Name: 発注済み、緑膿菌ひずみ PA14 トランスポゾン挿入変異体の非冗長ライブラリのレプリケーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: 学ぶ緑膿菌PA14トランスポゾン挿入変異体ライブラリの複製法。無菌操作と品質管理を徹底し、ライブラリの完全性を保持しながら高品質なコピーを生成する詳細なプロトコルを解説します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

データベース検索で彼女の指導の MGH トレッドウェル仮想ライブラリのリサ Philpotts に感謝したいと思います。この仕事に支えられた嚢胞性線維症財団 (YONKER16G0 および HURLEY16G0) および NIH の NIAID (BPH と ADE: R01 A1095338)。

金融利害の衝突を報告しません。Eliana Drenkard とフレデリック Ausubel は、PA14 非冗長トランスポゾン変異ライブラリーの作成に参加しました。ブライアン ハーリーと Lael Yonker 現在家、マサチューセッツ総合病院で小児科学の一部として変異ライブラリーを配布します。

P。緑膿菌PA14NR 科学のコミュニティのための貴重なリソースです。Clarivate 分析指標データベース、Liberatiらから 2017 年 3 月のデータセットによると(2006 年)37、PA14NR セットの構造を記述するは、微生物学の出版物の上位 1% にランクされています。Google Scholar は Liberatiらの以上 600 の引用を報告します。2017 年 8 月現在 (2006 年) の元の原稿。ライブラリは、膿の病態メカニズムの解明に重要な役割を果たしました。重要なは、PA14NR 設定の 96 ウェル プレート形式は、 Pの様々 な研究に必要な高スループット遺伝的画面を促進します。緑膿菌変異表現型44,45,46。PA14NR 設定は配布可能...

緑膿菌は、多様な表現型と際と適応性グラム陰性菌で土壌、水、最も人間環境と皮膚の細菌叢に存在です。膿は、5.5-7 Mbp 高 G + c コンテンツ (65 〜 67%) の比較的大規模なゲノム多くの菌種に比べると。さらに、その遺伝子の大部分は代謝適応性に関与しているし、環境ストレス1への応答に大きな柔軟性を可能にする規制のネットワークの一部であります。膿病原因子の茄多を表現、フォーム バイオ フィルムに性癖を展示、複数クオラムセンシングで経路を介して応答を調整する能力を持って、抗生物質耐性を開発する顕著な容量が表示されます。許容値2,3,4,5,6,7,8。これらの属性は、膿によって引き起こされる感染症を治療するための重要な課題を提示します。
慢性的な膿菌感染は多くの病気の状態で発生することが。嚢胞性線維症 (CF)、嚢胞性線維症膜コンダクタンス レギュレータ (CFTR)遺伝子の変異によって引き起こされる遺伝病の結果、気道内で濃縮、感染した分泌物進歩的な気管支拡張症と、最終的には、死呼吸不全9。成人では、CF の患者の大半慢性膿、罹患率と死亡率のこの疾患10に関連付けられている重要な役割を果たしていると感染しています。さらに、重症熱傷の傷害11、気管切開12、関節置換術13、または留置カテーテル14患者フォームする細菌の能力に関連するp. 緑膿菌感染のリスクがバイオ フィルムとエスケープ ホスト炎症反応15。多抗生物質耐性や寛容の人口は広域スペクトル、連続的抗菌薬治療12,16,17によって選択後に、植民地化の競争がなければを発生するさらに、,18.膿の病態の理解を深めるお越しの数多くの病気の状態に大きな影響を与えます。
PAO1、PA103、PA14、朴セリは、系統を含む、 P. 緑膿菌臨床分離株が盛ん膿病因のさまざまな機能を調査します。ひずみ PA14 は臨床分離株はない広範囲継研究室で最も一般的なクローンのグループ世界19,20の 1 つに属しています。PA14is 顕著なエンドトキシンによる感染症の脊椎動物モデルにおける高度病原性プロファイル21、線毛構造22、病原性島23、タイプ III の分泌システム (TTSS)、哺乳類への毒性細胞24と抗生物質抵抗性と永続性25のプロファイル。さらに、PA14 はまた多数の宿主-病原体モデル システムにおける高度病原性植物葉を含む浸潤モデル26,27,線虫感染モデル28, 29昆虫モデル30,31, と同様にマウス肺炎モデル32,33皮の焼跡モデル34。
ゲノム変異ライブラリ不要な遺伝子ゲノム規模での遺伝子機能の分析により有機体の生物学を理解するための非常に強力なツールを構成する同質遺伝子変異体のコレクションです。膿に建設された 2 つの飽和近くトランスポゾン挿入変異ライブラリは現在配布です。トランスポゾンの挿入サイトは、両方のライブラリの決定されています。これらのいわゆる非冗長ライブラリ時間がかなり短縮されて細菌菌株のゲノム研究を容易にし、コストに関わるスクリーニング, ランダムなトランスポゾン変異体。膿の PAO1 トランスポゾン変異ライブラリー、MPAO1 に建設された分離はトランスポゾンを用いた歪み PAO1phoA/ほら、lacZ/ほら35がワシントン大学の Manoil 研究室によってキュレーションです。ライブラリのコレクションで構成、シーケンス確認 9,437 トランスポゾン変異体のゲノム広いカバレッジを提供し、ほとんどの遺伝子36の 2 つの突然変異体が含まれています。膿PAO1 トランスポゾン変異ライブラリーに関する情報が http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm で公共のインターネットにアクセスできる Manoil ラボのウェブサイトでご利用いただけます。膿ひずみ PA14 非冗長トランスポゾン挿入変異ライブラリー (PA14NR セット) トランスポゾンMAR2xT7テネシー州phoAを用いた歪み PA1437に建設された現在の配布は小児科学マサチューセッツ総合病院。PA14NR 設定には、不要な遺伝子37単一トランスポゾン挿入 5,800 以上の突然変異体のコレクションが装備されています。PA14NR 設定の構成の詳細については、PA14NR の使用を促進するオンライン検索ツールのさまざまなを含む公共のインターネットからアクセスできるサイト http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB のとおり設定します。
オリジナル PA14NR セット約 34,000 ランダム トランスポゾン挿入変異体の 4,596 予測 PA14 遺伝子すべて予測 PA14 遺伝子37の 77% を表すに対応する包括的なライブラリから選択された 5,459 変異株で構成されます。新しい突然変異体が追加された 2006 年に図書館の建設以来、現在約 4,600 PA14 遺伝子を表す 5,800 以上の変異体38含まれている PA14NR の設定。PA14 トランスポゾン変異体の大半は、野生型背景37に生成されました。遺伝的背景など、変異ライブラリーの各メンバーに関する詳細については、オンライン データベースを検索または非冗長ライブラリ スプレッドシート PA14 ウェブサイト (http:// で利用できる両方の機能をダウンロードすることによりpa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi)。突然変異体の大部分は、MAR2xT7 を使用して作成された (MrT7) トランスポゾンが TnPhoA (phoA) トランスポゾン37を使用して作成された小さなセット。各トランスポゾンが抗生物質耐性カセット、ゲンタマイシン (MrT7) またはカナマイシン (phoA) を使用して突然変異体の選択を可能にします。突然変異体の PA14NR セット 63-96-ウェル プレートに格納され、2 つの追加の 96 ウェル制御プレート、野生型 PA14 から成っている接種が含まれています、プリセット パターンに挟在非接種の井戸。オンライン検索ツールとペアに大きく 96 ウェル プレート形式は、スクリーニング アッセイ突然変異体の表現型に関わる遺伝子を簡単に識別できるのカスタム開発を促進します。オンライン検索ツールには、検索してさらに研究に必要な追加の関連する変異体の選択も容易します。
PA14 と PAO1 トランスポゾン変異ライブラリは科学的なコミュニティのための非常に重要なグローバル リソースであり、彼らは未知の遺伝子の機能とこの細菌の病原体の経路を検証する際にお互いを補完します。偶然にも、PAO1 と PA14 トランスポゾン変異ライブラリの構築、以来多くの緑膿菌の全ゲノム DNA シーケンス解析を示している PAO1 と PA14 P. aeruginosa の別の主要なサブクレードに属しています。系統7,39,40,41。臨床緑膿菌株が発見されてサブグループ系統、PAO1 と PA14 異なる膿に属している事実全体に分散比較 2 トランスポゾン変異ライブラリーの価値の向上研究。
文書構造を記述して膿ライブラリ35,を含む細菌の突然変異体ライブラリのスクリーニング3742,,、文献で容易に利用できます。しかし、我々 の知識の限りで公開プロトコルの詳細な手順と、レプリケーションに使用される技術を記述する保守、および細菌変異ライブラリの検証がありません。
この文書に記載されている方法では、使用を容易にする 3 つのプロトコルのセットと PA14NR セットのメンテナンスについて説明します。最初のプロトコルでは、PA14NR 設定の受信者にお勧めのライブラリのレプリケーションについて説明します。2 番目のプロトコルには、ストリー キング、成長、および PA14NR のセットを使用して識別される個々 の変異体を格納するためのガイドラインが含まれています。3 番目のプロトコルでは、トランスポゾン変異体からの断片の PCR の拡大や突然変異体の身元を確認するそれに続くシーケンスなど、品質管理手法について説明します。この一連のプロトコルは、レプリケーションおよび他の細菌の突然変異体のライブラリやコレクションの維持の適応もあります。細菌変異ライブラリやコレクションのレプリケーションは「マスター コピー」の整合性を維持するために非常にお勧め (原本を受け取った)。ルーチン検査用 PA14NR セットの複数のコピーのレプリケーションでは、マスター コピーの間の汚染の可能性を最小限に抑えます。

<table><tbody><tr><td>Materials for Library Replication</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile 96-well Tissue-culture treated, case of 50</td><td>Corning Life Sciences</td><td>353072</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Sterile 96 well Clear V-Bottom 2000&mu;L ディープウェルプレート、25</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3960</td><td>のケース via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Nunc OmniTray (長方形プレート)、60</td><td>Thermo Scientific Rochester</td><td>242811</td><td>のケース via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Rectangular Ice Pan、Midi (4L)</td><td>Corning Life Sciences</td><td>432104</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Secure-Gard Cone Mask、300</td><td>Cardinal Health</td><td>AT7509</td> のケース via <td>FisherScientific</td></tr><tr><td>AluminaSeal、</td><td>Fisher Scientific</td>Breathe-Easyメンブレン経由の100 <td>Diversified Biotech</td><td>ALUM-100</td></tr>の<tr>パック、<td>Sigma-Aldrich</td>Sterile経由の<td>100</td><td>Diversified Biotech</td><td>BEM-1</td>のパック</tr><tr><td>、個別包装、50mL溶液トラフ/試薬リザーバー、Westnet</td><td>Incorporated</td>PlateローラーVWR 60941-118経由の100 <td>Sorenson</td><td>S50100</td>のケース</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>via VWR</td></tr><tr><td>Cryo Laser Labels - CRYOLAZRTAG 2.64" x 0.277", pack of 16 sheets</td> GA <td>International</td><td>RCL-11T1-WH</td><td>via Labtag.com (印刷用テンプレートは Labtag.com)</td></tr><tr><td>96-well replicator</td><td>V &Pサイエンティフィック株式会社</td><td>カスタム407C、ピン径3.18mm、V&経由の長さ57mm</td><td>Pサイエンティフィック株式会社</td></tr><tr><td>Multitron Pro、3mm振盪インキュベーターInfors</td><td>HT</td><td>l10003P</td><td>経由Infors HT</td></tr><tr><td>Picus 12チャンネル50-1200&mu;L 電子ピペット</td><td>ザルトリウス</td><td>735491PR</td><td>via ザルトリウス</td></tr><tr><td>フィルターチップ 50-1200&mu;L、960</td><td>Biohit</td><td>14-559-512</td> のパック <td>via Fisher Scientific; use electronic multichannel-compatible tips ドライ</td></tr><tr><td>アイス</td><td>個々の</td>変異体保管用材料<td></td><td></td></tr><tr><td>Materials for Individual Mutant Storage</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-130</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>ピペット(P1000、P20、P20、P2)</td><td>Gilson</td><td>F167370</td><td>via Gilson</td></tr><tr><td>Materials for Quality Control PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-130</td><td>via Fisher</td></tr><tr><td>Scientific NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>via ThermoFisher</td></tr><tr><td>PCR Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ドーム型蓋付きOmnistrips PCRチューブ</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0404</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>ART バリアローリテンションピペットチップ(10 uL、100 uL、1000 uL)</td><td>Molecular BioProducts, Inc.</td><td>Z676543 (10 uL)、Z676713 (100 uL)、Z676802 (1000 uL)</td><td>via Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Pipettes (P1000, P200, P2, P2)</td><td>Gilson</td><td>F167370</td><td>via Gilson</td></tr><tr><td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-130</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>MasterPure DNA Purification Kit</td><td>Epicentre</td><td>MCD85201</td><td>via Epicentre Technologies Corp</td></tr><tr><td>.GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder、ThermoFisher</td><td></td><td></td>RediLoad ローディングバッファー Invitrogen <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>750026</td><td>Cer</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemicals for Library and Individual Mutant Storage</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol MB Grade、1L</td><td>Sigma Aldrich 経由、Ready-to-use ThermoScientific SM1333</td><td>G5516</td><td>via Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>LB Broth</td><td></td><td></td><td>Per 1L dH2O: 10g トリプトン、5g 酵母抽出物、5g NaCl、1ml 1N NaOH (分子生物学における現在のプロトコル。Wiley, 1994.)</td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7293</td><td>via Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y1625</td><td>via Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>via Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8045</td><td>via Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>LB&nbsp; 寒天</td><td></td><td></td><td>上記の準備を参照し、15gのバクト寒天を追加</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5306</td><td>via Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Gentamicin sulfate, 10g</td><td>BioReagent</td><td>1405-41-0</td><td>via Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Gibco</td><td>11815024</td><td>via ThermoFisher</td></tr><tr><td>Ethanol, 190 proof</td><td>Decon</td><td>04-355-221</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Chemicals for Quality Control PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>プライマー</td><td>ユーザー優先ベンダー</td><td></td><td>表3にリストされているプライマーを参照</td></tr> Corning Fisher <tr><td>Scientific Taq ポリメラーゼバッファー</td>経由の <td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>46000CV</td><td>ThermoFisher</td></tr><tr><td>Taq DNAポリメラーゼ経由の</td>Invitrogen 10342020、組換え <td>Invitrogen</td><td>10342020</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich 経由</td>の ThermoFisher<td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td></tr> <tr><td>経由</td>の ThermoFisher<td>dNTPs</td><td>Invitrogen</td><td>10297018</td></tr></tbody></table>

発注済み、緑膿菌ひずみ pa14 トランスポゾン挿入変異体の非冗長ライブラリのレプリケーション

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

緑膿菌は、人間環境のユビキタス多様な表現型と際と適応性グラム陰性菌です。膿はバイオ フィルムを形成、抗生物質耐性、病原性因子を生成、慢性感染の過程で急速に進化することができます。したがって膿が両方急性と慢性、感染症を治療することは困難特定の患者集団で重大な合併症の結果として行われます。膿株 PA14 はさまざまな PA14 この病原体を研究するための魅力的なひずみを作る哺乳類と nonvertebrate のホストに感染する保存されたゲノム構造をもつ人間の臨床分離株です。2006 年、4,596 予測 PA14 遺伝子に対応する 5,459 変異体を含む非冗長トランスポゾン挿入変異ライブラリが生成されました。それ以来、PA14 ライブラリの配布は、個々 の遺伝子の機能と緑膿菌の複雑な経路を理解する研究コミュニティを許可しています。レプリケーション プロセスによるライブラリの完全性の維持には、適切な処理と正確な技術が必要です。そのために、この原稿はライブラリのレプリケーション、ライブラリの品質管理および個々 の突然変異体の適切なストレージに関連する手順の詳細を記述するプロトコルを示します。

PA14NR セットの 12 の新しいコピーは、生成される新しいコピーの品質管理評価・議定書 III を使用して実施されたプロトコルを使用してレプリケートされていました。
PA14NR セット野生型 PA14 から成っている制御板と共にミュータント プレート接種し接種コントロール プリセット パターン (図 4 a) に挟在する井戸、レプリケートされたプレートが含まれて次のプロトコル I. コントロールで説明されている方法プレート複製を実行するときに可能な間の汚染を評価する PA14NR セット。さらに、制御板は、トランスポゾン挿入変異体を含んでいる版をアクセスする前にレプリケーション技術を練習に使用できます。制御板の成長は、LB 寒天培地プレートと予想される成長パターン (図 4 b) の存在を確実に一晩インキュベート レプリケーシ...

緑膿菌感染症は、脆弱なホストで重大な合併症を引き起こします。膿ひずみ PA14、PA14NR を設定すると、指定の非冗長トランスポゾン挿入変異ライブラリー多数プロセスの遺伝子機能の解析が容易になります。ここに提示 PA14NR セット変異ライブラリーの高品質のコピーを生成するためのプロトコルです。

発注済み、緑膿菌ひずみ PA14 トランスポゾン挿入変異体の非冗長ライブラリのレプリケーション

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

このプロトコルの全体的な目標は、PA14NRセットと呼ばれる緑膿菌PA14株の秩序ある非冗長トランスポゾン変異体ライブラリの高品質コピーを生成することです。このプロトコルは、レプリケーション中にPA14NRセットの整合性を保持し、このライブラリの高品質コピーを生成します。このプロトコルの主な利点は、ライブラリの複製、品質管理、および個々の変異体の適切な保存に関連するすべてのステップの詳細な説明を提供することです。このプロトコールはP14NRセットを複製するように設計されていますが、他の細菌ライブラリーの複製にも適合させることができます。一般に、この方法に不慣れな個人は、複製プロセス中に汚染のリスクがあるため、苦労します。したがって、このプロトコルでは、そのリスクを軽減するための詳細なステップバイステップの指示を提供します。当研究室では、PA14NRセットを世界の科学コミュニティに配布しています。また、ライブラリはエンドユーザーが複製することをお勧めします。ガイダンスを提供するために、ライブラリの高品質なコピーを生成する方法を詳しく説明したプロトコルを提供しています。このプロトコルの視覚的なデモンストレーションは、特にクロスコンタミネーションを防ぐために設計された手順にとって重要です。自己防衛のため、また細菌培養物の保護のため、緑膿菌P株PA14の非冗長トランスポゾン挿入変異体ライブラリーを取り扱う際には、白衣、手袋、マスクを常に着用してください。約60ミリリットルの溶融LB寒天を長方形のプレートに注いで、LB寒天プレートを準備します。プレートを滅菌フードで約1時間乾燥させてから使用してください。エタノールで拭いたベンチトップにブンゼンバーナーを使用して無菌フィールドを作成します。また、リプリケーターピンの滅菌に適した溶液が入った容器を設置します。マイナス80°Cの冷凍庫からPA14NRセットマスタープレートを取り出し、4リットルのアイスパンのドライアイスの上に置きます。ドライアイスから複製する96ウェルマスタープレートをベンチに置いて、短時間解凍します。マスタープレートと寒天プレートを左上隅にある両方のプレートのA1座標に合わせます。長方形の寒天プレート上のA1座標の位置をマークします。リプリケータピンを滅菌するには、ピンを0.3〜0.5%次亜塩素酸ナトリウムの250ミリリットルに30秒間浸します。リプリケーターを軽くたたいて余分な液体を取り除き、ピンを250ミリリットルの滅菌超純水に10秒間浸し、続いて250ミリリットルの70%エタノールに30秒間、250ミリリットルの95%エタノールを2分間浸します。レプリケーターをブンゼンバーナーの炎に対して垂直に保持し、エタノールが発火するまでゆっくりと炎に近づき、すぐに炎から引き抜くことにより、レプリケーターピンを炎滅菌します。すべてのエタノールが燃え尽きると、炎は消えます。滅菌LB寒天培地を含む未使用の長方形プレートにピンを固定して、ピンを30秒間冷却します。リプリケーターピンが冷えている間に、PA14NRセットマスタープレートのアルミニウムシールを手で短時間温めてから、シールがプレートに触れないように慎重に剥がします。ピンセットを使用して、アルミニウムシールの残りをはがします。リプリケーターピンをマスタープレートに挿入し、リプリケーターを4方向すべてにゆっくりと押したり振ったりして、ピンが96ウェルのそれぞれの凍結細菌培養物に接触するようにします。プレートの外縁にあるウェルには、プレートの端にあるウェルの凍結培養物に対してリプリケーターピンを押し付けて、特に注意してください。リプリケーターピンを寒天プレートの表面にそっと置きます。リプリケーターをわずかな円運動で動かして、変異株ごとに約4〜5ミリメートルの多くの芝生を形成します。PA14NRセットマスタープレートを新しい滅菌アルミニウムシールでシールします。プレートローラーを使用して、各ウェルとプレートの端が完全に密閉されていることを確認します。96ウェルマスタープレートをドライアイスに戻します。PA14NRセットを扱った後、70%エタノールですべての作業面を拭き取ってください。複製した寒天プレートを摂氏37度のインキュベーターに移し、一晩インキュベートします。この手順を開始する前に、層流フードに不要な機器がないことを確認し、フードブロワーを最低10分間オンにします。フードの表面とフードに置かれたアイテムを70%エタノールで拭き取ります。50〜1200マイクロリットルの12チャンネル電動ピペットを使用して、12ミリリットルの深さのウェルブロックの各ウェルに、適切な抗生物質を含む525マイクロリットルのLB液体ブロスを充填します。次に、深井戸ブロックを密封してから、層流フードから取り外します。次に、培地を充填したディープウェルブロックをエタノールワイプしたベンチトップに移します。ベンチトップにブンゼンバーナーを設置して無菌フィールドを作成し、リプリケーターピン滅菌のための適切な溶液を含む容器を設置します。前に示したように、リプリケーターピンを各溶液に浸します。リプリケーターピンを火炎滅菌します。次に、LB寒天が入った未使用の長方形プレートにピンをピンで固定して30秒間冷却します。成長した変異株を含む寒天プレートにレプリケーターピンをそっと置き、ピンが寒天プレート上の96個の変異体すべてに接触していることを確認します。次に、LB液体ブロスを含む深いウェルにピンを5〜10秒間沈めます。ピンでウェルの側面に触れないでください。ディープウェルブロックを無菌の通気性シールメンブレンで密封します。プレートローラーを使用して、個々のウェルが適切に密封されていることを確認します。PA14NRセットを扱った後、すべての作業面を70%エタノールで拭き取ってください。接種した液体培養物を、摂氏37度、950rpmの高速シェーカーで15〜16時間増殖させます。まず、層流フードを空け、フードブロワーを最低10分間オンにします。すべてのフード表面とフードに置かれたアイテムを70%エタノールで拭き取ります。96ウェルプレートをラップから取り出します。各プレートのプレートラベルをはがし、宛先プレートのA1からH1ウェルに最も近いプレートの端に沿って配置します。行先プレートのフタを少し持ち上げて、プレートがフタで覆われているときにラベルを表示するためにラベルを下端に置きます。高速シェーカーからディープウェルブロックを取り外し、ブロックを滅菌層流フードに移します。通気性のあるシーリングメンブレンを慎重に取り外し、アルミニウムシールと交換します。深い井戸ブロックを非常に低速でスピンダウンして、結露を収集します。培養物をデスティネーションプレートに移すことは、ウェル間汚染の可能性が最も高いため、無菌性を維持するためのすべての手順に慎重に従うことが重要です。ディープウェルブロックを滅菌フードに戻します。50〜1200マイクロリットルの12チャンネル電動ピペットと滅菌フィルターチップを使用して、525マイクロリットルのグリセロールLB液体ブロスミックスを各ウェルに加えます。電動ピペットで300マイクロリットルを3回上下に優しくピペッティングして混合します。滴りを防ぐために、チップを注入する前に、チップをウェルの側面に触れてください。新しい滅菌フィルターチップでピペットをリロードし、ウェルの次の列にグリセロールLB液体ブロスミックスを充填します。すべてのウェルにグリセロールLB液体ブロスミックスを充填した後、12チャンネルの電動ピペットとフィルター付きチップを使用して、ディープウェルブロックの各列から900マイクロリットルのグリセロール変異体培養ミックスを引き上げ、150マイクロリットルを宛先プレートの対応する列のウェルに分注して、ライブラリプレートの6つのコピーを生成します。滅菌アルミニウムシールを使用して各96ウェルデスティネーションプレートを覆い、プレートローラーを使用してプレートの端とすべてのウェルを完全にシールします。ラベル識別子をアルミシールで覆わないように注意してください。密封されたプレートをフードから取り外し、マイナス80°Cの冷凍庫の平らな平らな面に置きます。ライブラリを扱った後、すべての作業面を70%エタノールで拭き取ってください。このビデオで示したプロトコルを使用して、PA14NRセットの12コピー(PA14を接種したウェルと未接種ウェルをプリセットパターンで挿入したウェルタイプからなるコントロールプレートを含む)を複製しました。コントロールプレートは、LB寒天プレートでの複製後に目視検査を行い、予想される成長パターンの存在を確認しました。PA14NRセットの新しく生成されたコピーの1つから38の変異株をランダムに選択し、任意のプライマーを使用してPCR増幅を行い、トランスポゾン変異体の同一性を確認しました。その後のDNA断片のシーケンシングにより、試験した38の変異体のうち35の変異体の同一性が確認されました。マスターすると、ライブラリ全体のレプリケーションには約80時間かかります。このプロトコルを使用する際には、常に作業エリアの無菌性に注意することが重要です。このビデオを見れば、P14NRセットやその他の細菌ライブラリーの高品質なコピーを生成する方法について十分に理解できるはずです。シュードモナスでの作業は危険である可能性があり、このプロトコルを実行するときは常に個人用保護具を着用する必要があることを忘れないでください。このプロトコルは、緑膿菌PA14非冗長変異体ライブラリーを保存しており、これはハイスループットスクリーニングだけでなく、ほとんどの緑膿菌遺伝子の個々の変異の供給源としても重要なリソースであり続けています。

replication-ordered-nonredundant-library-pseudomonas-aeruginosa

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

出典: Kazi、MI、 他、 ハイスループットシーケンシングのためのグラム陰性菌におけるトランスポゾン挿入ライブラリの生成。 J.ビス。...

ゲノムトランスポゾン挿入によるグラム陰性菌の単離

ここでは、画面に高密度の挿入変異体ライブラリーを生成するためのミニhimar1マリナートランスポゾンによる突然変異誘発を使用して、プロトコルを記述し隔離し、原型緑膿菌 PAO1株における新規アルギン酸レギュレータを識別します。...

アルギン酸塩産生に関連する新規遺伝子の同定<em&gt;緑膿菌</em使用&gt;ミニ<em&gt; himar1</em&gt;マリナートランスポゾンによる突然変異誘発

エンテロバクター属 。 YSUは、グルコース最小塩培地中で成長する。栄養要求株は、ランダムに宿主ゲノムに自身を挿入するトランスポでそれを変換することによって生成される。突然変異体は最小培地への複合培地からレプリカプレーティングによって発見されています。中断された遺伝子は、遺伝子のレスキューおよび配列決定により同定される。...

の世代エンテロバクターエスピー。 YSU要求株にはトランスポゾン突然変異誘発を用いて

ここでは、非コーディング DNA...

新規トランスポゾンを介したアプローチを使用してエシェリヒア属大腸菌DNA 要素の最適な染色体の場所の決定

ここに提示は、大腸菌や赤痢菌細菌の活用を使用して高密度トランスポゾン挿入ライブラリを作成するための簡単な方法です。このプロトコルは、トランスポゾンのランダムなゲノム挿入による細菌のユニークな突然変異体の何千もの何百ものコレクションの作成をできます。...

密なトランスポゾン挿入ライブラリを使用して細菌活用腸内細菌系統など、大腸菌や赤痢菌の作成

ここで高スループット シーケンス ハムスターの挑戦後トランスポゾン...

レプトスピラトランスポゾン挿入変異体中に黄金シリアのハムスター感染の測定フィットネスにハイスループット並列配列

抗生物質耐性の進化でマルチコピー...

抗生物質耐性の進化のマルチコピー プラスミドのロールのテスト

Gram陰性細菌における飽和トランスポゾン変異ライブラリーの生成方法と、その後のDNAアンプリコンライブラリーのハイスループットシーケンシングの調製方法について述べる。一例として、ESKAPE病原体...

高スループットシーケンシングのためのグラム陰性細菌におけるトランスポゾン挿入ライブラリの生成

このプロトコルは、緑膿菌のさまざまなタイプの運動に関与する遺伝的要因を特定するための迅速かつ効率的な方法を提供します。...

緑膿菌における運動表現型を観察するためのハイスループット法

プロトコルは、共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）のために微生物膜を成長し、分析するためのフローセルシステムのアプリケーションを記述する。...

フローセル内の緑膿菌と出芽酵母のバイオフィルム

学ぶ緑膿菌PA14トランスポゾン挿入変異体ライブラリの複製法。無菌操作と品質管理を徹底し、ライブラリの完全性を保持しながら高品質なコピーを生成する詳細なプロトコルを解説します。

発注済み、緑膿菌ひずみ PA14 トランスポゾン挿入変異体の非冗長ライブラリのレプリケーション

さらに動画を探す