Name: ゼブラフィッシュ胚における細胞光電を介して次の心内膜組織運動 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 学ぶ 心内膜細胞の追跡法を、Kaede蛍光タンパク質の光変換とライブイメージングを用いてゼブラフィッシュ胚で行う方法です。この技術は急速な心拍による撮影困難を克服し、房室管や心臓弁形成時の細胞挙動を詳細に観察できます。

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我々 はこのプロトコルで記述されている金型を助けるためバジーレ Gurchenkov ナタリー Faggianelli、デニス · Duchemin アン ロール Duchemin を感謝したいです。この作品は FRM (DEQ20140329553)、(ANR-15-CE13-0015-01、ANR-12-ISV2-0001-01) ANR、エンボ若い調査官プログラム ERC CoG N ° 682938 欧州共同体によってサポートされない Evalve ・ グラント ANR-10-LABX-0030-INRT、フランスの州の資金管理ANR-10-アイデックス-0002-02 というラベルの付いたフレーム プログラム Investissements d'Avenir の下のアジャンス ナシオナル デ ラ凝った。

1. 金型の製作やアガロースをマウント
<ol><li>3 D プリンターまたは伝統的な機械的ワーク ショップ ツールを使用して図 1に示す寸法の金型を作成します。</li>
	<li>35 mm プラスチック製取り付け皿に溶かし 1% アガロースゲルの約 1.5 mL のピペットします。金型と agarose の間の空気を避けるために世話液体の agarose のプラスチック金型を配置します。4 ° C で皿を配置、agarose 硬化 (この所要時間約 5 分) まで待つプラスチック金型を削除します。</li>
	<li>後で使用できるマウント料理を保存するには、カバー、ふた付き皿を皿とパラフィルムでしっかりと蓋をラップします。取り付け皿を格納、ことができます蓋面 4 ° C で最大 5 日間を下</li>
	<li>事前に 1.5 mL で 0.7% 低融点アガロースの因数を 1 mL エッペン チューブ取り付けの日に使用準備します。 注: パラフィルムがしっかりと料理の周りラップされていない場合、水が蒸発する、取り付け皿の agarose の井戸が時間の経過とともに変形をします。</li>
</ol>2. 光変換の胚を取得
<ol><li>Tg (fli1a:gal4FFubsUAS:kaede)異なる線し、約 200 胚胚中 28.5 ° C で暗闇の中での成長ゼブラフィッシュのラインを交差させる方法の詳細については、ゼウス科学教育データベース11を参照してください。</li>
	<li>5 時間後、24 時間前に、1-フェニル-2-チオ尿素 (PTU) 色素形成を防ぐために胚を扱う (0.003% 胚中 PTU)。</li>
	<li>明るい緑の蛍光性を表現する表示される光電、蛍光万国実体写真下画面胚、選択 5 健康な胚の開始前に約 1 時間。Photoconverting 非特異的細胞で楓を避けるために胚の周囲の光への露出を避けるために胚を視覚化するときの強度の低い光の使用お勧めします。</li>
</ol>3. 埋め込み
<ol><li>メディアのマウントの 10 mL を準備: 0.02 %tricaine と 50 mM BDM 胚中。</li>
	<li>取り付け皿にメディアをマウントの 2 mL を追加でき、agarose に拡散して解決のための 15-30 分。</li>
	<li>一方で、約 5 分の 70 ° C の熱ブロックに管を置くことによって 0.7% (LMP) 低融点アガロースの 1 mL の約数を溶かします。<ol>
<li>わずかに冷却する LMP agarose のため待機し、低融点アガロースのチューブに 8 mg/mL tricaine ソリューションを 25 μ l 添加し 1 M BDM 溶液 40 μ L を追加します。上下、ピペッティングによるミックスは、液体状態で LMP アガロースを保つために 38 ° C の熱ブロックにチューブを転送します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ペトリネットの胚を損傷しないように注意を取って、鉗子を用いた顕微鏡下で事前に選択された胚を胚中、慎重に dechorionate と料理します。</li>
	<li>メディアのマウントの 2 mL を含む別の皿に胚を転送します。<ol>
<li>胚の心を停止する時 (約 5-10 分を取る)、取付に胚料理、彼らは 25 度の角度でうそをつくように鉗子を使用して井戸に胚を手配転送ツインテールだけでなく、上向き卵黄の深部に向かって指しています。</li>
		<li>胚が大体の場所でメディアを削除、tricaine と、BDM を含む 0.7% LMP agarose の 〜 200 μ L に胚を埋め込むし、胚の位置を再調整は、必要に応じて左右に胚を傾斜します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>LMP agarose セット (所要時間約 5 分) は、メディアをマウントを料理に追加されるまで待ちます。胚は、photoconverted をする準備が整いました。 注: tricaine と、BDM 胚を麻酔してそれぞれ胚の心臓を停止する使用されます。マウント メディア イメージング、前日を準備することができますが、メディアを光から保護してください。 注: は胚の正しい位置 photoconvert たいセルへ明確なレーザーのパスを許可することが重要です。レーザー光は、胚に到達するまで旅行する必要はありません、胚は光電後簡単にマウントされませんすることができます、ので、井戸の開始の近くに胚の頭を位置します。</li>
</ol>4. 光電
<ol><li>装備されて、405 (ライカ SP8) のような正立型共焦点顕微鏡の 488 nm nm と 561 nm レーザー ソースを見つける胚白色光 (明視野観察) と対物レンズに透過心による (ライカ HCX IRAPO L、25 × 0.95 エヌ ・ エイのような目的)。561 nm レーザー (すなわち、~ 5% 強度、589 728 nm での DPSS 561 レーザー) を用いた赤い楓蛍光性をチェックします。その後、488 nm レーザー (すなわち、~ 5% 強度、502-556 nm に設定器で 30 mW マルチライン アルゴン レーザー) を用いて心内膜を視覚化します。</li>
	<li>顕微鏡集録ソフトウェアに「縛る」モードを入力します。両方 488 の ~ 1% のレーザー出力を選択して nm と 561 nm のレーザーです。</li>
	<li>興味の面に焦点を当てる、その後、405 nm のダイオードを用いた photoconvert 細胞レーザー スキャン、投資収益率を 3 倍の 25% レーザー出力で利益率 (ROI) の地域を選択します。不十分な楓は、投資収益率で photoconverted をする必要があります、405 nm レーザー領域の上 3 回再びスキャンします。僅かにこの手順を繰り返します。</li>
	<li>ソフトウェアに「TCS SP8」モード戻るし、、561 を使用して z スタックを取得 nm、488 nm レーザーの順番に。画像処理速度を上げるため 'の双方向' オプションを選択することを確認します。 メモ: どのくらいそれは photoconvert にかかるし、それぞれの胚をイメージが違います。心臓の鼓動が正常な心臓弁の開発にとって重要である、それを意味する必要はありません時間を photoconvert すべて 5 胚場合でも 30 分以上停止して心を維持しないように知られています。 注: 使用 PMT 検出器、光電過程光電後しばらくお勧め 'カウント' モードに設定ハイブリッド検出器を使用します。これは、ハイブリッド検出器より敏感なより良い品質の画像を作り出すことができるが露出オーバーで簡単に破損しているためにです。</li>
</ol>5. photoconverted 胚のアンマウント
<ol><li>光電後に、、LMP アガロースを破るし、胎児をやさしく吸う胚の頭の上に少しだけ押しにガラス ピペットを使用します。<ol>
<li>ガラス ピペットから胚を胚媒体 (媒体を含んでいる BDM を洗い流す) に PTU を含む 35 mm のペトリ皿に取り出します。</li>
		<li>PTU と胚媒体を含んでいる 6 ウェル プレートには井戸に胚を転送します。このステップの間に胚のノートを保つことを確認は、これは後で発達段階で photoconverted のセルの位置を関連付けるに不可欠なまあに入ります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>今では、胚は、BDM 含む媒体から削除されます、彼らの心は戻り胚胚は通常を開発し続けることを許可するように 28.5 ° C で暗闇の中を約 5 分で再び暴行を始めるべきです。</li>
</ol>6 その後の胚の段階で photoconverted 細胞のイメージング
<ol><li>必要な段階では、心臓を停止させるし、胚が胚を追跡する別のマーク付きの料理で BDM と見なす必要がある重要な違いがこのプロトコルの手順 3 の下のような胚を再埋め込みます。</li>
	<li>62 までの胚の hpf 561 を使用して心内膜の z スタックを取得 nm、488 nm の赤と緑の蛍光信号をそれぞれ。62 より古い段階で胚の hpf、多光子を使用してレーザー セット 940 nm 488 nm レーザーではなく緑の楓をイメージします。</li>
</ol>7. 画像解析による胚下 48 hpf
注: AVC の組織の動きが複雑な三次元構造を分析することは困難にすることができます。2 つの非 photoconverted 領域または 2 つの photoconverted の地域間 avc 非 photoconverted 領域の長さ間の AVC の photoconverted 領域の長さを定量化することができます上に立体の構造をマップするが望ましい、二次元の地図。Photoconverted 胚の画像取得 48 前に hpf は、次の方法を使用して分析できます。
<ol><li>Matlab または任意の同様のソフトウェアで取得した画像をインポートします。</li>
	<li>投資収益率、すなわち、心内膜を手動で外縁し、この地域外の信号を削除するマスクを適用します。</li>
	<li>心内膜上の点を識別し、3 次元にそれらをプロットする画像を輝度しきい値を適用します。アトリウムとソフトウェアの消去コマンドを使用して心室に興味のポイントを手動で消去することによって、AVC の狭いとほとんどストレートの部分に対応する箇所を特定します。</li>
	<li>ように入手された AVC を表す点に合わせてシリンダーを使用します。</li>
	<li>いくつかのサンプルを比較するための参照システムを定義します。たとえば、参照系の原点と z 軸として装着シリンダーの軸として AVC ポイントの重心を採用します。<ol>
<li>心臓 (心房または心室筋) の同じ側に正の z 位置が常に対応していることを確認します。</li>
		<li>X y 平面上の AVC ポイントのプロジェクトし、それらに合わせて楕円を使用してください。</li>
		<li>楕円の長軸と参照系の y 軸が平行し、正の y 値は胎児に関して AVC 内部側に対応心内膜ポイント z 軸の周りを回転します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>半平面を回転させることにより得られるいくつかの面で三次元データセットをカット、AVC をセグメント化、{y = 0、x > 0} z 方向で。<ol>
<li>これらの平面の隣接ピクセルの強度をプロジェクトし、一貫した方法で、内皮を定義します。たとえば、手動でからラインを描く、心房内皮の半分の厚さで AVC の心室側に。</li>
		<li>表面と AVC を表すスプライン ツールボックスを使用して 3 次元スプラインと内皮を表すラインのポイントを補間します。 注: 分割の精度とこのステップの時間消費の両方切断面の数を決定します。通常、飛行機 8、良い結果を達成するために十分であります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>円筒座標を使用して AVC 表面の各ポイントの方位の位置を定義します。<ol>
<li>各方位の位置でサーフェス間の連続する点の円弧の長さを計算することによって、AVC の表面に沿ってパラメトリック曲線を定義します。</li>
		<li>各のパラメトリック曲線曲線ゼロに AVC の中心に最も近いポイントを定義します。AVC のポイントはこうしてパラメトリック曲線上の方位の位置とその位置によって完全に説明しました。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ポイントのパラメトリック位置を使用して二次元のイメージに、AVC を展開します。</li>
	<li>バイナリ イメージの閾値のエッジとして、photoconverted の強度と非 photoconverted チャンネル間の比率を定量化する領域のエッジを見つけます。必要に応じて、手動で結果を修正します。</li>
	<li>方位角の位置の関数として組織の長さを計算するためのエッジ間の円弧の長さを計算します。</li>
</ol>

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</ol>

利害の対立が宣言されていません。

光電のタイミング: 96 でも内分泌かく乱化学物質の鮮やかな表現が楓のまま hpf、胚が大きくなると、レーザー光を拡散させるより楓の限られた光電をより困難になり、AVC に達する前にそれに注意してください。At 萌芽期段階の 55 以降 hpf、心室と心房のバルーニングもの光電用バイオレット レーザー ビームが心房または心室のどちらかを最初の通過せず AVC 細胞を達することができないということ。これは 55 を超えて、hpf、photoconvert、AVC の内分泌かく乱化学物質を 1 つする必要がありますも photoconvert 心房と心室に追加内分泌かく乱化学物質。
BDM と tricaine: 内分泌かく乱化学物質の正確な光電暴行から心臓を一時的に停止する必要があります。BDM (2, 3-butanedione ジアセチルモノオキシム) は、心筋収縮12を抑制するよく知られている電気収縮ランプです。我々 は、この議定書の対象となっている胚の形態の違いを観察しないと通常成長されている...

ゼブラフィッシュは現在体内細胞および進化のプロセスを勉強する最も重要な脊椎動物モデルの一つです。これがゼブラフィッシュの光透過性の主因と遺伝学は、遺伝子を含む光学的手法を適用するための強力なモデルはそれにこうしてエンコード光応答性タンパク質技術1。心臓の研究に固有のゼブラフィッシュを受け取る拡散を介して十分な酸素ハートビートなしも突然変異体は発達遺伝子および摂動の影響に関する分析を許可、開発の最初の週を生き残ることができるようにほとんどの脊椎動物2で可能ではない心臓の形態形成に関する血流。
ゼブラフィッシュの心臓の管は 24 時間ポスト受精 (hpf) によって形成されます。その形成直後後心臓の管は、積極的に暴行を開始します。36 で hpf、明確な収縮心室から心房を分離します。収縮のこの地域は、立方形態3房室運河 (AVC) とこの地域の変更細胞扁平上皮の形態から呼び出されます。ゼブラフィッシュ房室弁の形態形成開始 48 時間前後は、受精を投稿します。5 日ポスト受精、2 つの弁尖は、AVC に拡張し、4心周期の間に、心室から心房への血液の逆流を防ぐ。AVC と弁形成過程における細胞の追跡を介して伝統的なタイムラプス顕微鏡5,6セルに従うことが困難な心の急速な打撃としては困難です。このプロトコルは、スティードら2016年7から適応で楓の蛍光蛋白質の表現に使用されるなTg (fli1a:gal4FFubsUAS:kaede)8ゼブラフィッシュ遺伝子組換え回線を使用する方法を記述します。血管内皮細胞は、心内膜を含みます。36 55 の hpf と発生時間の特定ポイントで photoconverted 内分泌かく乱化学物質の高分解能イメージングの内分泌かく乱化学物質の正確な光電に暴行、心臓を一時的に停止、薬 2, 3-butanedione-2-ジアセチルモノオキシム (BDM) が使用されます。以前、内分泌かく乱化学物質 photoconverted このメソッドを使用してが変換されていない近所の人たちと区別することができますまま光電7時間後 5 日間以上に示されています。このプロトコル 48 より若い胚における内分泌かく乱化学物質 photoconverted の画像解析に使用するメソッドの詳細も hpf は、AVC 開発 (Boselliらプレスで)9中に組織の動きに従う正常に使用されています。我々 は、読者がこのプロトコルを有用見つける AVC とバルブの開発、正常な胚、変異体、morphants、または薬剤を投与した胚を研究するため願っています。ゼブラフィッシュの開発中に蛍光タンパク質を用いた細胞追跡に関連する一般的なプロトコル、ロンバルドら、2012年10投稿記事をご覧ください。

<table><tbody><tr><td>素材</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>魚の飼育や卵の採集に必要な装備(詳細はゼブラフィッシュBook22を参照)。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>正立共焦点顕微鏡(488 nm、561 nm、405 nmで動作するレーザー、調整可能な多光子レーザー、およびライカHCX IRAPO L、25倍、N.A.0.95対物レンズを装備)</td><td>ライカ</td><td>ライカSP8</td><td></td></tr><tr><td>ヒートブロック</td><td>ThermoScientific</td><td>88870001</td><td></td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm組織培養皿</td><td>ファルコン</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>ファルコン</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>モールド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><ストロング>試薬</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 mg/mL トリカインストック溶液&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M BDM ストック溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 低融点アガロース</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>ロンザ</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>PTU (1-フェニル-2-チオ尿素)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>胚培地: 30x ストック溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェア</画像</td>解析、カーブフィッティング、バイオフォーマットツールボックスを搭載したstrong><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 mg/mL Tricaine Stock solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Danieau</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 7に調整し、分量して-20°Cで保存します。C&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M BDM原液</強></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 g BDM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>112135</td><td></td></tr><tr><td>10 mL ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aliquotおよび-20°Cで保存してください。C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胚培地:30倍ストック溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50.7 g NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>0.78 g KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>1.47 g 硫酸マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp;7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>2.1 g 亜硝酸カルシウム四水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13477-34-4</td><td></td></tr><tr><td>19.52 g HEPES (4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>pH 7.2 に調整し、室温</td><td></td><td></td><td></td>で保存</tr><tr><td>しますMold</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PlasCLEAR 樹脂</td><td>アシガ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラス39&nbsp;フリーフォームピコ3D</td><td>プリンターAsiga</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュ胚における細胞光電を介して次の心内膜組織運動

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

胚発生に伴う細胞細胞行動のダイナミックな変化を受けるし、発生生物学の分野の基本的な目標は、これらの変更の背後にある細胞の論理を読み解きます。発見と蛍光タンパク質の開発が格段に動的変更の私達の理解光学的細胞や組織を強調表示する方法を提供します。ただし、光電、微速度顕微鏡観察およびそれに続く画像解析は、脳や目など臓器の細胞動態を暴くで非常に成功する証明が、このアプローチは通常使用されないため心臓の開発で心臓のサイクル中に心臓の急速な動きによってもたらされる課題。このプロトコルは、2 つの部分で構成されています。最初の部分では、photoconverting とその後中ゼブラフィッシュ房室運河 (AVC)、心臓房室弁開発心内膜細胞 (内分泌かく乱化学物質) を追跡する方法について説明します。正確な光電場所を取るために薬で心臓を一時的停止メソッドが含まれます。心は再開できる発達時間後の時点で photoconverted 内分泌かく乱化学物質の高分解能イメージングのため心臓が再び停止するまでに薬物および萌芽期の開発の除去時に鼓動が通常どおり続行されます。プロトコルの 2 番目の部分は、二次元の地図に立体構造から蛍光信号をマッピングすることにより幼胚の胚で AVC の photoconverted または非 photoconverted 領域の長さを定量化する画像解析法をについて説明します.一緒に、プロトコルの 2 つの部分は、起源とゼブラフィッシュ AVC と房室弁をし、変異体、morphants、またはと扱われている胚を研究するため適用できる可能性のある細胞の挙動を検討する 1 つをことができます。AVC および/または弁の開発を妨害する試薬です。

48 胚 photoconverted の例 hpf 80 でもう一度イメージ化と hpf は図 2映画 1および2で示されています。405 nm の光に楓を公開すると、不可逆的変換蛍光赤フォームにその蛍光緑の形態からの蛋白質、緑または赤いフォームのラベルの付いたセルの動作を有効にする彼らのメランジに尊重します。弁形成の間に近所の人。それは 48 の hpf AVC のいくつかの photoconverted 細胞が後で急増し、弁尖の片側に主に住んでいた後に見ることができます。
Photoconverting 内分泌かく乱化学物質、心房と心室は図 3に示す後 36 hpf 胚の説明画像解析法を適用することによって達成することができます結果の例です。AVC のセグメンテ...

このプロトコルは楓生活の心内膜細胞の蛍光タンパク質の光変換の方法を記述するゼブラフィッシュ胎児房室管、心臓房室弁開発中心内膜細胞の追跡を有効にします。.

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

この手順の全体的な目標は、房室管および心臓弁形成中に心内膜細胞を追跡することです。この方法は、心内膜細胞がさまざまな種類の変異体でどのように振る舞うかを理解するなど、心臓発生の分野における重要な問題に対処するのに役立ちます。AVCおよび弁形成中の細胞の追跡は、心臓の鼓動が速いため困難です。これにより、従来のタイムラプス顕微鏡で細胞を追跡することが困難になります。この手法の主な利点は、これらの問題の一部を回避できることです。その手順を実演するのは、私の研究室のポスドクであるReneeです。テキストプロトコルに従って型を作成した後、約1.5ミリリットルの溶融した1%アガロースを35ミリメートルのプラスチック取り付け皿にピペットで入れます。次に、プラスチック金型を液体アガロースに配置し、金型とアガロースの間に空気が閉じ込められないように注意します。アガロースが固まるまで皿を摂氏4度に置きます。次に、アガロースからプラスチック型を取り外します。次に、あらかじめ調製した2ミリリットルの封入用培地を封入皿に加え、溶液がアガロースに拡散するまで15〜30分待ちます。その間に、0.7%低融点(LMP)の1ミリリットルのアリコートを溶かし、チューブを摂氏70度のヒートブロックに約5分間置きます。LMPアガロースを上下にピペットで動かして、少し冷まします。次に、25マイクロリットルの8ミリグラム/ミリリットルのトリカインと40マイクロリットルの1モルBDM溶液をチューブに追加します。ピペッティングで上下に動かして混合します。次に、チューブを摂氏38度のヒートブロックに移して、LMPアガロースを液体状態に保ちます。胚を2ミリリットルの封入培地を含む別の皿に移します。次に、心臓の鼓動が止まったら、胚をマウント皿に移し、鉗子を使用してウェルに配置し、卵黄を上に向けて、尾をウェルの深い部分に向けて25度の角度で横たわるようにします。胚がほぼ所定の位置に位置付けられたら、培地を取り出し、トリカインとBDMを含む0.7%LMPアガロースの約200マイクロリットルに埋め込みます。次に、胚の位置を再調整し、必要に応じて胚を左または右に傾けます。インデントされた正方形の壁を押し下げて、余分なアガロースが取り付け皿の側面領域にあふれ出るようにします。LMPアガロースが固まるまで約5分待ってから、皿に埋込用培地を加えます。これで、胚を光変換する準備が整いました。光変換を行うには、405、488、および561ナノメートルのレーザー光源を備えた直立共焦点顕微鏡で、透過白色光と対物レンズを使用して胚の心臓を特定します。561ナノメートルのレーザーを用いて、赤い楓の蛍光を確認します。次に、488ナノメートルのレーザーを使用して心内膜を視覚化します。次に、顕微鏡取得ソフトウェアでFRAPモードに入ります。次に、488ナノメートルレーザーと561ナノメートルレーザーの両方に約1%のレーザー出力を選択します。対象平面に着目しながら、対象領域 (ROI) を選択します。次に、405ナノメートルのダイオードレーザーを25%のレーザー出力で使用して、細胞を光変換し、ROIを3回スキャンします。ROIで光変換が不十分な楓の場合は、その領域で405ナノメートルのレーザーを再度3回スキャンします。ソフトウェアでTCS SP8モードに戻り、561ナノメートルレーザーと488ナノメートルレーザーを順番に使用して、双方向モードでZスタックを取得します。光変換後、ガラスピペットを使用して胚の頭のすぐ上をわずかに押し下げ、LMPアガロースを切断します。その後、胚をやさしく吸い上げます。BDM含有培地を洗い流すには、ガラスピペットから胚をPTUを含む胚培地を含む85mmシャーレに排出します。PTUを含む胚培地を含む6ウェルプレートのウェルに胚を移します。このステップでは、どの胚がどの井戸に入るかを記録しておくと、これは後の発生段階で光変換された細胞の位置を相関させるために不可欠であるためです。胚がBDM含有培地から取り出されたので、約5分後には心臓が再び鼓動し始めるはずです。胚を摂氏28.5度の暗闇に戻して、正常に発達し続けるようにします。目的の段階で、このビデオの前半で示したように、心臓を停止して胚を再度埋め込みますが、重要な違いは、胚を追跡するために、胚を別々のマークされた皿でBDMで処理する必要があることです。62 hpfまでの胚の場合、赤色および緑色の蛍光シグナルに対してそれぞれ561ナノメートルおよび488ナノメートルを使用して心内膜のZスタックを取得します。62 hpfより古い胚の場合、488ナノメートルのレーザーの代わりに940ナノメートルに設定された多光子レーザーを使用して、緑色の楓を画像化します。48 hpf未満の胚の場合、3次元AVCを2次元画像に投影して分析することができます。まず、画像をしきい値にします。次に、ハートの外側にあるポイントを消去します。手動セグメンテーションを実行するには、左側の画像を右側の画像と一致するように向きを変えます。オレンジ色のベクトルが通過するハートの側面をセグメント化し、青色のベクトルの方向に点を追加します。次に、断面を補間し、色の強度を表面に投影します。最後に、AVC の向きを調整し、2D サーフェスに投影します。48 hpfでの光変換直後の胚心臓の例をここに示します。AVCの上側のいくつかの細胞の細胞質Kaedeは、緑色から赤色に変換されています。80 hpfの同じ胚では、光変換された細胞が増殖し、上房室弁の内側に移動したことは明らかです。心房と心室のEdCが光変換された36 hpfの胚の例をここに示します。その後、AVCは視覚化と分析を容易にするために2次元に投影され、2つの光変換された領域間の距離を定量化できます。この手順を試みるときは、正常な発達に影響を与えないように、心臓が停止する時間を最小限に抑えることが重要です。練習を重ねれば、事前に準備をすれば、約30分以内に写真変換を完了することができます。このビデオを見れば、生きたゼブラフィッシュの胚で光変換後に心内膜細胞を追跡し、データセットを分析する方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

ゼブラフィッシュ胚の心臓の免疫染色を実施する迅速な方法が説明されています。全体のマウント免疫染色の手法に比べ、この方法は劇的に非常に低下処理時間内に心臓の細胞/細胞内構造を明らかに高解像度の画像を得ることができる抗体の浸透を、増加させる。...

ディテールに秘められたゼブラフィッシュ胚心臓の免疫染色

本稿では、生きたゼブラフィッシュ胚において光変換性蛍光タンパク質（PCFPs）を光活性化スイッチさせ、さらに発生の特定の時点において光変換されたタンパク質を追跡する方法を提示します。この手法により、生きた脊椎動物個体におけるさまざまな発生過程の根底にある細胞生物学的イベントのモニタリングが可能になります。...

ゼブラフィッシュの開発時Photoconvertibleタンパク質を用いた細胞トラッキング

ここで説明するには、ゼブラフィッシュ胚における組織特異的な蛍光の半自動イメージングのためのプロトコルです。...

ゼブラフィッシュ胚における組織特異的蛍光の半自動イメージング

ここでは、蛍光蛋白質、Eos、生きている動物の表現する特定の領域に紫外線暴露により光電セルを達成する方法を表示するためのプロトコルを提案する.

生活そのままゼブラフィッシュの単一セルの光電

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ゼブラフィッシュ初期胚および腫瘍の細胞の電気的活動の可視化

4 次元 (4-d) ゼブラフィッシュで心の開発を視覚化するためのプロトコルを紹介します。4 D イメージング、光シート蛍光顕微鏡 (LSFM) は、開発の心を再構築する時間を 3 次元 (3 D) 画像を引き継ぎます。質的にも量的そのせん断応力が心臓の肉を推進室開発時に心内膜 Notch...

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ゼブラフィッシュ胚における高速心臓ダイナミクスの光シート顕微鏡

このプロトコルはゼブラフィッシュの幼虫の心臓収縮機能を調査し、細胞追跡および相互分析によって心臓力学に洞察を得るのにライトシートイメージ投射を利用する。...

ゼブラフィッシュの心臓収縮の4Dライトシートイメージング

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚の心臓形態と機能を評価するための低コストの光学顕微鏡法を説明しており、高度なイメージングシステムを必要とせずに発生性心毒性の再現性評価を可能にします。...

標準顕微鏡とビデオ分析を使用したゼブラフィッシュ胚の機能的心臓イメージング: 環境および生物医学研究への応用

細胞および組織中のタンパク質レベルは、多くの場合、緊密にタンパク質産生及びクリアランスのバランスによって調節される。光変換した後、蛍光減衰（FDAP）を使用して、タンパク質のクリアランス速度は、実験的にin vivoで測定することができる。...

光変換後の蛍光減衰を使用して生活ゼブラフィッシュ胚におけるタンパク質の安定性の測定（FDAP）

学ぶ 心内膜細胞の追跡法を、Kaede蛍光タンパク質の光変換とライブイメージングを用いてゼブラフィッシュ胚で行う方法です。この技術は急速な心拍による撮影困難を克服し、房室管や心臓弁形成時の細胞挙動を詳細に観察できます。

ゼブラフィッシュ胚における細胞光電を介して次の心内膜組織運動

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