様受容体刺激による遺伝子発現解析を行います。...

Toll様受容体刺激時の遺伝子発現解析を行うためにマウス腹腔マクロファージの単離

顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)で培養した骨髄細胞は、マクロファージと樹状細胞(DC)を含む不均一な培養を生成します。この方法は、GM-CSF培養中のマクロファージとDCを区別するために、MHCIIとHA(HA)結合を使用することを強調している。この培養物のマクロファージは、肺胞マクロファージと多くの類似点があります。...

マウスの骨髄からGM-CSF由来肺胞のようなマクロファージや樹状細胞の生成および同定

マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF)分化ヒト単球由来マクロファージの細胞培養のためのプロトコールが提示されます。このプロトコルは、単球の凍結保存とマクロファージへのバルク分化を組み合わせて利用します。その後、回収したマクロファージを、実験に必要な細胞密度の培養ウェルに播種することができます。...

マクロファージコロニー刺激因子分化したヒト単球由来マクロファージの文化

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肺胞マクロファージおよびCD4+T細胞免疫フェノタイピングおよびHIV貯蔵所評価のための気管支藻胞洗浄液および一致血液の処理

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マウス由来骨髄由来マクロファージの単離と培養

学ぶマウスとヒトの肺胞マクロファージの分離と体外培養法。気管支肺胞洗浄液と肺組織から高純度の細胞を取得し、呼吸器免疫学の研究に応用できます。

離とマウスとヒトの肺胞マクロファージの体外培養

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