離とマウスとヒトの肺胞マクロファージの体外培養

この手順の全体的な目標は、肺および気管支肺胞洗浄液からヒトおよびマウスの肺胞マクロファージを分離し、それらのinvitro培養法を開発することです。この方法は、呼吸器感染症、炎症、自己免疫における肺胞マクロファージの役割など、肺胞免疫学の分野におけるいくつかの重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、肺胞マクロファージを他の肺白血球と区別し、実験目的で高度に精製された肺胞マクロファージの集団を取得できることです。

麻酔をかけたマウスを腹側を上にして解剖面に置きます。脱水症状を防ぐために、眼科用獣医軟膏を目に塗ります。マウスの腹面全体を、70%イソプロパノールで飽和させた滅菌アルコール調製パッドで拭いて消毒します。

マウスは、4本の脚をすべて保持した状態で取り付けます。マイクロ解剖ツールで腹腔を静かに開きます。内臓を傷つけたり、張り出した組織を作ったりすることなく、できるだけ多くの領域を開くように注意する必要があります。

縦隔を通して胸郭をゆっくりと切開することにより、胸腔を静かに開きます。理想的には、胸郭を左右に切除することができます。胸腔を開いている間、肺の胸膜を傷つけないように細心の注意を払う必要があります。

下大静脈を特定し、マウスを出血させるために切開を行います。吸収性のコットンパッドを使用して血液を吸収します。10ミリリットルの氷冷リン酸緩衝生理食塩水を右心室に注入して、循環血液細胞を洗い流します。

吸収性のあるコットンパッドで血液の流れを吸収します。完全に灌流されると、肺は湯通ししたように見え、その後洗浄の準備が整います。首の皮膚と筋肉をそっと切り開き、気道を露出させます。

気管を傷つけずに、隣接する筋肉、軟骨、脂肪組織を慎重に切除します。次に、喉頭の後方の気管に小さな切開を行います。この切開は、気管がまだ喉頭に付着している間にカテーテルを挿入するのに十分なはずです。

BAL液を採取する上で最も重要なステップは、カテーテルを気管にしっかりと取り付けて、洗浄中の漏れを最小限に抑えることです。針のない1インチの22ゲージカテーテルを肺に向かって気管に挿入します。絹の編み込み縫合糸と四角い結び目でカテーテルを固定します。

頑丈な手を持ち、このステップを踏むために、ゆっくりと優しく気管と肺の破裂を防ぎます。氷冷BALバッファーで満たされた1ミリリットルのシリンジをカテーテルに取り付け、バッファーをゆっくりと肺に注入します。これにより、肺が膨らみます。

シリンジをカテーテルに5秒間取り付けたままにしてから、ピストンをそっと引いて洗浄液を吸引します。.これにより、肺が収縮します。氷の上に置いた15ミリリットルの円錐形チューブに液体を集めます。

膨張と収縮をさらに9回繰り返し、洗面液を溜めます。フラッシュごとに1ミリリットルのバッファーを超えないようにしてください。肺活量を超え、破裂につながる可能性があるためです。.10ミリリットルのBAL液体を250倍g、摂氏4度で10分間遠心分離します。

細胞ペレットにはBAL細胞が含まれています。BAL細胞を100マイクロリットルのフローソーティングバッファーに再懸濁します。テキストプロトコルで説明されているように、細胞の染色とソートに進みます。

解剖のために麻酔をかけたマウスを準備し、切開を行い、以前と同様にマウスを出血させます。10ミリリットルの氷冷PBSを右心室に注入して、循環血液細胞を洗い流します。完全に灌流されると、肺は湯通しして見え、収穫の準備が整います。

気管、血管、靭帯を切断して15ミリリットルの円錐管に切断し、5ミリリットルの冷たDMEMを使用して肺を解剖します。次のステップまで氷の上に置いておきます。灌流した肺を、3ミリリットルのDMEMを含む無菌でパイロジェンフリーの60ミリメートル培養皿に移します。

鉗子を解剖して、気道やその他の硬い非肺組織物質が存在する場合は、それを引き出します。メスで肺組織を1ミリメートル未満にミンチします。リベラーゼTLのミリリットルあたり300マイクログラム、およびDNAseの1ミリリットルあたり5単位を追加します。

ピペッティングで混合し、インキュベーター内で摂氏37度で25分間インキュベートします。10分後、ピペッティングで一度穏やかに混合します。解離した肺を、50ミリリットルの円錐管に取り付けられた100ミクロンのセルストレーナーに通します。

1ミリリットルのシリンジからプランジャーの背面を使用して、フィルター上の細胞の塊をマッシュアップします。フィルターを20ミリリットルの洗浄バッファーで洗浄します。500 g、摂氏4度で5分間遠心分離します。

上清を捨て、細胞ペレットを20ミリリットルの洗浄緩衝液に再懸濁します。ひずみと遠心分離のステップを2回繰り返し、そのたびにフィルターとチューブを交換します。最後に、100マイクロリットルのフローソーティングバッファーをセルペレットに添加して、シングルセル懸濁液を調製します。

抗体の染色および細胞ソーティングを、テキストプロトコールに記載されているとおりに実施します。細胞選別後、gの250倍、摂氏4度で10分間遠心分離して細胞を回収します。マウスAMを1ミリリットルのマウスAM培養液に再懸濁します。

収量と実験の必要性に基づいて、チャンバースライド、培養皿、または培養フラスコに細胞を播種します。理想的には、T 25組織培養フラスコに10ミリリットルの培地で1ミリリットルあたり100, 000でAMを播種します。5%二酸化炭素雰囲気の摂氏37度の加湿インキュベーターで細胞をインキュベートします。

播種後24時間で、AMは付着している必要があり、培地の穏やかな交換によって剥離することはありません。片方の端から吸引して培地を取り除き、摂氏37度に予め温めた新鮮な培地を補充します。最後に、倒立顕微鏡でフラスコを観察します。

マウス気管支肺胞洗浄液中の肺胞マクロファージのフローサイトメトリー評価が示されています。肺胞マクロファージは、CD45陽性、CD11c陽性、およびSiglec-F陽性の細胞であることが陽性であると同定されています。ここに示されているのは、マウス肺胞マクロファージをin vitroで24時間培養した代表的な結果です。

細胞は接着性になり、培地を穏やかに交換しても細胞は剥離しません。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば、約2時間で完了します。このビデオを見れば、マウスやヒトの肺胞マクロファージを他の肺細胞と区別する方法をよく理解できるはずです。

また、下流の実験のために肺胞マクロファージの美しい集団を得るための手順として。この手順を試みる際には、すべての肺常在マクロファージまたは食細胞が肺胞マクロファージであるとは限らないことを覚えておくことが重要です。肺胞マクロファージは、出生時から肺に存在する特殊な細胞の一種です。

肺胞マクロファージの単離では、肺胞微小環境からの実行可能な抽出方法に焦点を当てる必要があります。ここで開発されたin vitro培養法は、分子および細胞アッセイに利用できる実験室条件での肺胞マクロファージの増殖をサポートします。この手順に続いて、養子細胞移植、抗原提示、炎症刺激に対する応答の評価などの他の方法を実行して、肺胞マクロファージの生物学に関する追加の質問に答えることができます。