Name: BIBAC GW バイナリ ベクトルを使用してシングル コピー挿入と遺伝子組換え植物を生成します。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: 学ぶBIBAC-Gatewayベクターを用いたシングルコピーT-DNA挿入による遺伝子組換えアラビドプシス植物の作製法。安定した遺伝子発現と挿入配列の完全性を確保する効率的な植物バイオテクノロジー手法です。

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この研究は、オランダ技術財団 STW (12385) オランダ組織科学的研究 (NWO) の一部であるし、するが部分的で、経済情勢の大臣 (MS に OTP グラント 12385) 資金を供給によってサポートされます。 我々 は pCH20、BIBAC GW ベクトルのバックボーンを提供するキャロル ・ マクゴーギー ・ ハミルトン (コーネル大学、米国) をありがちましょう。

<ol><li>Jorgensen, R. A., Cluster, P. D., English, J., Que, Q., Napoli, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chalcone+synthase+cosuppression+phenotypes+in+petunia+flowers%3A+comparison+of+sense+vs.+antisense+constructs+and+single-copy+vs.+complex+T-DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences.</a> Plant Mol Biol. 31 (5), 957-973 (1996).</li>
<li>Stam, M., et al. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1046/j.1365-313X.1997.12010063.x">Post-transcriptional silencing of chalcone synthase in Petunia by inverted transgene repeats.</a> Plant J. 12, 63-82 (1997).</li>
<li>Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N., Kooter, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position-dependent+methylation+and+transcriptional+silencing+of+transgenes+in+inverted+T-DNA+repeats%3A+implications+for+posttranscriptional+silencing+of+homologous+host+genes+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Position-dependent methylation and transcriptional silencing of transgenes in inverted T-DNA repeats: implications for posttranscriptional silencing of homologous host genes in plants.</a> Mol Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).</li>
<li>Jin, Y., Guo, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgene-induced+gene+silencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgene-induced gene silencing in plants.</a> Methods Mol Biol. 1287, 105-117 (2015).</li>
<li>Oltmanns, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.plantphysiol.org/content/152/3/1158">Generation of Backbone-Free, Low Transgene Copy Plants by Launching T-DNA from the Agrobacterium Chromosome 1[W][OA].</a> Plant Physiol. , (2010).</li>
<li>Ye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+production+of+single+copy+backbone-free+transgenic+plants+in+multiple+crop+species+using+binary+vectors+with+a+pRi+replication+origin+in+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced production of single copy backbone-free transgenic plants in multiple crop species using binary vectors with a pRi replication origin in Agrobacterium tumefaciens.</a> Transgenic Res. , (2011).</li>
<li>Hamilton, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+binary-BAC+system+for+plant+transformation+with+high-molecular-weight+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular-weight DNA.</a> Gene. 200 (1-2), 107-116 (1997).</li>
<li>Frary, A., Hamilton, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+and+stability+of+high+molecular+weight+DNA+transformation%3A+an+analysis+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato.</a> Transgenic Res. 10 (2), 121-132 (2001).</li>
<li>Vega, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+maize+%28Zea+mays%29+with+Cre-lox+site+specific+recombination+cassettes+in+BIBAC+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of maize (Zea mays) with Cre-lox site specific recombination cassettes in BIBAC vectors.</a> Plant Mol Biol. 66 (6), 587-598 (2008).</li>
<li>Anggoro, D. T., Tark-Dame, M., Walmsley, A., Oka, R., de Sain, M., Stam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BIBAC-GW-based+vectors+for+generating+reporter+lines+for+site-specific+genome+editing+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">BIBAC-GW-based vectors for generating reporter lines for site-specific genome editing in planta.</a> Plasmid. 89, 27-36 (2017).</li>
<li>Hamilton, C. M., Frary, A., Lewis, C., Tanksley, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transfer+of+intact+high+molecular+weight+DNA+into+plant+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9975-9979 (1996).</li>
<li>Belele, C. L., Sidorenko, L., Stam, M., Bader, R., Arteaga-Vazquez, M. A., Chandler, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+tandem+repeats+are+sufficient+for+paramutation-induced+trans-generational+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Specific tandem repeats are sufficient for paramutation-induced trans-generational silencing.</a> PLoS Genet. 9 (10), e1003773(2013).</li>
<li>Shizuya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+stable+maintenance+of+300-kilobase-pair+fragments+of+human+DNA+in+Escherichia+coli+using+an+F-factor-based+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).</li>
<li>Shi, X., Zeng, H., Xue, Y., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pair+of+new+BAC+and+BIBAC+vectors+that+facilitate+BAC%2FBIBAC+library+construction+and+intact+large+genomic+DNA+insert+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A pair of new BAC and BIBAC vectors that facilitate BAC/BIBAC library construction and intact large genomic DNA insert exchange.</a> Plant Methods. 7, 33(2011).</li>
<li>Woodman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+PCR+of+Intact+Bacteria+%28Colony+PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR).</a> Curr Protoc Microbiol. , A.3D.1-A.3D.7 (2016).</li>
<li>Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mol+Biol%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mol Biol.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 1, (2003).</li>
<li>Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+rapid+method+for+the+preparation+of+plant+genomic+DNA+for+PCR+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis.</a> Nucleic Acids Res. 19 (6), 1349(1991).</li>
<li>Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cetyltrimethyl+ammonium+bromide+%28CTAB%29+DNA+miniprep+for+plant+DNA+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) DNA miniprep for plant DNA isolation.</a> Cold Spring Harb Protoc. (3), (2009).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923 (2012).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="https://www.cshlpress.com/default.tpl?cart=1522085010728111106&fromlink=T&linkaction=full&linksortby=oop_title&--eqSKUdatarq=934">Molecular Cloning</a>. , CSH Press. (2012).</li>
<li>Sosa, J. M. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac50056a031?journalCode=ancham">Chromatography with Sephadex Gels.</a> Anal Chem. 52 (6), 910-912 (1980).</li>
<li>Depicker, A., Stachel, S., Dhaese, P., Zambryski, P., Goodman, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nopaline+synthase%3A+transcript+mapping+and+DNA+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Appl+Genet%22%5BJournal%5D)">Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence.</a> J Mol Appl Genet. 1 (6), 561-573 (1982).</li>
<li>Feng, J., Vick, B. A., Lee, M. K., Zhang, H. B., Jan, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+BAC+and+BIBAC+libraries+from+sunflower+and+identification+of+linkage+group-specific+clones+by+overgo+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Theor+Appl+Genet%22%5BJournal%5D)">Construction of BAC and BIBAC libraries from sunflower and identification of linkage group-specific clones by overgo hybridization.</a> Theor Appl Genet. 113 (1), 23-32 (2006).</li>
<li>Lee, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+plant-transformation-competent+BIBAC+library+and+genome+sequence+analysis+of+polyploid+Upland+cotton+%28Gossypium+hirsutum+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Construction of a plant-transformation-competent BIBAC library and genome sequence analysis of polyploid Upland cotton (Gossypium hirsutum L).</a> BMC Genomics. 14, 208(2013).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+insert+Thellungiella+halophila+BIBAC+library+for+genomics+and+identification+of+stress+tolerance+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A large insert Thellungiella halophila BIBAC library for genomics and identification of stress tolerance genes.</a> Plant Mol Biol. 72 (1-2), 91-99 (2010).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+BAC-+and+BIBAC-based+physical+map+of+the+soybean+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A BAC- and BIBAC-based physical map of the soybean genome.</a> Genome Res. 14 (2), 319-326 (2004).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+physical+mapping+from+large-insert+clones+by+fingerprint+analysis+with+capillary+electrophoresis%3A+a+robust+physical+map+of+Penicillium+chrysogenum%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Genome physical mapping from large-insert clones by fingerprint analysis with capillary electrophoresis: a robust physical map of Penicillium chrysogenum.</a> Nucleic Acids Res. 33 (5), e50(2005).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+physical+mapping+of+polyploids%3A+a+BIBAC+physical+map+of+cultivated+tetraploid+cotton%2C+Gossypium+hirsutum+L%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genome physical mapping of polyploids: a BIBAC physical map of cultivated tetraploid cotton, Gossypium hirsutum L.</a> PLoS One. 7 (3), e33644(2012).</li>
<li>Frary, A., Hamilton, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+and+stability+of+high+molecular+weight+DNA+transformation%3A+An+analysis+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: An analysis in tomato.</a> Transgenic Res. , (2001).</li>
<li>Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N. M., Kooter, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position-Dependent+Methylation+and+Transcriptional+Silencing+of+Transgenes+in+Inverted+T-DNA+Repeats%3A+Implications+for+Posttranscriptional+Silencing+of+Homologous+Host+Genes+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Position-Dependent Methylation and Transcriptional Silencing of Transgenes in Inverted T-DNA Repeats: Implications for Posttranscriptional Silencing of Homologous Host Genes in Plants.</a> Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).</li>
<li>Głowacka, K., Kromdijk, J., Leonelli, L., Niyogi, K. K., Clemente, T. E., Long, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+new+and+established+methods+to+determine+T-DNA+copy+number+and+homozygosity+in+transgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Environ%22%5BJournal%5D)">An evaluation of new and established methods to determine T-DNA copy number and homozygosity in transgenic plants.</a> Plant Cell Environ. 39 (4), 908-917 (2016).</li>
<li>Stefano, B., Patrizia, B., Matteo, C., Massimo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverse+PCR+and+Quantitative+PCR+as+Alternative+Methods+to+Southern+Blotting+Analysis+to+Assess+Transgene+Copy+Number+and+Characterize+the+Integration+Site+in+Transgenic+Woody+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Genet%22%5BJournal%5D)">Inverse PCR and Quantitative PCR as Alternative Methods to Southern Blotting Analysis to Assess Transgene Copy Number and Characterize the Integration Site in Transgenic Woody Plants.</a> Biochem Genet. 54 (3), 291-305 (2016).</li>
</ol>

著者はない競合する金銭的な利益やその他の利害の関係を宣言します。

生成する重要な遺伝子組み換え transgene の 1 つ、そのまま統合は使用バイナリ ベクトルの選択です。BIBAC 家族のベクトルは、種植物多く23,24,25,26,27,28に興味のシーケンスを提供する使用されています。BIBAC ベクトル、BIBAC-GW を含む高効率単一コピーの統合をもたらす: 1 行挿入の平均数は 1.5 に 2、最も一般的に使用されるバイナリ ベクトル5,9,の 3 以上を比較29. BIBAC GW ベクトル他 BIBAC ...

遺伝子組換え植物を生成、するとき通常目的は安定を表明した統合された transgene(s) を持つことです。これは、そのままシングル コピー transgene の統合によって達成できます。複数の統合は、遺伝子サイレンシングにも、遺伝子の発現増加につながることができます。遺伝子のサイレンシングは挿入されたシーケンスはタンデムまたは反転繰り返し1,2,3,4に配置された場合に生じやすい。バイナリのベクトル、アグロバクテリウムのシャトルとして使用されます-植物ゲノムに興味のシーケンスを提供する変換実験を介する。植物のゲノムに統合の数はアグロバクテリウム5,6.にバイナリのベクトルのコピー数に依存多くの一般的に使用されるバイナリ ベクトル高いコピー ベクトル、したがって高の平均遺伝子コピー数をもたらす:シロイヌナズナ53.3 4.9 にコピーします。
T DNA の統合の数は、BIBAC7などまたはA. 根頭がんしゅ病菌染色体5T DNA を起動することにより、 A. 根頭がんしゅ病菌で低コピー数を持つバイナリのベクトルを使用して下げることが。このような場合の transgene の統合の平均数は 25,8,9,10以下です。あることが原因シングル コピー A. 根頭がんしゅ病菌で、大腸菌、BIBAC 誘導体が維持し、150 kb11と同じ大きさの構造を提供します。
GW 互換 BIBAC ベクトル10、12は、ゲートウェイのクローン作成を使用してベクターに興味の遺伝子の簡単な紹介を許可します。ゲートウェイ技術を使用するクローンの手順を大幅に簡略化、大規模な低コピー数ベクトル13,14, 低 DNA 収量などユニークな制限の限られた選択に関連付けられている一般的な問題の解決にも7,11のクローンを作成できるサイト。グルホシネート アンモニウム (pBIBAC-バー-GW) にどちらかの抵抗性または種皮 (pBIBAC RFP GW) 植物 (図 1)10,12で選択した DsRed 蛍光 pBIBAC GW 誘導体があります。両方のベクトルのカナマイシン耐性遺伝子は、細菌の選択マーカーとして使用されます。
PBIBAC GW ベクトルを組み合わせる: (1) 簡単なデザインと大腸菌、および (2) そのままシングル コピー統合planta で高効率で遺伝子操作。単一を運ぶ遺伝子組換え植物のおよそ半分とシロイヌナズナにおける平均 1.7 インテグレーションの pBIBAC GW ベクトル収量は T-DNA10を統合されています。
遺伝子を安定に発現は、ほとんど遺伝子組み換え生成のための要件です。遺伝子発現の安定は、そのまま、単一コピーの統合によって実現できます。そのまま、単一コピーの統合を運ぶ遺伝子組換え植物の使用は、しかし、さらに重要な場合たとえば、目的これらの依存性や修復、組み換え、変異などのクロマチンによるプロセスの効率化を研究することですゲノムの位置と挿入部位のクロマチン構造上のプロセス。我々 の関心ローカル ゲノム コンテキストに関する監督オリゴヌクレオチド変異 (ODM) の依存性を研究する突然変異遺伝子のままに、単一コピーの統合記者行のセットだった生成された (図 2)10。この行セットを使用して、むしろ似ている遺伝子発現レベルにもかかわらず、ゲノムの異なる場所で統合された形質転換における遺伝子座間の ODM 効率が異なることが示されました。

<table><tbody><tr><td>カナマイシン硫酸塩一水和物</td><td>デュチェファ</td><td>K0126</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン硫酸塩</td><td>デュチェファ</td><td>G0124</td><td></td></tr><tr><td>リファンピシン</td><td>デュチェファ</td><td>R0146</td><td></td></tr><tr><td>テトラサイクリン塩酸塩</td><td>Sigma</td><td>T-3383</td><td></td></tr><tr><td>DB3.1 コンピテントセル</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>11782-018</td><td>代わりに、Invitrogen の One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) またはその他の ccdB 耐性 E. coli 株を使用できます。&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>DH10B コンピテントセル</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>18290-015</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR clonase enzyme mix&nbsp;</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>11791-019</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸三ナトリウム二水和物</td><td>Merck</td><td>106432</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 二ナトリウム二水和物</td><td>Duchefa</td><td>E0511</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>バクトトリプトン</td><td>BD</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出物</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Honeywell Fluka</td><td>13423</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>メルク</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-グルコース一水和物</td><td>メルク</td><td>108346</td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーションキュベット、0.1 cm ギャップ</td><td>Biorad</td><td></td><td></td>1652089</tr><tr><td>エレクトロポレーター 遺伝子パルサー</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム七水和物</td><td>Calbiochem</td><td>442613</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-マルトース一水和物 90%</td><td>Acros Organics</td><td>32991</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0138454</td><td></td></tr><tr><td>村重Skoog medium</td><td>Duchefa</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>グルホシネート-アンモニウム (バスタ)</td><td>Bayer</td><td>79391781</td><td></td></tr><tr><td>制限酵素</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>臭化エチジウム</td><td>Bio-Rad</td><td>1610433</td><td></td></tr><tr><td>電気泳動システム</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水</td><td>酸化ナトリウムメルク</td><td>106498</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>メルク</td><td>100316</td><td></td></tr><tr><td>ブロッティング ナイロン メンブレン Hybond N+</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15358</td><td>または GE Healthcare Life Sciences (RPN203B)</td></tr><tr><td>Whatman 3MM Chr blotting paper</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3030-931</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0181</td><td></td></tr><tr><td>Acetylated BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2518</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Merck</td><td>805740</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50 Coarse</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17004401</td><td>or Sephadex G-50 Medium (17004301)</td></tr><tr><td>Dextran sulfate sodium</td> salt <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Dodecyl Sulfate&nbsp;</td><td>US Biological</td><td>S5010</td><td></td></tr><tr><td>Salmon Sperm DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7656</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二水素ナトリウム 一水和物</td><td>Merck</td><td>106346</td><td></td></tr><tr><td>Storage 蛍光体スクリーンとカセット</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9564-74</td><td></td></tr><tr><td>蛍光体イメージャー</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>Typhoon FLA 7000</td><td></td></tr><tr><td>UV 架橋剤</td><td>Stratagene</td><td>Stratalinker 1800</td><td></td></tr><tr><td>ラップフィルム (サランラップ)</td><td>Omnilabo</td><td>1090681</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>16500</td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>メルク</td><td>100165</td><td></td></tr><tr><td>DNA マーカー 'ブラウ';DNAラダー。</td><td>MRCオランダ</td><td>MCT8070</td><td></td></tr><tr><td>DNAマーカー 'ルード';DNAラダー</td><td>MRC オランダ</td><td>MCT8080</td><td></td></tr><tr><td>ヘキサヌクレオチドミックス</td><td>ロシュ</td><td>11277081001</td><td></td></tr><tr><td>ラージコンストラクトキット</td><td>キアゲン</td><td>12462</td><td></td></tr><tr><td>ヒートシール可能なポリエチレンチューブ、クリア</td><td>様々なプロバイダー</td><td></td><td>チューブの幅はブロッティングメンブレンの幅よりも広くなければなりません</td></tr><tr><td>ヒートシーラー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>メンブレンフィルターディスク</td><td>メルク</td><td>VSWP02500</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>メルク</td><td>105833</td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションメッシュ</td><td>GE ヘルスケア ライフサイエンス</td><td>RPN2519</td><td></td></tr></tbody></table>

bibac gw バイナリ ベクトルを使用してシングル コピー挿入と遺伝子組換え植物を生成します。

Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector

遺伝子組換え植物を生成、するとき一般に目的は transgene を安定に発現をしています。複数コピーの統合遺伝子サイレンシングにさらされている多くの場合と、遺伝子の 1 つ、そのまま統合が必要です。他の pBIBAC の誘導体のような細菌人工染色体 (pBIBAC GW)、に基づいてゲートウェイ互換性がある二進ベクトルは、高効率で単一コピーの遺伝子の挿入をことができます。、元の pBIBAC に改善は興味のシーケンス組み込むことが今簡単にベクトル転送 DNA (T-DNA) ゲートウェイを複製して、ゲートウェイ カセットは pBIBAC GW にクローン化されています。一般的 pBIBAC GW と変換結果 0.2 – 0.5 の効率 %、T DNA のままのシングル コピー統合を運ぶ、遺伝子組み換えの半分という。グルホシネート アンモニウム抵抗または種皮の植物では、選択した DsRed 蛍光と細菌の選択項目としてカナマイシン抵抗 pBIBAC GW ベクトルがあります。ここでは、一連のプロトコルが表示 pBIBAC GW を用いたトランスジェニック植物を生成するプロセスを介してリーダーを指導: 選択するの変換を植物の pBIBAC GW ベクトルに興味のシーケンスを再結合から始まってアグロバクテリウム、各種、遺伝子組み換え、DNA にしみが付くことを使用して挿入のイヌイットとコピーの数のための植物をテストします。注目は、単一および複数の座位でシングルとマルチ コピー統合を認識する DNA あぶらとり戦略の設計に与えられます。

生成された10BIBAC GW システムを使用して、植物の ODM を勉強するため記者構造だった構造は、ゲートウェイ エントリ ベクトル力がある pENTR gm12に設計され、pBIBAC-バー-GW (図 1) ゲートウェイ LR 再結合反応を利用した挿入します。
シロイヌナズナの pDM19、位置 120 eYFP 読み枠で翻訳終止コドンを運ぶ mTurquoise eYFP 記者と BIBAC-バー-GW プラスミドで形質転換した (mTurquoise2 eYFP * 40) (図 2)10。合計で126 シロイヌナズナは変換 (14 ポット ポット当たり 9 植物...

PBIBAC GW バイナリ ベクトルを使用そのままシングル コピー挿入、簡単なプロセスを生成する遺伝子組換え植物になります。ここでは、一連のプロトコルは、形質転換シロイヌナズナ植物を生成し、イヌイットのための植物をテストのプロセスを介してリーダーを指導し、挿入の数がコピーされます。

BIBAC GW バイナリ ベクトルを使用してシングル コピー挿入と遺伝子組換え植物を生成します。

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the ...

この方法論の全体的な目標は、トランスファーDNA(T-DNA)の無傷の単一コピー挿入を効率的に行うトランスジェニック植物を作製することです。BIBAC-Gatewayベクターは、安定した遺伝子発現を示す目的の配列の無傷の単一コピー挿入を持つトランスジェニック植物を作製するための貴重なツールです。BIBAC-Gatewayベクターでは、Gateway組換え技術を使用して、最小限の労力で目的の配列を挿入できます。BIBAC-Gatewayベクターを含むすべてのBIBAC誘導体は、大きなトランスジェニックDNA断片を植物ゲノムに転写するのに適しています。BIBAC-GWベクターは、トウモロコシ、イネ、トマトなど、多くの植物系に目的の配列を挿入するために使用できます。BIBAC-GWプラスミドは2種類あります。BIBAC-RFP-GW プラスミドには、種皮で発現する DsRed 遺伝子が含まれています。BIBAC-BAR-GW プラスミドには、グルホシネートに対する耐性を提供する遺伝子が含まれています。どちらのベクターにも、細菌の選択マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子が含まれています。対象のシーケンスをバイナリベクトルに挿入するには、まず、テキストプロトコルで説明されているように、Gateway Entryとバイナリベクトルを準備します。Gateway反応を行うには、サプライヤーの提案に従って、室温で1.5ミリリットルの微量遠心チューブでLR組換え反応を調製します。100〜300ナノグラムのスーパーコイルEntryクローンと300ナノグラムのBIBAC-Gatewayベクターを混合します。TEを使用して、混合物の容量を16マイクロリットルに調整します。最後に、LRクロナーゼ酵素ミックスを4マイクロリットル加え、ボルテックスして混合します。混合物を摂氏25度で1時間インキュベートします。混合物に2マイクロリットルのプロテイナーゼK溶液を加えてLR反応を終了します。混合し、摂氏37度で10分間インキュベートしてから、テキストプロトコルに記載されているように、大腸菌への形質転換に進みます。シロイヌナズナの植物を形質転換に備えるには、シロイヌナズナの植物が開花するまで、温室または温度制御された成長室で植物を育てます。最初のボルトをクリップして、より多くのセカンダリボルトが出現できるようにします。植物は、刈り取りの4〜6日後、植物が未熟な花の頭が多く、施肥されたシリックがあまりない場合に浸す準備ができています。花の浸漬を行うには、花序をアグロバクテリウム懸濁液に5〜10秒間浸します。穏やかに攪拌してください。植物の地上部をラップフィルムで包んで湿度を高く保ち、植木鉢を箱で覆って植物を暗く保ちます。温室または成長室で植物を2日間インキュベートします。2日後、ボックスとラップフィルムを取り外し、温室または成長室で植物を成熟まで育てます。形質転換の効率を高めるために、同じプラントを最初の浸漬から7日後に再浸漬することができます。次に、形質転換した植物が成熟して乾いたら、種子を収穫します。同じ構成体で形質転換した植物の種子を1つのセットとしてプールして分析します。BIBAC-RFP-Gatewayプラスミド誘導体で植物を形質転換する場合は、蛍光顕微鏡を用いて種子を分析し、トランスジェニック植物を同定します。種皮中のDsRed発現を検出するには、560ナノメートルの励起と600〜650ナノメートルの発光で種子をイメージングします。鉗子を使用して、蛍光性種子を非蛍光性対応物から分離します。BIBAC-BAR-Gatewayプラスミド誘導体で形質転換したトランスジェニック植物をスクリーニングするには、土壌で満たされたトレイに種子を播種します。0.5倍MS培地中の0.1%寒天に種子を懸濁し、1ミリリットルのピペットを使用して種子を広げることにより、トレイ上に種子が均一に広がるようにします。種子を摂氏4度で少なくとも2日間インキュベートすることにより、種子が同期して発芽するように刺激します。これは、種を蒔く前または後に行うことができます。種を蒔いてから2〜3週間後に、苗に0.5%グルホシネート-アンモニウム溶液を噴霧します。1平方メートルあたり500ミリリットルのグルホシネート-アンモニウム溶液を使用してください。生き残った苗を鉢に移します。グルホシネート-アンモニウム耐性植物をPCRにより分析し、目的のコンストラクトの存在を確認します。制限酵素を用いたDNAブロッティングにより、T-DNAの組み込み数とその完全性を決定します。この方法により、ゲノム内の同じ遺伝子座または異なる遺伝子座での単一の組み込みおよび反復的な組み込みを同定できます。一連の制限ダイジェストを使用して、可能なさまざまな統合パターンを特定します。T-DNAの途中で一度切断する酵素を選択すると、制限部位の上流と下流の配列を独立してプローブできます。また、目的の配列全体を一度に切り出す酵素または酵素の組み合わせを選択します。シトシンメチル化に感受性のない制限酵素のみを使用するように注意してください。DNAブロッティングを実施した後、テキストプロトコールに詳述されているように、ブロット分析を実施します。分析は、使用する制限戦略によって異なります。T-DNAの中央に1つの制限部位を持つ戦略を使用してブロットを解析する場合は、検出されたフラグメントの数をカウントします。この戦略では、ハイブリダイズフラグメントの数はT-DNA統合の数を示唆しています。T-DNAの左側と右側のプローブで検出されたフラグメントの数を比較します。2つのプローブで異なる数のハイブリダイジングフラグメントが検出された場合、逆反復で複数のT-DNAが組み込まれているか、または不完全に組み込まれたT-DNAが存在します。T-DNAのタンデム配列および逆配列を同定するには、マーカーバンドのサイズに基づいてブロット上のハイブリダイジングフラグメントのサイズを推定し、その推定サイズを制限戦略に基づいて計算された予想されるフラグメントサイズと比較します。目的のトランスジェニック配列が損なわれていないかどうかを確認するには、目的の配列の末端に制限部位を使用して、戦略に従って調製したブロットを分析します。マーカーバンドのサイズに基づいてブロット上のハイブリダイジングフラグメントのサイズを推定し、予想されるサイズと比較します。そのまま挿入すると、定義された長さの 1 つのフラグメントが生成されます。予想される長さからの偏差は、統合が不完全であることを示します。T-DNA統合の数とインタクト性を決定するためのDNA制限とブロッティング戦略が示されています。ScaI制限サイトでは、レポーター配列を、バー用プローブ使用時に検出される左境界近位部と、eYFP用プローブ使用時に検出される右境界近位部に分けています。BglIIおよびPciI制限部位は、レポーターコンストラクトの外側のT-DNA内に位置しています。二重消化では、定義されたサイズのフラグメントが得られ、偏差がある場合は挿入が不完全であることを示します。同定されたハイブリダイジングフラグメントの数は、T-DNA挿入の数を反映しています。ScaIで消化された9種類のトランスジェニックのゲノムDNAを含む1つのブロットを、barおよびeYFPのプローブとハイブリダイズしました。いくつかのレーンは、単一のT-DNA統合によるトランスジェニックを示しています。レーン 4 には、バー付きの 2 つのフラグメントと eYFP 付きの 1 つのフラグメントが表示され、eYFP シーケンスの切り捨てまたは右の境界付近での反転リピートを示しています。レーン 6 には、bar と eYFP の 2 つのフラグメントが表示されます。1つのフラグメントは、バープローブに対して弱い強度を持っています。もう1つのフラグメントは強度が高く、2つのT-DNA挿入を示しており、そのうちの1つは切断されています。このビデオを見れば、Gateway組換えを使用して目的のDNA配列をBIBAC-GWバイナリベクターに組み込む方法、シロイヌナズナの形質転換、スクリーニング、T-DNA統合数とその完全性の評価について十分に理解できるはずです。トランスジェニック植物の作製と特性評価には時間がかかります。BIBAC-Gatewayをバイナリベクターとして使用すると、そのままのシングルコピー統合でトランスジェニックを同定するプロセスを短縮できます。BIBAC誘導体で生成されたトランスジェニックの約半分は、無傷のシングルコピー統合を持っています。一般に、一般的なバイナリベクターを使用して生成された多くのトランスジェニック植物が、遺伝子サイレンシングを示す導入遺伝子の切り捨てられたコピーを持っていることに、個体は気づいていません。BIBAC誘導体では、生成されたトランスジェニック植物のほとんどが、遺伝子サイレンシングをほとんど示さない導入遺伝子の単一の統合を無傷で保持します。BIBAC-GWをトランスジェニックスの生成に使用する場合、BIBAC誘導体の全体的な形質転換効率は一般的に使用されるバイナリーベクターよりも低いため、十分な数の植物材料を形質転換することが重要です。BIBAC-GWの形質転換効率は一般に0.2%から0.5%の間です無傷のシングルコピーT-DNA統合を運ぶトランスジェニック植物を同定した後、必要に応じて、T-DNA挿入の正確なゲノム位置を定義するためにさらなる分析を行うことができます。無傷のシングルコピーインテグレーションを持つトランスジェニックスは、導入遺伝子の発現レベルが同等であることを示しています。このことは、ゲノム内のT-DNAの統合位置が導入遺伝子の発現レベルにほとんど影響を与えないことを示しています。

generating-transgenic-plants-with-single-copy-insertions-using-bibac

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Genetics

遺伝学

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誘導、細胞型における発現シロイヌナズナLhGR を介したトランス-活性化

秋のミズ、 スポドプテラ・フルギペルダでの生殖細胞系列変換に成功し、多動 性ピギーババトランス...

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学ぶBIBAC-Gatewayベクターを用いたシングルコピーT-DNA挿入による遺伝子組換えアラビドプシス植物の作製法。安定した遺伝子発現と挿入配列の完全性を確保する効率的な植物バイオテクノロジー手法です。

BIBAC GW バイナリベクトルを使用してシングルコピー挿入と遺伝子組換え植物を生成します。

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