Name: 原金ナノ粒子合成による急速なナノプローブ信号強調 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: 学ぶナノプローブの信号増強法。塩化金酸還元により金・銀・酸化鉄ナノ粒子で100倍の信号増幅を達成し、紙やガラス基板上のバイオセンシング感度を飛躍的に向上させる革新的手法です。

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欧州連合の第 7 フレームワーク プログラム (FP/2007-2013) の下で欧州研究評議会からの資金調達/ERC 助成契約号 615458、スウェーデン研究評議会、Pronova 優秀センター タンパク質技術 (VINNOVA - スウェーデン語イノベーション システム庁) は感謝します。

ひと血清サンプルのコレクション、すなわち国の法的および倫理的な要件に基づき得られました。倫理委員会の (または類似の) 承認とドナーから書面による同意。
1. 強化ソリューションの準備:
<ol><li>脱イオン水でナトリウム塩 MES を中断することにより 10 mM MES pH 6 バッファーを準備します。6 4 M NaOH 溶液を使用するために pH を調整します。</li>
	<li>5 mM 10 mM MES 6 pH 緩衝 (ソリューション 1) HAuCl4ソリューションを準備します。</li>
	<li>10 mM MES 6 pH 緩衝 (解決方法 2) 1.027 M H2O2ソリューションを準備します。 注: 解決方法 1 と解決方法 2 のボリュームは強化される数とマイクロ アレイのサイズに依存します。たとえば、10 × 10 mm のマイクロ アレイは、100 μ L 容量 (ソリューション 1 + 解決策 2) に確実に強化ソリューションと接触してマイクロ アレイ領域を必要です。後希釈、約 30-45 日以内の H2O2が使わなければなりません。</li>
</ol>2. ナノ粒子作製:
<ol><li>準備 40 nm の金ナノ粒子 Bastúsらで説明されているようです。16簡潔に、2.2 mM クエン酸ナトリウム (149 の mL) の沸騰溶液 1 mL の水溶液の 25 mM HAuCl4前駆体を注入します。赤ワイン色が観察されるまで待機します。種子成長ステップの種子としてナノ粒子のこのソリューションを使用します。</li>
	<li>90 ° C での種子を含む液に 25 mM HAuCl4の 1 mL に続いて 60 mM クエン酸ナトリウム 1 mL を注入します。30 分後反応は完了です。種子の生長まで手順を繰り返します 5 回 40 nm のナノ粒子が得られる、Bastúsらによる記述で。16
</li>
	<li>ナノ粒子ナノ粒子のサイズを決定するための最終的な解決の紫外可視吸光度を測定します。17また、透過電子顕微鏡 (TEM) を取得して使用できるナノ粒子のサイズを決定します。</li>
	<li>準備 90 nm AgNPs リベロらで説明されているようです。18は簡潔に、ポリ (アクリル酸ナトリウム) の積極的に撹拌した溶液に dimethylaminoborane (と) を追加 (PAA)、アグノ3。ソリューションの最終巻、50 mL と、PAA の最終的な集中とアグノ3それぞれ 1.6 mM、10 mM と 3.33 mM。 注: カルボキシル基と 50 変更 100 nm IONPs nm のカルボキシル基修飾 SiNPs を購入しました。</li>
	<li>抗体プエルタスらによって記述されたプロトコルに従うと、金ナノ粒子を付着させる目的します。19は簡単に言えば、1.2x10-9 M 金ナノ粒子溶液に COOH-ペグ-SH (5000 g·mol− 1) の 1 mg を追加 (OD 10 光密度)。12 4 M の NaOH 溶液で pH を調整します。<ol>
<li>穏やかな攪拌条件室温 (~ 22 ° C) で一晩インキュベート ソリューションをしましょう。</li>
		<li>ペグの過剰を削除するには、15 分間 13800 x g でソリューションを遠心分離します。</li>
		<li>500 μ L の脱イオン水でペレットを再懸濁します。</li>
		<li>N--(3-Dimethylaminopropyl) - n 5 μmol と PEG 修飾金ナノ粒子を孵化させなさい '-ethylcarbodiimide 塩酸塩 (EDC) と 10 mM MES ph 6 N hydroxysulfosuccinimide ナトリウム塩 (スルホ-NHS) 7.5 μmol 37 ° C で 30 分のバッファー</li>
		<li>EDC とスルホ NHS の過剰を削除するには、5 分 13800 x g で溶液を遠心分離します。</li>
		<li>500 μ L の 10 mM MES pH 6 バッファーでペレットを再懸濁します、抗体の 100 g·mL-1を追加します。解決策は 37 ° C で 2 時間インキュベートみましょう</li>
		<li>10 分間 13800 x g でソリューションを 2 回遠心分離によって抗体の過剰を削除し、500 μ L の 10 mM リン酸ナトリウム pH 7.5、0.3 M NaCl バッファーでペレットを再懸濁します。解決策は 37 ° C で 30 分間インキュベートみましょう</li>
		<li>2 回 10 分間 13800 x g でソリューションを遠心分離によって非特異的結合抗体を削除し、10 mM MES pH 6 バッファーで 500 μ L の 1% ウシ血清アルブミン (BSA) でペレットを再懸濁します。4 ° C でサンプルを一晩インキュベートします。</li>
		<li>2 回、10 分間 13800 x g でソリューションを遠心分離して 500 μ L の 10 mM MES pH 6 バッファーでペレットを再 BSA の過剰を洗います。</li>
		<li>EDC とスルホ NHS の量を適宜調整する抗体 SiNPs の 5 M AgNPs、IONPS の 0.5 mg、0.5 mg の変更用アドレスは、2.5.9 を 2.5.1 手順に従います。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 垂直流紙ベース試金:
<ol><li>マイクロ アレイを準備するには、ロボットのプリンターとニトロセルロース紙膜タンパク質 G 濃度勾配を入金します。印刷した後、室温 (~ 22 ° C) でマイクロ アレイ一晩乾燥をしましょう。</li>
	<li>フィルター ホルダーで囲まれた膜の垂直方向の流れの試金を遂行します。1 mL·min− 1の割合で超シリンジ ポンプを使用して igg 抗体修飾金ナノ粒子の 8 M ソリューションを流れ。17 M IgG 変更 AgNPs のソリューションでこの手順を繰り返します 0.1 mg·mL− 1 IgG 変更 SiNPs と 0.1 mg·mL− 1 IgG 変更 IONPs。</li>
	<li>マイクロ アレイは室温 (~ 22 ° C) で 30 分間乾燥し、4800 dpi の解像度でフラット ベッド スキャナーでスキャンができます。24 ビット カラーの TIFF ファイルとしてイメージを保存します。</li>
</ol>4. 商業ガラス ベースのアッセイを参照します。
<ol><li>120 分室温で 4 の異なる血清サンプルでアレルゲン成分検出のための 2 つのガラス スライドを孵化させなさい。</li>
	<li>脱イオン水でマイクロ アレイをすすいでください。</li>
	<li>加温 30 分抗ひと IgE と 2 番目のスライド加温室温 (~ 22 ° C) での蛍光標識抗ひと IgE 抗体と 1 つのスライド抗体修飾金ナノ粒子室温で 30 分間。</li>
	<li>脱イオン水でマイクロ アレイをすすいでください。</li>
	<li>レーザースキャニング装置と蛍光抗ひと IgE 抗体とインキュベートされたマイクロ アレイの蛍光強度を測定します。比色信号集録の卓上スキャナーで抗体修飾金ナノ粒子抗ひと IgE と培養されたマイクロ アレイをデジタル化します。</li>
	<li>デジタル化後、5 分間室温 (~ 22 ° C) で強化ソリューションとマイクロ アレイをインキュベートします。</li>
	<li>脱イオン水でセンサーを洗浄、室温 (~ 22 ° C) で 10 分間乾燥するようにし、なさい。</li>
	<li>マイクロ アレイを比色信号集録の 4800 dpi の解像度でテーブル トップのスキャナーでデジタル化します。16 ビット グレースケール TIFF ファイルの画像を保存します。</li>
</ol>5. マイクロ アレイ培養強化ソリューション:
<ol><li>事前解決方法 1 と解決方法 2 の同じ量を混合またはセンサーの表面に直接それらをミックスし、マイクロ アレイに関心のある分野が溶液の混合物で覆われていることを確認します。</li>
	<li>Let センサーを 5 分長い孵化に時間得ることができる特に紙ベースのマイクロ アレイのための高い信号/ノイズ比と同様、改良された感度の強化ソリューション室温で孵化させなさい。</li>
	<li>5 回の脱イオン水に水没してマイクロ アレイを洗い米のまま室温で乾燥します。 注: 乾燥段階の時間は、マイクロ アレイの素材によって異なります。紙ベースのマイクロ アレイの乾燥段階には約 30 分が必要です。ガラス製マイクロ アレイ乾燥約 5-10 分が必要です。</li>
</ol>6. イメージングによる解析:
<ol><li>ソフトウェア ツールで蛍光強度を分析します。センサーの製造元の使用 (DfU) の指示に従って 0.3 Isac 標準化ユニット (ISU) 以上は、すべての結果を検討してください。</li>
	<li>ソフトウェア ツールを使用して色の強度を分析します。画像ファイルを反転、各スポットの光強度を測定し、平均輝度を計算します。帳票のスポットの値を使用して、3 つの平均スポット ピクセル強度の平均として最終的な信号値を計算します。</li>
</ol>

<ol><li>Holzinger, M., Le Goff, A., Cosnier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomaterials+for+biosensing+applications%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nanomaterials for biosensing applications: a review.</a> Front. Chem. 2, 1(2014).</li>
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<li>Puertas, S., Batalla, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+Advantage+of+Unspecific+Interactions+to+Produce+Highly+Active+Magnetic+Nanoparticle-Antibody+Conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Taking Advantage of Unspecific Interactions to Produce Highly Active Magnetic Nanoparticle-Antibody Conjugates.</a> ACS Nano. 5 (6), 1-8 (2011).</li>
<li>Dias, J. T., Svedberg, G., Nystrand, M., Andersson-Svahn, H., Gantelius, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+signal+enhancement+method+for+nanoprobe-based+biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Rapid signal enhancement method for nanoprobe-based biosensing.</a> Sci. Rep. 7 (1), 6837(2017).</li>
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</ol>

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現在、ナノプローブによる検出アッセイ用信号強化技術いずれかの酵素ベース12、ターゲット検出ナノプローブ21にナノ粒子の 2 番目のセットを必要とするまたは、染色技術の場合に限られています。金ナノ粒子の検出プローブとしての AgNPs 使用。22ここでは、簡単、迅速かつ無料の酵素法はナノプローブ検出に基づく試金の信号強調のため、説明します。この方法でナノプローブの 4 種類によって提供される比色信号を向上させることが可能だった: 金ナノ粒子、AgNPs、IONPs、SiNPs。
ナノプローブのセットごとに観察された増幅率は 100 倍、強化要因の定量化が事前強化信号の欠如により不可能だった SiNPs を除いて。この増大係数ナノプローブのすべての種類で、プロトコルの効率が似ていることを示唆しています。さらに、拡張プロトコルはストック金ナノ粒子懸濁液の希釈系列が印刷された用紙サポートを行ったとき、10000-fold の増幅率が観察されました。強化、金ナノ粒子の最小の番号を持つ見える斑点に以前いた場所約 10000 ナノ粒子がプリントされた、強化後未満 10 ナノ粒子をかくまっているスポット見えるようになった。20
ここで示される拡張プロトコルの確立された条件 Au0最小限にバック グラウンド ノイズを維持しながら、信号を改善するために Au3 +の還元利用を許可しています。同様に保存されているマイクロ アレイ数ヶ月後アッセイを行った試金の実行後に右、強化を実行できます。強化ソリューションは、解決方法 1 と解決方法 2 の 1:1 の混合物で構成されています。両方のソリューションを以前混合または直接マイクロ アレイ上に戻されるときを混合できます。予混合または直接混合の違いのみ強化ソリューションの貯蔵寿命に影響を与えます。とき予混合貯蔵寿命は、5-7 日の場合は 30-45 日間に増加の予混合します。
結果の詳細な分析は、拡張メソッドがバイオ センサーの定量的解析と干渉しないことを示しています。観測強度と試料の濃度の間の相関は、(表 1) を維持しました。ガラス ベース アレルゲン成分マイクロ アレイ イムノアッセイを使用して標準的な蛍光検出と比色検出 4 事前に特徴づけられる臨床サンプルで取得したデータは、2 つの検出方法と良い一致を示した。比較平均蛍光強度 (MFI) と平均の比強度 (MCI)、平均 R2 = 0.08 ± 0.79 がデータは、両方の軸に 10 ログオンしてときに得られました。この実験では、検出のためのナノプローブを使用またはナノプローブによる検出のために適応することができる場合、拡張メソッドを市販キットに適用できることを示した。
拡張メソッドの効果は、2 つの重要な側面に依存します。解決策 1 の混合物を確保することが重要です、均質な解決策 2。均質な混合物なしセンサー強化ソリューションの分数と接触して 1 または 2 ソリューションは他に対して優勢であるなります。Au3 + Au に0強化の効率をこのように損傷の減少の効率が低下するが。また、潜伏期間中に強化ソリューションと接触してマイクロ アレイの関心の領域全体を持つことが重要です。
信号の超高感度向上を達成するために強化ソリューションで長い培養時間 (約 5 分) は必要になります。以前にブロックされた (例えばBSA、ペグ) 金の Au0と結果として形成の高速非特異的堆積しないようにする必要がありますマイクロ アレイ表面信号集録を妨害することができますバック グラウンド ノイズの開発を避けるためには、レイヤー。
拡張メソッドに制限は、アッセイの本質的な効果です。アッセイは、true-肯定的な結果に帰することができる信号強調が観察されることを確保するため、正と負のコントロールを持っている必要があります。ターゲットと、ナノプローブの非特異的相互作用がある場合信号を集録後の強化は無効になります。
その他拡張する技法は、いずれかのナノ粒子の凝集に基づく、または改良された信号集録をできる材料とナノ粒子の染色です。ナノ粒子検出地点数の収集を促進することによって信号の集録が可能か視覚的にまたは紫外-可視計測。5これらの信号化 2 段階検出システム、検体の関心と記者は最初の検出の構成要素にバインドするために必要な 2 番目のステップの最初の検出に依存します。このような戦略は、分析の種類ごとに特定の拡張プロトコル最適化の要件のための普遍性を欠いています。
銀は、ここで提示されたプロトコルのような多く、染色などの染色強化技術は、直接信号検出構造化を許可します。ただし、ここで示されるプロトコルとは異なり銀染色のみ示されている金ナノ粒子または AgNPs のいずれかに適用します。6,7,8,9
この法の適用性検出エージェントとして金ナノ粒子、AgNPs、IONPs または SiNPs を使用して任意のアッセイに及ぶ可能性が可能性があります。さらに作業は他の材料とから成るセンサーにおける法の応用を勉強を進めています。

金ナノ粒子 (結果) または酸化鉄ナノ粒子 (IONPs) などのナノ材料の使用は、感度の向上と汎用性、バイオセンシングのアプリケーションを許可しています。1容積の比率に高い表面の活用に関しての様々 な配位子を持つナノ粒子の表面の装飾のため開発された方法の茄多は、感度の向上とセンサーの設計を有効にしています。2それにもかかわらず、バイオセンシング ツール、ナノプローブ探索可能なシグナルを達成するために必要な数に依存します。場合 40 nm の金ナノ粒子は、紫外可視分光法、約 90 × 106ナノプローブを介して信号を集録する興味の対象を効果的に検出するために必要です。3このナノプローブ密度制限は、信号増幅を使用して回避できます。このような戦略4は、粒子間の凝集または初期ナノプローブの密度は、最初の時にナノプローブの 2 番目のセットを蓄積増集積に基づいて作成できます。Visual または紫外-可視信号集録、 5センサーの表面上の特定の場所でのナノ粒子の数を増やすことができます。ただし、アッセイの感度はナノ粒子ナノプローブの初期のセットの方の 2 番目のセットのターゲットの能力に本質的にリンクされます。その他の戦略は、金と銀のナノプローブの染色に依存します。6,7は染色 visual または紫外可視検出の有効化、ナノ粒子の表面に銀イオンの還元によって実現されます。8これらのメソッドは、既存のゴールドの信号を強化または銀ナノプローブ表面共鳴プラズモン増強によって信号、粒子間の凝集の方法のように二次ターゲット イベントに依存しません。ただし、銀染色法は、金や銀のナノプローブの使用でのみ報告されています。8,9
2005 年に Zayatsら。10は、表面プラズモン共鳴信号を増加させる金ナノプローブの表面に Au イオンの還元を報告しました。この酵素に依存した作業で塩化セチルトリメチル アンモニウム塩化金酸の減少を許可ならびグルコース酸化酵素触媒による過酸化水素が生成されました。
最近では王ら。既存ナノプローブの表面に金の層が生成される強調法を報告しました。11これら拡大ナノプローブはペルオキシダーゼ様活性基板 3 ', 5, 5 '-テトラメチルベンチジン (TMB) 肉眼で明るい青の色の可視化を有効にすると表示されます。
スティーブンスらプラズモニック ELISA アッセイの開発を報告しました。過酸化水素を含む溶液に浸漬されたセンサーその後センサーで培養されたカタラーゼと標識二次抗体は伝統的な ELISA 戦略を通じて前立腺特異抗原 (PSA) の検出後、 12と塩化金酸。二次カタラーゼ変更抗体 (陽性) の存在は、過酸化水素、塩化金酸還元を減速し、赤い色を持つ準球状単分散金ナノ粒子を降伏の消費を促進します。カタラーゼ変更抗体 (陰性) の不在がままに言うと、このように急速な塩化金削減の推進と不明確な形態青/紫の色を担当した金ナノ粒子を生成する過酸化水素濃度を許可.過酸化水素とカタラーゼ活性の活動によって決定の濃度は、興味の analyte の濃度と相関すること示されました。カタラーゼ変更の二次抗体と触媒活性の状態のコントロールの必要性は、この法の普遍性を妨げる 2 つの要因です。また、既存の結果の独立した金クラスターの形成される増幅戦略にバック グラウンド ノイズの問題があります。
上記のテクニックもいくつかの他として13,14,15, が可能従来手法と同等の検出限界を達成するためにバイオ センサーのナノプローブ ベースの。
ここでは、新規ゴールド強化メソッドは、示されて増強または表面プラズモン共鳴信号を導入することによって既存のナノプローブの信号を増幅する場所。検出は、金、銀、シリカ、酸化鉄ナノ粒子使用で実施されて、センサー 2-(N Morpholino) で塩化金酸と過酸化水素水との混合物の溶液とインキュベートする許可されます ethanesulfonic 酸 (MES) pH 6 バッファー。Au0既存ナノプローブの表面に蒸着を支持する強化ソリューションのコンポーネントの濃度を最適化しました。すべてナノプローブのタイプ、すなわちを研究しました。金ナノ粒子、銀ナノ粒子 (AgNPs)、シリカ (SiNPs)、IONPs、不明確な層の形成をもたらした検出または高められた可視信号につながった光の散乱を補強したり。100 増幅信号増加を実現した紙とガラス ベースのマイクロ アレイでナノプローブ、加工 5 分以内信号を集録します。肉眼によって信号集録を行うことができる紫外可視分光法やイメージング卓上スキャナーやデジタル カメラなどのローエンドのツール。また、特定の最適化を必要とせず、市販のアレルギー診断アッセイではこの拡張プロトコルに容易に適用できることを実証しました。

<table><tbody><tr><td>クロロオーリン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>254169 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641 SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルアミノボラン&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>476668 アルドリッチ</td><td></td></tr><tr><td>ポリ(アクリル酸・ナトリウム塩)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>416037 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>硝酸銀</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>204390 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>100 nm 磁性ナノ粒子</td><td>Ademtech</td><td>021111</td><td></td></tr><tr><td>50 nm シリカナノ粒子</td><td>Corposcular</td><td>140510-10</td><td></td></tr><tr><td>COOH-PEG-SH&nbsp;</td><td>RAPP</td><td>ポリマー135000-4-32</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.06462&nbsp;EMDミリポア</td><td></td></tr><tr><td>N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03449&nbsp;SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>N-ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>56485&nbsp;ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>過酸化水素溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95313 SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250 SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>IgG 抗体</td><td>アブカム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>342483&nbsp;ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653&nbsp;SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>VWR&nbsp;</td><td>422351S</td><td></td></tr><tr><td>プロテイン G</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>21193</td><td></td></tr><tr><td>ニトロセルロース紙膜</td><td>Whatman</td><td>10402096</td><td></td></tr><tr><td>ナノプロッター 2.1 ロボットプリンター</td><td>GeSIM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フィルターホルダー</td><td>メルク</td><td>XX3001200</td><td></td></tr><tr><td>PhD2000 ウルトラシリングポンプ</td><td>ハーバード大学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フラットベッドスキャナー キャノンスキャン9000F Mark II</td><td>Cannon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>対ヒトIgE抗体修飾AuNP&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>レーザースキャン LuxScan 10/K</td><td>Capital Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>卓上型スキャナー イメージスキャナー エプソン Expression 1600 pro</td><td>エプソン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラススライド ImmunoCAP ISAC sIgE 112</td><td>サーモフィッシャー</td><td>81-1011-01</td><td></td></tr><tr><td>蛍光標識抗ヒトIgE抗体&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>81-1011-01</td><td></td></tr><tr><td>Phadia マイクロアレイ画像分析装置 MIA 1.2.4&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

原金ナノ粒子合成による急速なナノプローブ信号強調

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

金、銀、シリカや酸化鉄ナノ生物分析アッセイの検出試薬としてなどナノプローブの使用は、高い感度と便利な比色読み出しに有効にできます。しかし、ナノ粒子の高密度は通常検出に必要です。利用可能な合成による強化プロトコルいずれかの金や銀に限定ナノ粒子または正確に酵素制御と最適化に依存します。ここでは、金、銀、シリカ、酸化鉄ナノプローブの比色定量の読み出しを強化するプロトコルを提案する.10000-fold 因子までで比色信号が図れますが観察されました。このような信号の強化戦略の基礎は、Au3 + Au0の化学的還元です。Au3 + Au0の削減を有効にするいくつかの化学反応があります。プロトコルでは、良いのバッファーと H2O2が使用され、Au0新しい金ナノ粒子の形成の犠牲で、既存のナノプローブの表面に蒸着を支持することが可能です。塩化金酸と 2-(N morpholino) H2O2から成るソリューションとプロトコルの構成は、マイクロ アレイのインキュベーションの ethanesulfonic 酸 pH 6 バッファー ナノプローブによる検出アッセイ。強化ソリューションは、紙、ガラス センサーに適用できます。さらに、メソッドの商業アレルゲン マイクロ アレイへの応用によって示されるように市販のイムノアッセイにおける使用することができます。信号開発強化ソリューションと孵化の 5 分未満を必要とし、読み出しは肉眼または卓上スキャナーやデジタル カメラなどのローエンドの画像集録デバイスによって評価されることができます。

アッセイを用いて、ナノプローブ検出エージェントとしてセンサー検知エリアがナノプローブ (図 1、) に設定されます。ナノプローブの数が視覚的検出限界以下の場合、試料の検出、当初、みなされます負。ここで示される (図 1b) プロトコルを使用して、Au (図 1c) の不明確な層を導入することにより、ナノプローブの信号を増強します。
蛋白質 G の検出用に設計された紙ベースの免疫強化プロトコル (図 2) の有効性をショーケースとして実施されました。金ナノ粒子、AgNPs、SiNPs、および IONPs が IgG 抗体を変更され、使用および検出エージェント。スポットあたり蛋白質のグラム分子数のグラデーションについて紙のマイクロ アレイを作製した.
それが観測されたアッセイを行った後変更された金ナノ粒子 (IgG,) (図 2、) あたり 2 × 105分子として低を検出することができた igg 抗体、IgG が変更された AgNPs (IgG AgNPs) 2 × 104として低を検出することができたスポット (図 2c) あたり分子 IgG の変更 IONPs (IgG IONPs) あたり 2 × 107分子 (図 2e) を発見し、IgG の変更のような低 SiNPs (IgG SiNPs) は視覚信号 (を提供することができませんでしたを検出することができた図 2g)。
強化ソリューションとマイクロ アレイをインキュベートし 100 倍によって信号を増やすことは可能だったあらゆるタイプのナノ粒子を使用します。SiNPs の場合強化ソリューションが可能ない視覚信号強化ソリューションせず観察された信号を観察する (図 2b、2 d、2 階と 2 h)。
メソッドの既存の商業イムノアッセイへの応用の可能性を評価しました。強化は、ガラスを用いたアレルゲン成分マイクロ アレイ イムノアッセイにおける実施されました。4 のセットが検証され、特徴付けられる血清アレルギー患者から試料をマイクロ アレイを評価し (サンプル指定 a、b、c および d)。この試金の標準的な蛍光検出信号 (図 3) の強化が続く金ナノ粒子を標識抗 ige 抗体で染色に比べていた。強化前、どこ検出を実施した金ナノ粒子を標識抗 ige 抗体のマイクロ アレイのスポットが検出されたないです。強化後いくつかのスポットは肉眼によって目に見える、その強度は、画像デジタル化 (図 3) によって登録されていた。蛍光検出、さまざまなスポットが検出された (図 3)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57297/57297fig1.jpg"> 図 1.手順のイラスト、microspot は、高度な信号に検体検出から受けます。microspot、強化プロトコル、マイクロ アレイの (b) 及び抗体変更ナノプローブの (その後の種子成長に固定化した検体の検出後 (、) 抗体変更 2 ナノプローブc) microspot、ナノプローブのサイズが 5 分強化ソリューションをインキュベート後増加しました。この図は、Diasらから dapted をされています。20<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57297/57297fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57297/57297fig2.jpg"> 図 2.G. タンパク質の検出のためのマイクロ アレイのディジタル画像各マイクロ アレイの左側 (、) IgG-AgNPs、(e) (c) IgG によって金ナノ粒子と遂行検出の向上の前に観察されたマイクロ スポットには IgG IONPs と IgG SiNPs (g)。各マイクロ アレイの右上の (b) (d) (f)、IgG AgNPS IgG によって金ナノ粒子強化後、マイクロ スポットは、IgG IONPs および IgG SiNPs (h)。蛋白質 G の各濃度は、3 通マイクロ アレイ上に形成されました。蛋白質 G の行われていたタンパク質の濃度に基づく数の計算は、各 microspot で印刷されます。この図は、Diasらから適応されています。20<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57297/57297fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57297/57297fig3.jpg"> 図 3.蛍光強度と、アッセイ用で得られる色の輝度相関が商業アレルギー診断アッセイを実施します。蛍光強度 (MFI) とは、比強度 (MCI) a、b、サンプルにおけるアレルゲンの検出の測定を意味する c、および d. インセット ログ 10 変換データを、両方の方法の線形相関が観察された間隔で。蛍光修飾抗体 (Fluorophore Ab) に基づく検出の観察マイクロ スポットの強度は蛍光性の放出です。マイクロ アレイのデジタル化と画像処理ソフトウェアで画像を反転後 Ab, 分析に基づく検出の観察マイクロ スポットの明るさが得られました。マイクロ アレイは、一番右下の蛍光検出のポジティブ コントロールと垂直トリプリケートについて設計されています。他の 3 つのコーナーは、ソフトウェアの評価に使用されます。画像は、16 ビット グレースケールで分析しました。この図は、Diasらから適応されています。20<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57297/57297fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>R2事前強化</td>
			<td>強化後の R2</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG によって金ナノ粒子</td>
			<td>8.70E-01</td>
			<td>7.80E-01</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG AgNPs</td>
			<td>9.10E-01</td>
			<td>9.60E-01</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG IONPs</td>
			<td>9.17E-01</td>
			<td>9.30E-01</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG SiNPs</td>
			<td>-</td>
			<td>8.50E-01</td>
		</tr>
</tbody></table>テーブル 1。R2 検出蛋白質 G、事前とナノ粒子の異なるセットを使用しての強化後の値。R2値は、試料の濃度とスポットの強度の相関を測定後に得られました。

この作業でナノプローブによるバイオセンシングの信号強調のためのプロトコルを提案する.プロトコルは、金、銀、シリカ、酸化鉄ナノ粒子で構成される既存のナノプローブの表面に塩化金酸の減少に基づいています。

The use of nanoprobes such as gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles as detection reagents in bioanalytical assays can enable high sensitivity ...

この手順の全体的な目標は、紙またはガラスの担体で実施されるアッセイでナノ粒子ベースのプローブのシグナルを増幅することです。この方法を使用すると、わずか10個のナノ粒子を含むスポットの比色信号を取得できます。この手法の主な利点は、その汎用性です。紙、ガラス、および場合によっては他の支持体上のさまざまなナノ粒子に大きな変更を加えることなく適用できます。手順を開始するには、脱イオン水に少なくとも10ミリリットルの10ミリリットルのMES溶液を準備します。4モルの水酸化ナトリウム溶液で溶液のpHを6に調整します。次に、40ナノメートルの金ナノ粒子の1.2倍10〜マイナス9モル懸濁液の1ミリリットルを1ミリグラムのアルファメルカプトオメガカルボキシPEGと組み合わせ、混合物をボルテックスします。混合物のpHを4モルの水酸化ナトリウム溶液で12に調整します。混合物を室温で一晩静かに攪拌します。次に、混合物を3,800倍Gで15分間遠心分離し、上清を捨てます。PEG修飾金ナノ粒子のペレットを500マイクロリットルの脱イオン水に再懸濁します。次に、5マイクロモルのEDCを250マイクロリットルのpH 10ミリモル6 MESバッファーに溶解します。7.5マイクロモルのスルホNHSを別の250マイクロリットルのMESバッファーに溶解します。これらの溶液をPEG修飾金ナノ粒子と組み合わせ、摂氏37度で30分間インキュベートします。混合物を5分間遠心分離し、上清を捨てます。ペレットを500マイクロリットルのMESバッファーに再懸濁します。懸濁液に十分な量のIgG抗体を添加し、抗体濃度が100ピコグラム/ミリリットルになるようにします。混合物を摂氏37度で2時間インキュベートします。混合物を10分間遠心分離し、上清を取り除きます。ペレットを500マイクロリットルのMESバッファーに再懸濁し、遠心分離を繰り返します。次に、ペレットを500マイクロリットルのpH 7.5バッファー(10ミリモルリン酸ナトリウムと0.3モル塩化ナトリウム)に脱イオン水に再懸濁します。混合物を摂氏37度で30分間インキュベートします。前述のように、混合物を10分間2回遠心分離します。ペレットを10ミリモルpH 6 MES緩衝液中の500マイクロリットルの1%BSAに再懸濁し、混合物を摂氏4度で一晩インキュベートします。混合物を10分間2回遠心分離します。最後に、ペレットを500マイクロリットルのMESバッファーに再懸濁して、IgG修飾金ナノ粒子を得る。ロボットプリンターを使用して、タンパク質G濃度勾配のマイクロアレイをニトロセルロース膜上に堆積させます。次に、マイクロアレイを適切なサイズのステンレス製フィルターホルダーにロードします。IgG修飾金ナノ粒子の8ピコモル懸濁液を含むシリンジをフィルターホルダーの入口に接続します。シリンジをシリンジポンプに取り付けます。フィルターホルダーからの出口の流れを収集するために50ミリリットルのチューブをセットアップします。次に、懸濁液をフィルターホルダーに1分あたり1ミリリットルで流します。その後、マイクロアレイを室温で30分間乾燥させます。フィルターホルダーを水と濾紙で清掃し、乾かします。フラットベッドスキャナでドライマイクロアレイを4, 800 DPIでスキャンし、画像を24ビットカラーTIFFファイルとして保存します。次に、5ミリモルのクロロアウリン酸溶液と1.027モルの過酸化水素溶液の両方を、pH 10ミリモルの6 MESバッファーで調製します。強化溶液をプレミックスするには、クロロアウリン酸溶液と過酸化水素溶液を等量ずつ微量遠心チューブに入れ、溶液を完全に混合します。予め混合した強化溶液をマイクロアレイセンサー表面に塗布します。または、同量のクロロオーリン酸溶液と過酸化水素溶液をセンサーの表面に塗布し、センサー上で直接完全に混合します。センサーをエンハンスメント溶液で最大5分間インキュベートし、その後、マイクロアレイを脱イオン水に5秒間沈めてエンハンスメント溶液を洗い流します。マイクロアレイを室温で風乾させます。強化する各マイクロアレイについて、このプロセスを繰り返します。強化されたマイクロアレイをスキャンし、画像を保存します。標準的な紙ベースのイムノアッセイでは、IgG修飾金、銀、および酸化鉄ナノ粒子は、スポットあたりそれぞれ10倍から5分の2倍、10倍から4倍、および10倍から7分子の2倍でタンパク質G濃度を検出しました。IgG修飾シリコンナノ粒子からの視覚信号は観察されませんでした。マイクロアレイを増強溶液中でインキュベートすると、金、銀、酸化鉄のナノ粒子全体でシグナルが100倍に増加しました。シリコンナノ粒子の場合、この増強により、視覚信号を観察することができました。この増強は、4つのヒト血清サンプルの市販のガラスベースのアレルゲン成分マイクロアレイ免疫測定法に適用されました。抗IgE標識金ナノ粒子による染色とシグナルの増強は、標準的な蛍光アッセイと同等の結果をもたらしました。平均蛍光強度と平均比色強度の間の平均線形相関は0.79でした。このテクニックは、一度習得すれば、正しく行えば10分以内に行うことができます。

rapid-nanoprobe-signal-enhancement-situ-gold-nanoparticle

Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

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学ぶナノプローブの信号増強法。塩化金酸還元により金・銀・酸化鉄ナノ粒子で100倍の信号増幅を達成し、紙やガラス基板上のバイオセンシング感度を飛躍的に向上させる革新的手法です。

原金ナノ粒子合成による急速なナノプローブ信号強調

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