発注済み、緑膿菌ひずみ PA14 トランスポゾン挿入変異体の非冗長ライブラリのレプリケーション

このプロトコルの全体的な目標は、PA14NRセットと呼ばれる緑膿菌PA14株の秩序ある非冗長トランスポゾン変異体ライブラリの高品質コピーを生成することです。このプロトコルは、レプリケーション中にPA14NRセットの整合性を保持し、このライブラリの高品質コピーを生成します。このプロトコルの主な利点は、ライブラリの複製、品質管理、および個々の変異体の適切な保存に関連するすべてのステップの詳細な説明を提供することです。

このプロトコールはP14NRセットを複製するように設計されていますが、他の細菌ライブラリーの複製にも適合させることができます。一般に、この方法に不慣れな個人は、複製プロセス中に汚染のリスクがあるため、苦労します。したがって、このプロトコルでは、そのリスクを軽減するための詳細なステップバイステップの指示を提供します。

当研究室では、PA14NRセットを世界の科学コミュニティに配布しています。また、ライブラリはエンドユーザーが複製することをお勧めします。ガイダンスを提供するために、ライブラリの高品質なコピーを生成する方法を詳しく説明したプロトコルを提供しています。

このプロトコルの視覚的なデモンストレーションは、特にクロスコンタミネーションを防ぐために設計された手順にとって重要です。自己防衛のため、また細菌培養物の保護のため、緑膿菌P株PA14の非冗長トランスポゾン挿入変異体ライブラリーを取り扱う際には、白衣、手袋、マスクを常に着用してください。約60ミリリットルの溶融LB寒天を長方形のプレートに注いで、LB寒天プレートを準備します。

プレートを滅菌フードで約1時間乾燥させてから使用してください。エタノールで拭いたベンチトップにブンゼンバーナーを使用して無菌フィールドを作成します。また、リプリケーターピンの滅菌に適した溶液が入った容器を設置します。

マイナス80°Cの冷凍庫からPA14NRセットマスタープレートを取り出し、4リットルのアイスパンのドライアイスの上に置きます。ドライアイスから複製する96ウェルマスタープレートをベンチに置いて、短時間解凍します。マスタープレートと寒天プレートを左上隅にある両方のプレートのA1座標に合わせます。

長方形の寒天プレート上のA1座標の位置をマークします。リプリケータピンを滅菌するには、ピンを0.3〜0.5%次亜塩素酸ナトリウムの250ミリリットルに30秒間浸します。リプリケーターを軽くたたいて余分な液体を取り除き、ピンを250ミリリットルの滅菌超純水に10秒間浸し、続いて250ミリリットルの70%エタノールに30秒間、250ミリリットルの95%エタノールを2分間浸します。

レプリケーターをブンゼンバーナーの炎に対して垂直に保持し、エタノールが発火するまでゆっくりと炎に近づき、すぐに炎から引き抜くことにより、レプリケーターピンを炎滅菌します。すべてのエタノールが燃え尽きると、炎は消えます。滅菌LB寒天培地を含む未使用の長方形プレートにピンを固定して、ピンを30秒間冷却します。

リプリケーターピンが冷えている間に、PA14NRセットマスタープレートのアルミニウムシールを手で短時間温めてから、シールがプレートに触れないように慎重に剥がします。ピンセットを使用して、アルミニウムシールの残りをはがします。リプリケーターピンをマスタープレートに挿入し、リプリケーターを4方向すべてにゆっくりと押したり振ったりして、ピンが96ウェルのそれぞれの凍結細菌培養物に接触するようにします。

プレートの外縁にあるウェルには、プレートの端にあるウェルの凍結培養物に対してリプリケーターピンを押し付けて、特に注意してください。リプリケーターピンを寒天プレートの表面にそっと置きます。リプリケーターをわずかな円運動で動かして、変異株ごとに約4〜5ミリメートルの多くの芝生を形成します。

PA14NRセットマスタープレートを新しい滅菌アルミニウムシールでシールします。プレートローラーを使用して、各ウェルとプレートの端が完全に密閉されていることを確認します。96ウェルマスタープレートをドライアイスに戻します。

PA14NRセットを扱った後、70%エタノールですべての作業面を拭き取ってください。複製した寒天プレートを摂氏37度のインキュベーターに移し、一晩インキュベートします。この手順を開始する前に、層流フードに不要な機器がないことを確認し、フードブロワーを最低10分間オンにします。

フードの表面とフードに置かれたアイテムを70%エタノールで拭き取ります。50〜1200マイクロリットルの12チャンネル電動ピペットを使用して、12ミリリットルの深さのウェルブロックの各ウェルに、適切な抗生物質を含む525マイクロリットルのLB液体ブロスを充填します。次に、深井戸ブロックを密封してから、層流フードから取り外します。

次に、培地を充填したディープウェルブロックをエタノールワイプしたベンチトップに移します。ベンチトップにブンゼンバーナーを設置して無菌フィールドを作成し、リプリケーターピン滅菌のための適切な溶液を含む容器を設置します。前に示したように、リプリケーターピンを各溶液に浸します。

リプリケーターピンを火炎滅菌します。次に、LB寒天が入った未使用の長方形プレートにピンをピンで固定して30秒間冷却します。成長した変異株を含む寒天プレートにレプリケーターピンをそっと置き、ピンが寒天プレート上の96個の変異体すべてに接触

次に、LB液体ブロスを含む深いウェルにピンを5〜10秒間沈めます。ピンでウェルの側面に触れないでください。ディープウェルブロックを無菌の通気性シールメンブレンで密封します。

プレートローラーを使用して、個々のウェルが適切に密封されていることを確認します。PA14NRセットを扱った後、すべての作業面を70%エタノールで拭き取ってください。接種した液体培養物を、摂氏37度、950rpmの高速シェーカーで15〜16時間増殖させます。

まず、層流フードを空け、フードブロワーを最低10分間オンにします。すべてのフード表面とフードに置かれたアイテムを70%エタノールで拭き取ります。96ウェルプレートをラップから取り出します。

各プレートのプレートラベルをはがし、宛先プレートのA1からH1ウェルに最も近いプレートの端に沿って配置します。行先プレートのフタを少し持ち上げて、プレートがフタで覆われているときにラベルを表示するためにラベルを下端に置きます。高速シェーカーからディープウェルブロックを取り外し、ブロックを滅菌層流フードに移します。

通気性のあるシーリングメンブレンを慎重に取り外し、アルミニウムシールと交換します。深い井戸ブロックを非常に低速でスピンダウンして、結露を収集します。培養物をデスティネーションプレートに移すことは、ウェル間汚染の可能性が最も高いため、無菌性を維持するためのすべての手順に慎重に従うことが重要です。

ディープウェルブロックを滅菌フードに戻します。50〜1200マイクロリットルの12チャンネル電動ピペットと滅菌フィルターチップを使用して、525マイクロリットルのグリセロールLB液体ブロスミックスを各ウェルに加えます。電動ピペットで300マイクロリットルを3回上下に優しくピペッティングして混合します。

滴りを防ぐために、チップを注入する前に、チップをウェルの側面に触れてください。新しい滅菌フィルターチップでピペットをリロードし、ウェルの次の列にグリセロールLB液体ブロスミックスを充填します。すべてのウェルにグリセロールLB液体ブロスミックスを充填した後、12チャンネルの電動ピペットとフィルター付きチップを使用して、ディープウェルブロックの各列から900マイクロリットルのグリセロール変異体培養ミックスを引き上げ、150マイクロリットルを宛先プレートの対応する列のウェルに分注して、ライブラリプレートの6つのコピーを生成します。

滅菌アルミニウムシールを使用して各96ウェルデスティネーションプレートを覆い、プレートローラーを使用してプレートの端とすべてのウェルを完全にシールします。ラベル識別子をアルミシールで覆わないように注意してください。密封されたプレートをフードから取り外し、マイナス80°Cの冷凍庫の平らな平らな面に置きます。

ライブラリを扱った後、すべての作業面を70%エタノールで拭き取ってください。このビデオで示したプロトコルを使用して、PA14NRセットの12コピー(PA14を接種したウェルと未接種ウェルをプリセットパターンで挿入したウェルタイプからなるコントロールプレートを含む)を複製しました。コントロールプレートは、LB寒天プレートでの複製後に目視検査を行い、予想される成長パターンの存在を確認しました。

PA14NRセットの新しく生成されたコピーの1つから38の変異株をランダムに選択し、任意のプライマーを使用してPCR増幅を行い、トランスポゾン変異体の同一性を確認しました。その後のDNA断片のシーケンシングにより、試験した38の変異体のうち35の変異体の同一性が確認されました。マスターすると、ライブラリ全体のレプリケーションには約80時間かかります。

このプロトコルを使用する際には、常に作業エリアの無菌性に注意することが重要です。このビデオを見れば、P14NRセットやその他の細菌ライブラリーの高品質なコピーを生成する方法について十分に理解できるはずです。シュードモナスでの作業は危険である可能性があり、このプロトコルを実行するときは常に個人用保護具を着用する必要があることを忘れないでください。

このプロトコルは、緑膿菌PA14非冗長変異体ライブラリーを保存しており、これはハイスループットスクリーニングだけでなく、ほとんどの緑膿菌遺伝子の個々の変異の供給源としても重要なリソースであり続けています。