BIBAC GW バイナリ ベクトルを使用してシングル コピー挿入と遺伝子組換え植物を生成します。

この方法論の全体的な目標は、トランスファーDNA(T-DNA)の無傷の単一コピー挿入を効率的に行うトランスジェニック植物を作製することです。BIBAC-Gatewayベクターは、安定した遺伝子発現を示す目的の配列の無傷の単一コピー挿入を持つトランスジェニック植物を作製するための貴重なツールです。BIBAC-Gatewayベクターでは、Gateway組換え技術を使用して、最小限の労力で目的の配列を挿入できます。

BIBAC-Gatewayベクターを含むすべてのBIBAC誘導体は、大きなトランスジェニックDNA断片を植物ゲノムに転写するのに適しています。BIBAC-GWベクターは、トウモロコシ、イネ、トマトなど、多くの植物系に目的の配列を挿入するために使用できます。BIBAC-GWプラスミドは2種類あります。

BIBAC-RFP-GW プラスミドには、種皮で発現する DsRed 遺伝子が含まれています。BIBAC-BAR-GW プラスミドには、グルホシネートに対する耐性を提供する遺伝子が含まれています。どちらのベクターにも、細菌の選択マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子が含まれています。

対象のシーケンスをバイナリベクトルに挿入するには、まず、テキストプロトコルで説明されているように、Gateway Entryとバイナリベクトルを準備します。Gateway反応を行うには、サプライヤーの提案に従って、室温で1.5ミリリットルの微量遠心チューブでLR組換え反応を調製します。100〜300ナノグラムのスーパーコイルEntryクローンと300ナノグラムのBIBAC-Gatewayベクターを混合します。

TEを使用して、混合物の容量を16マイクロリットルに調整します。最後に、LRクロナーゼ酵素ミックスを4マイクロリットル加え、ボルテックスして混合します。混合物を摂氏25度で1時間インキュベートします。混合物に2マイクロリットルのプロテイナーゼK溶液を加えてLR反応を終了します。

混合し、摂氏37度で10分間インキュベートしてから、テキストプロトコルに記載されているように、大腸菌への形質転換に進みます。シロイヌナズナの植物を形質転換に備えるには、シロイヌナズナの植物が開花するまで、温室または温度制御された成長室で植物を育てます。最初のボルトをクリップして、より多くのセカンダリボルトが出現できるようにします。

植物は、刈り取りの4〜6日後、植物が未熟な花の頭が多く、施肥されたシリックがあまりない場合に浸す準備ができています。花の浸漬を行うには、花序をアグロバクテリウム懸濁液に5〜10秒間浸します。穏やかに攪拌してください。

植物の地上部をラップフィルムで包んで湿度を高く保ち、植木鉢を箱で覆って植物を暗く保ちます。温室または成長室で植物を2日間インキュベートします。2日後、ボックスとラップフィルムを取り外し、温室または成長室で植物を成熟まで育てます。

形質転換の効率を高めるために、同じプラントを最初の浸漬から7日後に再浸漬することができます。次に、形質転換した植物が成熟して乾いたら、種子を収穫します。同じ構成体で形質転換した植物の種子を1つのセットとしてプールして分析します。

BIBAC-RFP-Gatewayプラスミド誘導体で植物を形質転換する場合は、蛍光顕微鏡を用いて種子を分析し、トランスジェニック植物を同定します。種皮中のDsRed発現を検出するには、560ナノメートルの励起と600〜650ナノメートルの発光で種子をイメージングします。鉗子を使用して、蛍光性種子を非蛍光性対応物から分離します。

BIBAC-BAR-Gatewayプラスミド誘導体で形質転換したトランスジェニック植物をスクリーニングするには、土壌で満たされたトレイに種子を播種します。0.5倍MS培地中の0.1%寒天に種子を懸濁し、1ミリリットルのピペットを使用して種子を広げることにより、トレイ上に種子が均一に広がるようにします。種子を摂氏4度で少なくとも2日間インキュベートすることにより、種子が同期して発芽するように刺激します。

これは、種を蒔く前または後に行うことができます。種を蒔いてから2〜3週間後に、苗に0.5%グルホシネート-アンモニウム溶液を噴霧します。1平方メートルあたり500ミリリットルのグルホシネート-アンモニウム溶液を使用してください。

生き残った苗を鉢に移します。グルホシネート-アンモニウム耐性植物をPCRにより分析し、目的のコンストラクトの存在を確認します。制限酵素を用いたDNAブロッティングにより、T-DNAの組み込み数とその完全性を決定します。

この方法により、ゲノム内の同じ遺伝子座または異なる遺伝子座での単一の組み込みおよび反復的な組み込みを同定できます。一連の制限ダイジェストを使用して、可能なさまざまな統合パターンを特定します。T-DNAの途中で一度切断する酵素を選択すると、制限部位の上流と下流の配列を独立してプローブできます。

また、目的の配列全体を一度に切り出す酵素または酵素の組み合わせを選択します。シトシンメチル化に感受性のない制限酵素のみを使用するように注意してください。DNAブロッティングを実施した後、テキストプロトコールに詳述されているように、ブロット分析を実施します。

分析は、使用する制限戦略によって異なります。T-DNAの中央に1つの制限部位を持つ戦略を使用してブロットを解析する場合は、検出されたフラグメントの数をカウントします。この戦略では、ハイブリダイズフラグメントの数はT-DNA統合の数を示唆しています。

T-DNAの左側と右側のプローブで検出されたフラグメントの数を比較します。2つのプローブで異なる数のハイブリダイジングフラグメントが検出された場合、逆反復で複数のT-DNAが組み込まれているか、または不完全に組み込まれたT-DNAが存在します。T-DNAのタンデム配列および逆配列を同定するには、マーカーバンドのサイズに基づいてブロット上のハイブリダイジングフラグメントのサイズを推定し、その推定サイズを制限戦略に基づいて計算された予想されるフラグメントサイズと比較します。

目的のトランスジェニック配列が損なわれていないかどうかを確認するには、目的の配列の末端に制限部位を使用して、戦略に従って調製したブロットを分析します。マーカーバンドのサイズに基づいてブロット上のハイブリダイジングフラグメントのサイズを推定し、予想されるサイズと比較します。そのまま挿入すると、定義された長さの 1 つのフラグメントが生成されます。

予想される長さからの偏差は、統合が不完全であることを示します。T-DNA統合の数とインタクト性を決定するためのDNA制限とブロッティング戦略が示されています。ScaI制限サイトでは、レポーター配列を、バー用プローブ使用時に検出される左境界近位部と、eYFP用プローブ使用時に検出される右境界近位部に分けています。

BglIIおよびPciI制限部位は、レポーターコンストラクトの外側のT-DNA内に位置しています。二重消化では、定義されたサイズのフラグメントが得られ、偏差がある場合は挿入が不完全であることを示します。同定されたハイブリダイジングフラグメントの数は、T-DNA挿入の数を反映しています。

ScaIで消化された9種類のトランスジェニックのゲノムDNAを含む1つのブロットを、barおよびeYFPのプローブとハイブリダイズしました。いくつかのレーンは、単一のT-DNA統合によるトランスジェニックを示しています。レーン 4 には、バー付きの 2 つのフラグメントと eYFP 付きの 1 つのフラグメントが表示され、eYFP シーケンスの切り捨てまたは右の境界付近での反転リピートを示しています。

レーン 6 には、bar と eYFP の 2 つのフラグメントが表示されます。1つのフラグメントは、バープローブに対して弱い強度を持っています。もう1つのフラグメントは強度が高く、2つのT-DNA挿入を示しており、そのうちの1つは切断されています。

このビデオを見れば、Gateway組換えを使用して目的のDNA配列をBIBAC-GWバイナリベクターに組み込む方法、シロイヌナズナの形質転換、スクリーニング、T-DNA統合数とその完全性の評価について十分に理解できるはずです。トランスジェニック植物の作製と特性評価には時間がかかります。BIBAC-Gatewayをバイナリベクターとして使用すると、そのままのシングルコピー統合でトランスジェニックを同定するプロセスを短縮できます。

BIBAC誘導体で生成されたトランスジェニックの約半分は、無傷のシングルコピー統合を持っています。一般に、一般的なバイナリベクターを使用して生成された多くのトランスジェニック植物が、遺伝子サイレンシングを示す導入遺伝子の切り捨てられたコピーを持っていることに、個体は気づいていません。BIBAC誘導体では、生成されたトランスジェニック植物のほとんどが、遺伝子サイレンシングをほとんど示さない導入遺伝子の単一の統合を無傷で保持します。

BIBAC-GWをトランスジェニックスの生成に使用する場合、BIBAC誘導体の全体的な形質転換効率は一般的に使用されるバイナリーベクターよりも低いため、十分な数の植物材料を形質転換することが重要です。BIBAC-GWの形質転換効率は一般に0.2%から0.5%の間です無傷のシングルコピーT-DNA統合を運ぶトランスジェニック植物を同定した後、必要に応じて、T-DNA挿入の正確なゲノム位置を定義するためにさらなる分析を行うことができます。無傷のシングルコピーインテグレーションを持つトランスジェニックスは、導入遺伝子の発現レベルが同等であることを示しています。

このことは、ゲノム内のT-DNAの統合位置が導入遺伝子の発現レベルにほとんど影響を与えないことを示しています。